针对富含有机质与刚毛的多毛类（有须火刺虫）的微塑料提取优化方法

《Water Biology and Security》：Optimizing microplastic extraction from organic-rich and bristle polychaetes (Hermodice carunculata)

为建立适用于复杂生物基质的标准化微塑料检测流程，研究人员以富含有机质与钙质-甲壳质刚毛的有须火刺虫为模型，开发并验证了一种优化的多步提取方案。该方法通过酶-过氧化氢-醋酸顺序处理及菜籽油浮选，高效去除有机物（效率>98%）并回收多种塑料聚合物（回收率86.7%-97.8%），同时保持了微塑料的物理化学完整性，为大型底栖无脊椎动物的微塑料污染研究提供了可重复、可持续且高效的标准化方法。

　　

在广袤的海洋中，一种微小却顽固的污染物——微塑料（Microplastics, MP），正悄然入侵从海岸到远洋的每一个角落，成为当下最紧迫的环境挑战之一。这些尺寸小于5毫米的塑料碎片，有的来自日化产品的直接添加，有的则是大型塑料垃圾在物理化学作用下的“后代”。它们最终大都沉降在海底，将海底沉积物变成了一个巨大的“塑料垃圾场”。生活于此的底栖生物首当其冲，而多毛类环节动物，因其物种丰富、数量庞大且在海洋食物网和底栖群落结构中扮演关键角色，成为了研究微塑料生态影响的理想对象。然而，一个关键的技术瓶颈制约了研究的深入：目前从生物体内提取微塑料的方法，大多“移植”自针对鱼类和双壳类的方案，难以有效处理多毛类动物复杂的身体结构——它们往往富含油脂、蛋白质，并拥有坚硬的钙质-甲壳质刚毛。方法的不统一也导致不同研究之间的数据难以比较。为此，以有须火触虫（Hermodice carunculata）这种体型大、食性杂、在人为活动频繁海域数量可观的“机会主义捕食者”为模型，开发一种高效、标准化的微塑料提取方法，不仅对评估其自身污染状况至关重要，更能为其他复杂体型的大型底栖无脊椎动物研究提供范本。

为了回答上述问题，研究人员在意大利阿普利亚的伊奥尼亚海岸采集了有须火刺虫样本。研究首先比较了过氧化氢（H₂O₂）和氢氧化钾（KOH）对有机质的消化效率，随后对提取流程进行优化，包括引入胰蛋白酶预消化、测试不同酸（盐酸HCl和醋酸AcOH）对刚毛的去除效果，并评估多种密度分离液与菜籽油的浮选效率。最终，通过扫描电子显微镜（SEM）、显微拉曼光谱（μ-Raman）和衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）等技术，系统验证了所开发方法对微塑料物理化学性质的保存效果、消化效率（Digestion Efficiency, DE）以及对多种塑料聚合物的回收率（Recovery Rate, RR）。

3.1. 有机质消化试剂

对比结果显示，过氧化氢（H₂O₂）在消化有机质方面显著优于氢氧化钾（KOH）。经H₂O₂处理的样品悬液更澄清，残留物更少，仅用一张1.2微米玻璃纤维滤膜即可完成过滤；而KOH处理则导致滤膜快速堵塞，需要多张滤膜，且残留大量未消化的有机物和刚毛，可能掩盖微塑料。基于湿重的消化效率计算表明，H₂O₂达到99.5 ± 0.3%，而KOH为96.4 ± 0.8%。因此，H₂O₂被选为消化有须火刺虫软组织的试剂。

3.2. 方法优化

在优化步骤中，研究人员发现，在H₂O₂处理前增加0.3%胰蛋白酶的预消化步骤，可以有效软化组织，并减少后续氧化消化过程中的泡沫形成。在去除钙质-甲壳质刚毛方面，5% HCl和10% AcOH均表现出高效能，两者基于干重的消化效率相近（分别为96.9 ± 0.9% 和 96.1 ± 2.6%）。为了加速过滤并减少滤膜堵塞，增加了一步使用10微米不锈钢滤网的预过滤。在浮选步骤的筛选中，菜籽油在浮力测试中对所有测试的塑料聚合物（包括高密度的聚氯乙烯PVC和聚对苯二甲酸乙二醇酯PET）都表现出良好的捕获能力，而高密度盐溶液则无法浮起所有类型的塑料。此外，使用菜籽油浮选后，滤膜上的有机残留物覆盖度显著降低，有利于后续的显微镜检。

