猜猜谁？：利用标准化可见光技术划分后变形期两栖动物的生活阶段和性别

《Journal of Morphology》：Guess Who: Delineating Post-Metamorphic Amphibian Life Stages and Sexes Using a Standardised Visible Approach

　　**摘要**

在动物中，成年期通常与性成熟同义，其定义常常基于个体储存和/或使用功能性配子的能力。然而，在野外条件下，由于无法轻易确定配子的存在，研究人员依赖其他成熟迹象，如体型和基于性别的特征来区分性别。在本研究中，我们使用了多季节的数据集来帮助定义绿金铃蛙（Randoidea [Litoria] aurea）的成年期，这种方法优于过去仅依赖外部可见特征的方法。我们的决策过程较为细致，因为它同时考虑了可检测到的性别特征的存在和表现程度，特别是婚垫的颜色以及妊娠程度，并利用这些特征的表现来确定每个性别的最低成熟体型阈值。这一方案使得即使体型低于最低阈值，但具有高度性别成熟特征的个体也能被归类为成年个体，从而考虑到了早熟现象；与此同时，那些超过阈值但未表现出相应性特征个体也能被归类为成年个体，这解释了成年期这些特征随时间变化的情况（这些变化可能与激素周期有关）。我们认为，通过调整特征阈值以适应特定物种或种群的需求，这种方法可以应用于其他两栖动物。

