菠萝AcINH3通过调控蔗糖代谢与干旱应答通路提升抗旱性的分子机制与育种潜力研究

《Plants》：Genome-Wide Identification of Pineapple AcINH Genes and Functional Characterization of AcINH3 in Sucrose Metabolism and Drought Tolerance Yuyao Gao, Shanshan Huo, Anping Guo, Xiumei Zhang, Weisheng Sun, Wentian Xu, Hui Zhao and Qingsong Wu

为解决菠萝季节性干旱导致的减产问题，研究人员围绕菠萝酸性转化酶抑制剂AcINH家族，特别是AcINH3，开展了其在蔗糖代谢和干旱耐受性中的功能研究。研究发现，敲除AcINH3可显著提升细胞壁转化酶(CWIN)活性，促进己糖积累，增强植物生长，并通过调节ABA、脯氨酸(PRO)、POD活性等关键生理指标，显著提高菠萝的抗旱性。该研究首次在菠萝中揭示了AcINH3–AcCWIN1这一翻译后调控模块，为利用基因组编辑技术培育抗旱菠萝品种提供了关键分子靶点。

　　

菠萝是全球重要的景天酸代谢作物，其鲜食与加工产品在全球市场占有重要地位。然而，由气候变化引发的季节性干旱已成为限制其生长和产量的主要非生物胁迫因素，导致巨大的经济损失。面对这一挑战，提升菠萝的抗旱性已成为产业和科研关注的焦点。植物在应对干旱胁迫时，会启动一系列复杂的生理生化适应机制，其中可溶性糖（如蔗糖、葡萄糖、果糖）的积累不仅作为渗透调节物质，还作为信号分子，在维持细胞稳定和传递胁迫信号中发挥关键作用。蔗糖的分解代谢主要由酸性转化酶（Acid Invertase, Ac-INV）催化，其中位于细胞壁的细胞壁转化酶（Cell Wall Invertase, CWIN）对调控库强、植物生长发育及逆境响应至关重要。然而，菠萝中调控CWIN活性的关键因子及其在干旱响应中的具体作用机制尚不清楚。本研究针对这一问题，对菠萝中的酸性转化酶抑制剂（Invertase Inhibitor, INH）家族进行了系统性鉴定与功能解析，尤其聚焦于其中一个关键成员——AcINH3。

本研究综合利用生物信息学、分子生物学、遗传转化和生理生化分析等多种技术手段。首先，研究人员从菠萝基因组中鉴定出三个AcINH成员，并对其进行了系统的生物信息学分析。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了AcINH3敲除的遗传改良（GM）植株。通过农杆菌介导的遗传转化技术，获得了三个独立的AcINH3编辑株系（AcINH3-m35, -m38, -m32）。研究在正常和聚乙二醇模拟的干旱胁迫条件下，对野生型和编辑株系进行了系统的表型观察、基因表达、酶活、糖含量及抗旱相关生理指标（如ABA、MDA、PRO、POD）的测定。此外，还通过酵母双杂交和GST pull-down实验验证了蛋白质相互作用。

2.1. 菠萝中AcINHs的鉴定与系统发育分析

通过对菠萝基因组数据库的同源搜索和验证，鉴定出三个AcINH家族成员（AcINH1, AcINH2, AcINH3）。所有成员均属于INVI/PMEI超家族，具有典型的PMEI保守结构域，且基因结构均不含内含子。基序分析显示，AcINH3是唯一含有基序7的成员。系统发育树分析表明，AcINH1和AcINH3与其他物种的INH1和INH2进化关系紧密。

2.2. AcINHs的同源性分析

氨基酸序列比对发现，所有AcINH蛋白均含有位于94、110、181和237位的四个高度保守的半胱氨酸残基，这些残基形成的分子间二硫键对维持INH蛋白的结构构象至关重要。三个AcINH成员之间的氨基酸序列同源性较低，最高仅为32.6%。

2.3. 菠萝AcINHs的蛋白结构预测

三级结构模型显示，AcINH蛋白的N端区域包含四个不对称的α螺旋，它们向内折叠而非向外延伸，其中每个α螺旋都含有一个AIN结合基序，这是调节AIN活性的关键功能区。

2.4. AcINHs在菠萝中的表达模式

组织表达分析显示，AcINH1表现出明显的果实特异性表达，AcINH2在所有检测组织中组成性低表达，而AcINH3则在叶片和花中偏好性表达。干旱胁迫处理下，只有AcINH3的转录水平被显著诱导，在PEG处理72小时达到峰值，表明AcINH3在菠萝响应干旱胁迫中扮演关键角色。

2.5. 敲除菠萝AcINH3增强CWIN活性、蔗糖分解代谢和植物生长

利用CRISPR/Cas9技术成功构建了AcINH3敲除株系。与野生型相比，敲除株系中AcINH3表达显著降低，而CWIN活性显著升高。糖含量测定显示，敲除株系的蔗糖含量降低，而己糖（葡萄糖和果糖）含量显著增加。表型上，敲除株系的株高和冠幅均显著大于野生型，植株生长更为健壮。这证实了AcINH3通过负调控CWIN活性来影响蔗糖代谢和植物生长。

2.6. 敲除菠萝AcINH3增强抗旱性

在PEG模拟的干旱胁迫下，野生型植株出现明显的萎蔫和黄化，而AcINH3敲除株系生长旺盛，未见明显胁迫症状。生理指标检测发现，在干旱胁迫下，敲除株系中CWIN活性显著升高，可溶性糖（蔗糖、葡萄糖、果糖）、ABA和PRO含量以及POD活性均显著高于野生型，而膜脂过氧化产物MDA含量则显著低于野生型。这些结果表明AcINH3敲除能显著增强菠萝的干旱耐受性。

2.7. AcINH3在体外与AcCWIN1相互作用

通过酵母双杂交和GST pull-down实验，研究人员验证了AcINH3与AcCWIN1之间存在直接的物理相互作用，而与另一个同源蛋白AcCWIN2则无相互作用。这从生化层面揭示了AcINH3通过结合并抑制AcCWIN1的活性来发挥功能的分子机制。

3. 讨论与结论

本研究首次在菠萝中对AcINH基因家族进行了系统鉴定，并深入解析了AcINH3的功能。研究表明，AcINH3是一个关键的负调控因子，它通过直接与AcCWIN1互作，在翻译后水平抑制CWIN的活性。敲除AcINH3解除了这种抑制，导致CWIN活性升高，从而促进蔗糖分解为葡萄糖和果糖，为植物生长提供更多的碳源和能量，最终促进植株生长。在干旱胁迫下，升高的CWIN活性进一步促进了可溶性糖等渗透调节物质的积累，同时增强了ABA信号、抗氧化酶（POD）活性和脯氨酸合成，降低了氧化损伤（MDA），从而协同增强了植物的抗旱能力。

综上所述，本研究在菠萝中发现并验证了一个全新的AcINH3–AcCWIN1翻译后调控模块，该模块通过精细调控蔗糖代谢，在平衡植物生长发育和逆境响应中起着枢纽作用。研究结果不仅深化了对CAM（景天酸代谢）植物糖代谢与干旱适应机制的理解，更重要的是将AcINH3确立为一个通过基因组编辑技术改良菠萝抗旱性的理想分子靶点，为培育高产、优质、抗旱的菠萝新品种提供了重要的理论依据和实践策略。相关成果已发表于国际学术期刊《Plants》。