3.3. 提出的微塑料提取工作流程

基于以上结果，研究提出了一套完整的微塑料提取流程。简要步骤为：将样本切块后，先进行胰蛋白酶（37°C, 1小时）预消化，接着用过氧化氢（50°C, 48小时）消化软组织，然后用醋酸（室温, 2小时）溶解刚毛。消化液先经10微米不锈钢滤网预过滤，残留物用菜籽油进行浮选分离，最后将油相用乙醇清洗后浓缩至1.2微米玻璃纤维滤膜上。整个流程可在5天内完成，相比之前针对该物种需要2-3周的方法更为高效。

3.4. 方法验证

3.4.1. 消化效率与微塑料回收率

该方法能高效去除有须火刺虫样本的有机物，基于干重和湿重的消化效率分别达到98.4 ± 1.2% 和 99.7 ± 0.2%。回收率测试显示，对于不同类型的微塑料，如聚氯乙烯（PVC）碎片、聚酰胺（PA）纤维、轮胎磨损颗粒、低密度聚乙烯（LDPE）碎片和聚苯乙烯（PS）微球等，回收率在77.0 ± 8.8% 到 97.8 ± 1.9% 之间，表明该方法对不同聚合物类型和形态的微塑料均有可靠的回收能力。

3.4.2. 试剂对微塑料物理化学性质的影响

扫描电镜分析表明，使用盐酸（HCl）处理会导致聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）和聚酰胺（PA）等塑料碎片表面出现裂纹、蚀刻和粗糙度增加；而使用醋酸（AcOH）处理则能很好地保持塑料表面的原始形貌。光谱学分析进一步证实，经过菜籽油浮选步骤后，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚氯乙烯（PVC）等塑料的显微拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱特征峰得以保留，匹配率均在88%以上，说明菜籽油处理并未严重影响后续的聚合物化学鉴定。

本研究成功开发并验证了一套用于从有须火刺虫等复杂体型底栖生物中提取微塑料的优化方案。该方案的核心优势在于其高效性与“绿色”设计理念。通过比较，过氧化氢（H₂O₂）被确定为比氢氧化钾（KOH）更有效的有机质消化剂，尤其适用于富含脂质的样本。胰蛋白酶的引入作为预消化步骤，有效缓解了泡沫问题，提高了处理效率。在溶解坚硬刚毛方面，温和的醋酸（AcOH）被证明是比盐酸（HCl）更优的选择，它能在有效去除刚毛的同时，最大程度地避免对多种塑料聚合物表面形貌造成损伤。创新的菜籽油浮选步骤替代了传统的盐溶液密度分离，不仅对高、低密度塑料均有良好的捕获效果，还能进一步去除有机残留，且其环境友好、成本低廉。验证数据表明，该方法消化效率高（>98%），对多种常见塑料聚合物的回收率令人满意（77.0%-97.8%），并成功保留了微塑料的物理化学完整性，确保其能通过显微拉曼光谱等技术进行准确鉴定。

这项研究的最终结论是，所提出的“胰蛋白酶-过氧化氢-醋酸-菜籽油浮选”多步提取法，是一种可重复、可持续、省时且高效的方法，适用于从有须火刺虫这类富含有机质和钙质-甲壳质结构的海洋生物中提取微塑料。该工作不仅为首个针对有须火刺虫的经过全面验证的微塑料提取方法提供了参考，更重要的是，其设计思路和优化策略（如选用高效温和试剂、引入油浮选等）为解决从复杂生物基质中提取微塑料的普遍性难题提供了新方案。通过推动方法学的标准化，本研究有助于未来在不同研究和不同物种间获得可比较的微塑料污染数据，从而更准确地评估微塑料对地中海乃至全球底栖群落的生态影响，具有重要的方法论意义和环境科学价值。该研究成果已发表在《Water Biology and Security》期刊上。