**1 引言**

动物经历一系列由研究人员根据形态学、生态学和行为变化定义的生命阶段（Hone等人2016；McEdward和Janies 1993；Smirnov和Vassilieva 2022）。当不同研究使用的特征或其定义不同时，可能会导致比较不同种群或物种时的困难（Hone等人2016；Lauri 2002；McEdward和Janies 1993）。此外，某些生命阶段之间的过渡点可能不够清晰，例如幼体与成年体之间的界限（Hone等人2016；Vidal和Shea 2023）。因此，需要一套稳健的标准来一致地区分生命阶段，这些标准应在同一物种的不同种群之间以及（如果可能的话）主要类群内的不同物种之间适用。性成熟被定义为个体完成产生功能性配子所需发育的阶段（Minelli 2011；Olmstead等人2009；Vidal和Shea 2023）。确定个体进入成年期的时间点对于获取关键种群参数的信息至关重要（Caswell 2000；Kendall等人2019），包括种群规模以及成年性别群体之间的体型差异（Pellet等人2007）。因此，成年期的定义会对管理策略产生重大影响，尤其是在缺乏遗传分析来确定有效种群规模的情况下（Hoffman等人2004），以及种群中成年雌性的数量。减少误分类的发生依赖于使用可靠的成熟诊断特征，这些特征能在将幼体错误归类为成年体的风险与将成年体错误归类为幼体的风险之间取得平衡，同时还能在成年期区分性别。在野外条件下，这通常涉及使用可见的成熟和性别特征，而不是依赖遗传或激素分析或功能性配子的检测，而后者在没有专业知识或使用侵入性技术的情况下难以实现，这些技术可能对种群造成过度风险（Graham等人2016；Reyer和B?ttig 2004）。因此，需要在野外迅速识别成熟度和性别，以便在原位监测种群，这需要在误分类风险与可能造成的伤害或影响自然行为之间取得平衡。对于受威胁的物种而言，这样的方法学改进尤为重要，因为它们对监测相关的影响抵抗力较弱，且其管理决策依赖于可靠的数据来确定种群趋势。在具有普遍生活史的两栖动物中，存在五个关键的生命阶段：卵/胚胎、蝌蚪、变态、幼体和成年体（Wells 2019）。基于视觉评估，从幼体到成年体的过渡是最难以定义的，因为两栖动物的体型会增大，但不会像前一个阶段那样经历显著的生理变化或重组（Gosner 1960）。当两栖动物表现出性成熟的迹象时，可以推断其已达到成年期，这些迹象可以基于次级性特征的存在（Sarasola-Puente等人2011）。对于雄性来说，这可能表现为婚垫的发育，婚垫在繁殖期间会变厚并变得粗糙，以帮助雄性在交配时抓住雌性（Wells 2019），或者表现为繁殖色（Christy 2001；Graham等人2016；Orton等人2020；Pyke和White 2001）。对于雌性来说，成熟的生理迹象较少（Standaert 1967），但行为可能包括移动到繁殖地点和产卵。雌性的生理特征除了缺乏婚垫外，还与初级性特征相关，例如卵巢的发育（Dumont 1972；Kelley 1996），在某些物种中可以通过透光观察这些特征，这一过程被称为“烛光效应”（Gillette和Peterson 2001；Reyer和B?ttig 2004）。然而，使用可见的性别指示来定义成年期具有挑战性，因为这些特征在成熟之前就开始形成（Kelley 1996），这意味着它们的存在只能表明性别，但不一定能表明成年。未成熟的 amphibian 性腺在变态后发育，导致性激素的循环增加，从而在幼体阶段开始发展初级和次级性特征（Kelley 1996）。例如，在 Xenopus tropicalis 中，变态后8周睾酮水平升高，这与首次观察到婚垫的时间相符（Olmstead等人2009），但估计生殖成熟在18周开始（Hirsch等人2002），而最大生殖能力在22周达到（Olmstead等人2009）。在 X. tropicalis 雌性中，卵巢在变态后16周开始产生雌二醇，这触发卵子从I期到VI期的发育（Dumont 1972），而雌性成熟估计在24周（Hirsch等人2002），最大生殖能力在30周（Olmstead等人2009）。因此，存在性特征形成且可检测的时期，包括未成熟的婚垫和正在发育的卵子，但个体可能尚未具备繁殖能力、处于活跃状态或尚未达到性成熟峰值（Olmstead等人2009；Smith等人1994）。基于性别特征的表现在一定程度上可以帮助更准确地确定幼体和成年体之间的阈值，因为我们不会期望完全发育的婚垫和完全妊娠的雌性出现在个体具备繁殖能力之前。然而，很少有研究量化了这些特征可见表现的变化（Graham等人2016；Olmstead等人2009）。即使达到成熟期，性别特征的表现水平也可能随时间变化。例如，婚垫的表现受性激素水平变化的影响，这些激素水平可能是周期性的，在非繁殖期间会减弱和褪色（Kelley和Pfaff 1976；Olmstead等人2009；Pyke和White 2001）。同样，雌性的卵巢在所有发育阶段通常都包含不同发育阶段的卵子（Dumont 1972；Gould, Clulow等人2023），每次排卵后晚期VI期的卵子数量逐渐增加，然后突然减少（Gould, Callen等人2023；Sato和Tokmakov 2020）。如果不考虑体型等补充特征，这些因素可能导致个体被错误分类。在两栖动物中，个体通常在达到特定种群所需的体型时被定义为成熟，这一体型是通过体型与成熟相关特征的相关性来确定的（Guarino和Mezzasalma 2025）。这是因为这一群体的体型与年龄呈正相关，因为它们具有无限生长特性，即使在达到成熟后生长也会减缓（Gould等人2022）。然而，如果个体之间的发育速率不同，即使在同一群体内部（Pyke和White 2001；Sarasola-Puente等人2011），仅基于过去研究建立的体型阈值来定义成熟性可能会导致误分类。鉴于需要同时区分生命阶段（幼体与成年体）和性别（成年雄性与成年雌性），一个严格而统一的成熟定义不应对同一物种的两种性别使用相同的体型阈值（Klop-Toker等人2016；Valdez等人2016），因为两栖动物通常表现出性别二态性和基于性别的成熟差异（Shine 1979）。即使应用性别特定的成年体型阈值，如果同时不考虑其他特征，也可能无法区分性别，即使存在体型差异（Graham等人2016）。此外，这也忽略了种群内部或种群之间的个体成熟速率的差异，这种差异由遗传和环境条件的相互作用决定（Acevedo等人2022）。因此，需要一种细致的方法，根据性别特定的体型阈值和可视觉检测的性别成熟特征的表现程度来确定每个个体何时达到性成熟。绿金铃蛙（Ranoidea [Litoria] aurea）因其受到两栖动物壶菌和Gambusia鱼入侵导致的栖息地迅速缩小而受到了大量研究关注（Mahony等人2013；Penman等人2008；White和Pyke 2008）。关于该物种的成年期分类，在不同研究中存在显著差异，这些分类结合了体型阈值和次级性特征（Beranek等人2022；Gould, Callen等人2024；Hamer等人2008；Pyke和White 2001；van de Mortel和Goldingay 1998），使其成为结合过去分类方法并确定更细致分类方法的合适模型。在本研究中，我们使用多季节数据集，基于外部可见特征来定义 R. aurea 雄性和雌性的成年期。我们的决策过程较为细致，因为它同时考虑了每个性别独立的最低成年体型阈值（基于大多数个体表现出高度性别特征的程度），以及可检测到的性别特征的存在和表现程度，特别是婚垫的颜色和妊娠程度，还有诸如鸣叫和交配等繁殖行为。

**2 材料与方法**

**2.1 调查设计与动物捕获**

在连续3年时间里，我们在澳大利亚新南威尔士州的Kooragang岛（32.85734° S, 151.72561° E）的60到80个淡水池塘中调查了变态后（即幼体和成年体）R. aurea 个体的存在情况。发现后，按照Gould等人（2021）的方法捕获并处理这些个体。我们使用游标卡尺测量了吻端到泄殖腔的长度（SVL），精确到0.1毫米，并记录了可见的性别和成熟特征的表现在。我们避免使用“亚成年”这一术语，因为该术语可以由某些用于定义成熟的特征来定义（Hone等人2016），并且仅指幼体和成年体之间的过渡，以避免歧义。

**2.2 雄性性成熟的视觉阈值**

在 R. aurea 雄性中，婚垫是前足末节外侧的一个凸起、肉质且角化的组织垫（Hamer和Mahony 2007）。由于婚垫在幼体阶段就开始发育，并在此后持续存在，但表现程度不一（Christy 2001；Pyke和White 2001），因此它的存在是性别的积极迹象，但不总是性成熟的标志。这是因为婚垫的颜色随时间变化（图1）：（1）随着成熟程度的提高，幼体雄性的婚垫最初是无色的/白色的，颜色变化通常与性成熟开始的时间相吻合（Christy 2001）；（2）一旦达到成年，婚垫在繁殖季节会变暗，在非繁殖季节或两次繁殖之间的期间会通过蜕皮过程恢复为无色/白色（图2）。这个生殖垫变暗的现象很可能是由于性激素（雄激素）水平升高所引起的，这些激素会增加黑色素的生成。虽然黑色素本身可能没有功能性益处，但它会伴随生殖垫的角化过程，从而使表面变得粗糙，这种粗糙表面的作用是在交配时提高雄性的抓握力（Wyk等人，2003年；Qiu等人，2024年）。因此，出现了一种复杂的情况：深色的生殖垫是雄性性成熟的积极迹象，但生殖垫颜色较浅的个体可能是（1）性成熟但生殖垫已经褪色的雄性，或者是（2）未成熟的雄性。没有生殖垫的个体可能是（1）未成熟的雄性（Hamer等人，2008年），（2）未成熟的雌性，或者是（3）性成熟的雌性。雌性没有生殖垫，但在同一区域的皮肤可能会变暗，如果缺乏足够的观察经验，这可能会被误认为是生殖垫（图1）。

为了检测绿色和金色钟蟾（Ranoidea aurea）前脚上的生殖垫，我们对其前脚进行了视觉检查。图片显示：（A1）幼年雄性的前脚内趾上开始出现凸起的肉质生殖垫；成年雄性的生殖垫表现各异，颜色从（B1、B2）白色到（B3、B4）灰色再到（B5、B6）黑色不等；（C1、C2）成年雌性的前脚没有生殖垫，但皮肤变暗这一共同特征可能被误认为是生殖垫的存在，红色箭头标出了生殖垫的位置（图2）。

成年绿色和金色钟蟾的雄性前脚内趾上的生殖垫已经开始脱落，露出了下面较浅的生殖垫，这种生殖垫会伴随个体终生存在。可以通过检测生殖垫来评估雄性的性成熟度，而不必考虑其颜色或体型大小。然而，这种方法存在风险，可能会误将刚刚开始形成生殖垫但还未性成熟的幼年雄性记录为成熟个体。另一种方法是仅将生殖垫有颜色的雄性归类为成熟个体，但这又会误将生殖垫褪色的成年雄性也归为成熟个体。一种更为细致的方法是确定在种群中开始检测到深色生殖垫的最小体型大小。达到或超过这个大小类别的雄性可以自动被归类为性成熟个体，无论其生殖垫的颜色如何；而体型较小的个体则需要根据具体的生殖垫表现来进行个案判断。基于此，我们对所有捕获的个体进行了观察，以生殖垫的存在作为雄性性成熟的积极标志，并将其颜色分为三个等级：（1）完全没有或只有少量深色色素的白色；（2）灰褐色或斑驳的色素；（3）纯黑色的。然后我们根据体长（SVL）将个体分组，每个组间隔1毫米，并确定了生殖垫首次被检测到的最小体型类别：（1）任何颜色下首次发现生殖垫的；（2）首次发现深色生殖垫的；（3）大多数个体具有深色生殖垫的。设置成年体型的最小阈值的一个普遍问题是，它适用于某一群体或种群内的所有个体，尽管个体之间存在差异。因此，如果成年个体体型较小且性成熟较早，就有可能被误判为幼年个体（错误类型A）；反之，如果幼年个体性成熟较慢，也有可能被误判为成年个体（错误类型B）。为了减少这些错误率，我们选择了第一个有相当比例（至少50%）个体表现出明显性成熟特征的体型类别作为阈值。这种方法通过将阈值定位于幼年和成年阶段之间的过渡区域，从而减轻了不对称错误率的严重性。这种方法也更能反映种群层面的规律性，因为它是由多个个体共同决定的。这与通过选择最极端的数据点来设定阈值的方法不同，后者会将整个决策过程依赖于单一数据点。

2.3 雌性性成熟的视觉阈值

雌性性成熟的积极标志是体内存在卵巢肿块（图3）。这可以通过烛光照明来检测，因为卵巢内正在发育的卵会阻挡光线通过体腔（Reyer和B?ttig，2004年）；成年雄性在烛光照明下不会显示光线阻挡现象，除了对应于肠道的中心区域（图3）。后期的卵比早期的卵大得多，通常颜色也更深（Dumont，1972年），因此会阻挡更多的光线。因此，通过烛光照明观察到的妊娠状态反映了从中期到后期卵子的存在和相对数量。这种方法无法检测到卵巢组织本身，因为在没有后期卵的情况下，卵巢组织不会阻挡大量光线（图3）。

为了通过烛光照明检测绿色和金色钟蟾（Ranoidea aurea）体内正在发育的卵子，我们对其进行了透射光检查。图片显示了不同妊娠程度的成年雌性，妊娠程度从（A1）无（非妊娠；得分为0）到（A2）轻度妊娠，填充体腔下半部分（得分为1），到（A3）中度妊娠，填充体腔一半（得分为2），到（A4）重度妊娠，填充体腔四分之三（得分为3），再到（A5）重度妊娠，填充体腔大部分（得分为4）；（B1）成年雄性仅显示肠道/内脏部位的光线阻挡。每张图片下方都标明了不同妊娠程度的示意图。在新的一波卵子发育过程中，卵巢内较少中期到后期卵子的个体最初会填充靠近尾部的体腔后部，随着卵子长大，会逐渐填充更多的体腔区域，直到胸部，从而阻挡越来越多的光线（Gould、Callen等人，2023年）（图3）。由于第一次卵子发育通常发生在幼年雌性体内（Olmstead等人，2009年），因此由轻微腹部妊娠引起的光线阻挡可能并不是性成熟的积极标志，因为第一次完整的卵子发育周期尚未开始，或者还没有卵子达到能够受精的阶段（‘排卵准备’状态）（Sato和Tokmakov，2020年）。同样，成年雌性的妊娠程度会随最后一次繁殖时间而变化。最近产卵的雌性体内可能没有或只有少量后期卵子，因此从外观上看不出妊娠状态，但随着新的卵子发育，妊娠程度会随时间增加（Gould、Callen等人，2023年）。因此，较高的妊娠程度更可能是雌性性成熟的积极标志，但这也受到繁殖时间的影响。所以，妊娠程度较低的个体可能是：（1）最近产卵但已经开始新卵子发育的性成熟雌性；或者是（2）尚未开始卵子发育的未成熟雌性；而没有卵子的个体可能是（1）未成熟的雌性，（2）未成熟的雄性（如果也没有生殖垫的话），或者是（3）最近产卵但目前没有新卵子发育证据的性成熟雌性。因此，在视觉上判断雌性性成熟时，必须考虑到成年雌性可能没有正在发育的卵子的情况（即从外观上看不出妊娠）。虽然可以通过任何程度的妊娠程度来评估雌性性成熟，但这也有误将刚刚开始出现卵子发育迹象的幼年雌性记录为成熟个体的风险。另一种方法是仅将妊娠程度较高的雌性归类为成年个体，但这又会误将最近产卵的成年个体归类为幼年个体。一种更为细致的方法是确定一个体型阈值，只要个体没有生殖垫，无论其妊娠程度和体腔内的光线阻挡程度如何，都将其归类为成年雌性。这个阈值可以基于第一次发现高度妊娠雌性的体型类别，或者大多数雌性的妊娠程度。达到或超过这个体型类别的个体可以自动被归类为性成熟个体，而体型较小的个体则需要根据具体的生殖垫表现来逐个判断是否成熟。基于此，我们对所有捕获的个体进行了分析，记录了它们的生殖垫是否存在，并对其颜色进行了评分，从1到3级：（1）完全没有或只有少量深色色素的白色；（2）灰褐色或斑驳的色素；（3）纯黑色的。然后我们根据体长（SVL）将个体分组，每个组间隔1毫米，并确定了生殖垫首次被检测到的最小体型类别：（1）任何颜色下首次发现生殖垫的；（2）首次发现深色生殖垫的；（3）大多数（>50%）个体具有深色生殖垫的。设置成年体型的最小阈值的一个普遍问题是，它适用于一个群体或种群内的所有个体，尽管个体之间存在差异。因此，如果成年个体体型较小但性成熟较早，就有可能被误判为幼年个体（错误类型A）；反之，如果幼年个体性成熟较慢，也有可能被误判为成年个体（错误类型B）。为了减少这些错误率，我们选择了第一个有相当比例（至少50%）个体表现出明显性成熟特征的体型类别作为阈值。这种方法通过将阈值定位于幼年和成年阶段之间的中间位置，从而减少了不对称错误率的严重性。这种方法也更能反映种群层面的规律性，因为它是由多个个体共同决定的。与之相反的是，通过选择最极端的个体来设定阈值，比如具有任何程度成熟特征的最低个体，这会使整个决策过程依赖于一个数据点。

需要注意的是，将被捕个体的生殖垫变暗程度分为三个不同的级别，以捕捉从几乎没有颜色到完全表达颜色的中间状态。然而，我们将处于这个过渡状态的个体与具有深色生殖垫的个体归为一类，因为任何程度的生殖垫变暗都表明这些个体的激素水平显著升高，因此更有可能具有可繁殖的配子，或者在交配后刚刚完成蜕皮。虽然任何分类阈值都具有一定的主观性，但所选阈值反映了那些几乎没有或完全没有生殖垫颜色发育的个体与那些明显有色素发育的个体之间的生物学差异。已经怀孕的个体（因此可以识别为雌性）被排除在分析之外。

2.3 雌性性成熟的视觉阈值

体内存在卵巢肿块是雌性性成熟的积极标志（图3）。这可以通过烛光照明来检测，因为在卵巢内生长的卵子会阻挡光线通过体腔（Reyer和B?ttig，2004年）；成年雄性在烛光照明下除了肠道区域外不会显示光线阻挡现象（图3）。后期的卵子比早期的卵子大得多，颜色也更深（Dumont，1972年），因此会阻挡更多的光线。因此，通过烛光照明观察到的妊娠状态反映了从中期到后期卵子的存在和数量。这个过程无法检测到卵巢组织本身，因为在没有后期卵子的情况下，卵巢组织不会阻挡大量光线（图3）。

为了通过烛光照明检测绿色和金色钟蟾（Ranoidea aurea）体内正在发育的卵子，我们对其进行了透射光检查。图片显示了成年雌性的不同妊娠程度，光线阻挡程度从（A1）无（非妊娠；得分为0）到（A2）轻度妊娠，填充体腔下半部分（得分为1），到（A3）中度妊娠，填充体腔一半（得分为2），到（A4）中度至重度妊娠，填充体腔四分之三（得分为3），到（A5）重度妊娠，填充体腔大部分（得分为4）；（B1）成年雄性仅显示肠道/内脏部位的光线阻挡。每张图片下方都给出了不同妊娠程度的示意图。在新的一波卵子发育过程中，卵巢内中期到后期卵子较少的个体最初会填充靠近尾部的体腔后部，随着卵子长大并变大，会逐渐填充更多的体腔区域，从而阻挡更多的光线（Gould、Callen等人，2023年）（图3）。由于第一次卵子发育通常发生在幼年雌性体内（Olmstead等人，2009年），因此由轻微腹部妊娠引起的光线阻挡可能并不是性成熟的积极标志，因为第一次完整的卵子发育周期尚未开始，或者还没有卵子达到能够受精的发育阶段（‘排卵准备’状态）（Sato和Tokmakov，2020年）。同样，成年雌性的妊娠程度还会随最后一次繁殖时间而变化。最近产卵的雌性体内可能没有或只有少量后期卵子，因此从外观上看不出妊娠状态，但随着新的卵子发育，妊娠程度会随时间增加（Gould、Callen等人，2023年）。因此，较高的妊娠程度更可能是雌性性成熟的积极标志，但这也受到繁殖时间的影响。所以，妊娠程度较低的个体可能是：（1）最近产卵但已经开始新卵子发育的性成熟雌性；或者是（2）尚未开始卵子发育的未成熟雌性；而没有卵子的个体可能是（1）未成熟的雌性，（2）未成熟的雄性（如果也没有生殖垫的话），或者是（3）最近产卵但目前没有新卵子发育证据的性成熟雌性。因此，在视觉上判断雌性性成熟时，必须考虑到成年雌性可能没有正在发育的卵子的情况（即从外观上看不出妊娠状态）。虽然可以通过任何程度的妊娠程度来评估雌性性成熟，但这也有误将刚刚开始出现卵子发育迹象的幼年雌性记录为成熟个体的风险。另一种方法是仅将妊娠程度较高的雌性归类为成年个体，但这又会误将最近产卵的成年个体归类为幼年个体。一种更为细致的方法是确定一个体型阈值，无论个体的妊娠程度和体腔内的光线阻挡程度如何，只要没有生殖垫，就将其归类为成年雌性。这个阈值可以基于第一次发现高度妊娠雌性的体型类别，或者大多数雌性的妊娠程度是高还是低。达到这个体型阈值的个体将自动被归类为成年雌性，无论其妊娠程度如何（只要没有生殖垫）。低于这个体型阈值的个体则根据其妊娠程度进行分类：妊娠程度较高的个体被归类为成年雌性，妊娠程度较低的个体被归类为幼年雌性，没有妊娠的个体被归类为无性别的幼体。这种方法考虑到了在较小体型类别中，没有或只有少量后期卵子的个体更可能是未成熟雌性的情况，而不是最近产卵的成年雌性。在这个阈值以上，没有后期卵子的个体更有可能是最近产卵的成年雌性。我们通过烛光照明检查了所有捕获的个体是否具有妊娠状态。为此，我们将个体倒置，并用头灯（Ledlensor H15R；光圈>1000）照射其背面以产生背光（图3）。穿透体腔的光线量（排除了消化系统所在的中心区域）被用作妊娠程度的视觉指标，通过的光线较少表明卵巢更大，因此有更多后期发育的卵子存在。对于所有捕获的个体，我们根据妊娠程度从0到4进行了评分：（0）没有光线阻挡，非妊娠；（1）卵子堵塞体腔下半部分的光线；（2）卵子堵塞体腔下半部分的光线；（3）卵子堵塞体腔下半部分和第三部分的光线；（4）卵子堵塞体腔所有部分的光线（图3）。然后我们根据体长（SVL）将个体分组，每个组间隔1毫米，并确定了生殖垫首次被检测到的最小体型类别：（1）任何颜色下首次发现生殖垫的；（2）较高程度下首次发现生殖垫的；（3）大多数（>50%）具有深色生殖垫的个体。为此，我们将妊娠程度为2及以上的个体归类为‘高’妊娠，妊娠程度为1的个体归类为‘低’妊娠。选择这个阈值是因为3分和4分的重力得分明显难以区分，并且反映了从几乎没有或有一些卵的发育到大量卵发育的生物学意义上的差异。由于野外工作遵循了Gould等人（2021年）的方案，我们通常只观察那些体长（SVL）超过48毫米且没有婚垫的个体。因此，当前研究的一个潜在局限性可能是可能遗漏了较小个体的妊娠情况。然而，少数体长小于48毫米但被观察到的个体在任何层面上都没有显示出卵成熟的迹象，这表明大部分妊娠数据都被记录了下来。那些有婚垫的个体被排除在分析之外，只留下了雌性或未分性的幼体。

2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

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2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征可以用来区分性别，特别是在雄性中区分性成熟，例如皮肤颜色（Gould和McHenry 2024年）。成年雄性的背部表面往往会变黄，伴有白色的背部条纹、喉咙和腹部（图4）。相比之下，雌性的背部表面没有变黄，同时喉咙和腹部区域的条纹也更白（图4）。然而，我们注意到这种颜色差异可能非常微妙或难以在性别间区分，有些成年雄性也可能没有变黄的现象。因此，我们建议仅使用这一特征来辅助区分性别，而不应用于实际的验证目的。虽然我们检查了雄性的喉咙是否变黄，但我们仅根据是否存在婚垫来确定其性别。图4 在图查看器中打开

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2.4 成年的其他衡量标准

R. aurea的其他特征只有一项研究的差异小于5%，这是基于Gould、Callen等人（2024年）的研究标准；而所有其他研究的相对差异都在10%到40%之间。最大的差异出现在Pyke和White（2001年）以及Goldingay和Newell（2005年）的研究中，因为他们的最小体型阈值（65毫米）远高于我们的标准。有两项研究在使用我们的标准后，女性的数量有所增加，分别是Hamer和Mahony（2007年）以及Valdez等人（2016年），因为他们设定的最小体型阈值（45毫米）较低。

图9展示了使用不同分类系统对同一数据集中成年雄性和雌性数量的影响。在澳大利亚新南威尔士州的Kooragang岛上，通过应用我们当前的标准与过去关于该物种的研究标准，记录了2021至2023年三个连续繁殖季节中成年雄性（蓝色表示）和成年雌性（黄色表示）、绿色和金色钟蛙（Randoidea aurea）的数量。

4. 讨论
我们提供了详细的视觉标准，用于定义R. aurea两性的成年状态，并通过结合性别特定的体型阈值和具有明确表达水平的性别特定特征来区分两性，从而发展出一个比以往分类系统更为细致的过程。我们的工作是新颖的，因为我们根据每种性别独立设置了成熟的最小体型阈值，这些阈值是基于大多数个体表现出特定性别特征的第一个体型类别来确定的，这些特征是成熟的标志，例如雄性的暗色婚垫和雌性的高妊娠度。这些阈值使得：（1）超过某一体型的个体无论这些特征的表达程度如何都可以被归类为成年个体，从而考虑了与激素周期相关的季节性变化；（2）低于某一体型的个体只有在表现出这些特征的高度表达时才能被归类为成年个体。这种决策流程可以应用于其他两栖动物，特别是无尾目动物（青蛙和蟾蜍），只需根据物种或种群的具体情况调整特征阈值即可。为了确定种群参数（如种群规模）的变化，需要可靠地区分性别和变态后的生命阶段。由于监测通常在两栖动物活跃且可检测到的繁殖期间进行（例如，Beranek等人2022年；Gould、Callen等人2024年），基于形态学的快速且非侵入性的分类方法更适合在时间和后勤受限的野外工作中使用。更重要的是，这些方法还能减少压力和造成伤害的可能性，因为减少了处理时间、使用侵入性技术或接触可能传播疾病的设备或多个处理人员的机会（Mendez等人2008年；Swierk和Langkilde 2018年）。对于受威胁的物种而言，这一点尤为重要，因为它可以最小化对野外种群的潜在负面影响，如果受伤、压力或自然行为的改变会降低被处理个体的繁殖能力或机会（Swierk和Langkilde 2018年）。我们还认为，使用性别特定的特征而不是单一特征（如鼓膜大小（Martof 1956年）来区分性别更为有效，因为如果两性不共享相同的分类特征，则误分类的风险会立即降低。由于幼年雄性的婚垫刚开始形成时很小且无色，很难检测到，但我们的研究发现，当研究人员接受充分培训后，这是可以实现的，因此在分类系统中需要考虑这一点。相反，如果大型雄性没有暗色婚垫，这清楚地表明仅凭次级性特征的表现在定义性成熟方面是不够的，因为它们在这个生命阶段可能会表现出时间变异性（Pyke和White 2001年）。这支持了使用最小体型阈值的有效性，超过这个阈值后，可以忽略基于性别的成熟特征的表达水平，从而将更大的个体归类为成年个体。此外，不需要设定一个上限体型阈值来定义雄性和雌性，因为可以根据婚垫的存在轻松区分两者，婚垫在成年后一直存在。然而，未来的研究应该通过进行可识别个体的标记-重捕研究，探索性别特征表达随季节、体型和年龄的变化。显然，在R. aurea中，雌性是最容易被误分类的性别，背后有多种原因。例如，雌性成年最小体型阈值的设定是基于相反性别表现出成熟性特征的最小体型，而不是雌性特有的特征（Hamer等人2008年；Hamer和Mahony 2007年），这忽略了基于性别的成熟差异，而是根据极端雄性数据点来定义成年期。我们发现，当将这一阈值应用于实际种群数据时，可能会导致成年雌性数量的过度估计，因为它将这一性别的最小体型阈值设定得太低。在其他情况下，两性都使用了相同的成年体型阈值，这也忽略了基于性别的成熟差异，也导致了雌性种群规模的过高估计（Klop-Toker等人2016年；Valdez等人2016年）。使用我们自己的标准后，雌性数量的最大差异出现在Pyke和White（2001年）以及Goldingay和Newell（2005年）的研究中，可能是因为他们设定的雌性成年最小体型阈值较大，并且没有考虑到这一体型以下雌性的妊娠度或其他成熟特征。我们还发现，有些研究在定义雌性成年期时没有考虑妊娠度，而是使用婚垫的缺失结合最小体型阈值；Beranek等人（2022年）是一个例外。如果最小体型阈值在没有根据雌性成熟特征进行调整的情况下设定，这对其他物种来说也可能造成问题。对于雄性的误分类包括即使它们具有暗色婚垫，如果体型低于阈值也会被排除在成年群体之外（Klop-Toker等人2016年；Pyke和White 2001年；Valdez等人2016年），这忽略了早熟的雄性和种群内的成熟变异性。雄性的成熟也基于婚垫的存在来定义，而没有考虑婚垫的颜色（Gould等人2021年；Klop-Toker等人2016年；Valdez等人2016年），尽管实际上无色的婚垫可能在幼年时期就开始形成。然而，我们发现，鉴于最小体型阈值相似，这些情况并没有导致成年雄性数量的显著低估。其他研究仅根据暗色婚垫的存在来定义成年期（Goldingay和Newell 2005年），我们发现这会导致成年雄性数量的显著低估，因为它们可能遗漏了那些未处于繁殖状态的成年雄性。最近的方法仅根据婚垫的存在来定义成年期，而不设体型限制，这样可以避免将体型较小的成年个体误识别为幼体（Gould、Callen等人2024年；Gould等人2021年），但没有考虑到在达到成熟之前就开始形成性别特征的幼体的误识别风险。只有一项研究明确指出了使用其他性别特征（如鸣叫和抱对行为）来识别成年个体（Goldingay和Newell 2005年），这应该在未来的研究中加以考虑，以提供更多的成熟证据；不过需要注意的是，这些行为是短暂的，并非总是由成年个体表现出。通过将过去的研究与我们自己的研究进行比较可以看出，使用各种标准时，雄性数量的变异性远小于雌性，这表明这一性别的个体大部分被正确地分配到了幼年和成年群体中。这主要是因为婚垫易于检测，是该物种的一个可靠的视觉标识符，尽管在其他物种中可能不是这样（Standaert 1967年）。然而，在某些物种中，婚垫表达随激素周期的变化没有详细描述，这使得很难判断它们是简单地褪色还是真正消失了（Graham等人2016年；Olmstead等人2009年）。未来的研究可能会忽略褪色的婚垫，从而错误地分类出实际上是成年雄性的个体。使用婚垫来区分性别和确定成熟度的研究应该解释这种组织结构随时间的变化，以减少这种类型的错误。我们的分类系统与Beranek等人（2022年）的方法最为相似，他们通过婚垫的存在和颜色来识别成年雄性，通过是否怀孕或达到某个体型阈值来识别成年雌性（如果雌性未怀孕的话）。从我们的数据集来看，应用我们的标准与他们的标准相比，雄性和雌性的数量差异很小。然而，Beranek等人（2022年）没有为雄性成年设定体型阈值，如果雄性的婚垫不呈暗色，这可能会增加将成年个体误识别为幼体的风险。同样，Beranek等人（2022年）在分类雌性成年期时没有考虑妊娠度，如果雌性开始显示出卵的成熟，这可能会增加将幼年雌体误识别为成年体的风险。使用可见的性别特征来定义成熟度可能存在一些注意事项。例如，如果照明不够强，无法透过身体腔体看到卵，特别是在体型较大的雌性中，这可能会使得通过烛光观察变得困难。然而，使用足够强大的头灯（>1000流明）可以减少这一问题；不过，必须注意不要将光线照进青蛙的眼睛，并确保光源不会产生可能导致烧伤的热量。妊娠度也可能被肠道内容物掩盖或混淆（Gillette和Peterson 2001年），尤其是在进食大量食物之后。然而，通过培训可以减少这一问题，因为即使摄入大量食物，肠道内容物也不会像卵巢组织那样导致身体腔体外部区域的光线阻挡。卵巢质量相对于身体腔体的大小也可能随个体充气程度的不同而变化，这也需要考虑（Reyer和B?ttig 2004年），但可以通过多次照亮青蛙并在充气程度相对较低时记录妊娠度来轻松处理。其他特征也可以用来区分性别，如颜色（Gould和McHenry 2024年），但我们认为这应该仅作为辅助信息，因为即使在同一种群内，这些特征也不总是稳定的。身体状况也可以用来确定性别和妊娠度（Reyer和B?ttig 2004年），但由于难以区分资源获取和上次进食后的时间效应，这一点并不可靠。我们没有考虑使用相对后肢长度和宽度作为额外的特征来确定性别或成熟度，因为我们希望使用在野外易于并且可以视觉检测到的性别特定特征。其他技术，如超声波，可以用来检测成熟卵的存在（Reyer和B?ttig 2004年），但这需要专业知识和特殊设备，以及较长的处理时间。

5. 结论
达到性成熟的体型可能因个体间的遗传和/或环境因素、代际差异、性别差异、种群差异以及不同物种而有所不同。这意味着在不考虑其他性成熟特征的情况下设定成年最小体型阈值可能会导致幼体和成年个体之间的高误分类率。成年期的判定应基于一个最低体型标准——即大多数个体在这一体型下开始持续展现出高水平的性别相关成熟特征。我们的研究方法充分考虑了这一点，因此具有足够的灵活性，可适用于多种无尾两栖动物。

**作者贡献**
约翰·古尔德提出了研究思路并设计了研究方法。约翰·古尔德、科林·麦克亨利和亚历克斯·卡伦负责数据收集工作。约翰·古尔德与洛伦·路易丝·法德尔共同分析了数据。约翰·古尔德、亚历克斯·卡伦及洛伦·路易丝·法德尔主导了手稿的撰写。所有作者都对草稿内容进行了关键性的修改，并最终批准了论文的发表。

**致谢**
本研究得到了Port Waratah Coal Services（PWCS）、Newcastle Coal Infrastructure Group（NCIG）、Hunter and Central Coast Development Corporation（HCCDC）以及Port of Newcastle（PoN）的资助。本研究遵循纽卡斯尔大学批准的研究伦理编号A2023-204进行。所有实验程序均符合澳大利亚关于为科学目的饲养和使用动物的相关规定。这些资助机构仅提供了后勤支持，未参与研究设计、数据收集与分析、报告撰写，也未参与文章的发表决策过程。该研究的开放获取方式得益于纽卡斯尔大学与Wiley（通过澳洲大学图书馆协会）之间的合作协议。

**伦理声明**
本研究遵循纽卡斯尔大学批准的研究伦理编号A2023-204进行，所有实验程序均符合澳大利亚关于为科学目的饲养和使用动物的相关规定。

**利益冲突声明**
所有作者声明不存在任何利益冲突。

**数据可用性声明**
目前，数据仅作为补充信息提供给审稿机构。