基于DIA蛋白质组学和分子对接技术的综合研究，探讨安五灵苷（Anwulignan）的潜在抗炎机制

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Integrated DIA proteomics and molecular docking studies on the potential anti-inflammatory mechanism of Anwulignan

　　

Binglan Tang|Lang Qin|Ben Qin|Rilun Li|Chunli Ou|Dandan Mo

广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西中医药资源智能化创新工程技术研究中心，国家中医药传承与创新中心，广西药用植物园，南宁，530023，中国

摘要

目的

本研究旨在通过整合蛋白质组学、分子对接和体外细胞模型，探索安五灵烷（AN）的抗炎机制。

方法

在RAW264.7细胞中建立了脂多糖（LPS）诱导的炎症模型。细胞被分为对照组、模型组（LPS处理组）和药物处理组（LPS + AN）。采用数据独立获取蛋白质组学方法，以大于1.2倍或小于0.8倍的倍数变化阈值和p < 0.05的标准筛选差异表达的蛋白质。结合生物信息学分析和分子对接技术鉴定核心靶点和调控通路，并通过Western blot进行验证。

结果

共鉴定出129个潜在的抗炎靶点和6个AN的核心靶点。KEGG富集分析表明，AN的抗炎作用主要涉及内质网中的蛋白质加工，以及p53、FoxO和RIG-I样受体信号通路。分子对接分析显示，AN与这些核心靶点具有强烈的结合亲和力。Western blot验证进一步证实，AN在RAW264.7细胞中显著下调促炎蛋白（CYCS、MAPK14、ATM和EIF2AK2）的表达，并上调抗炎蛋白（CDKN1A和RBX1）的表达。

结论

AN通过多靶点和多通路的方式发挥协同抗炎作用，主要通过调节核心靶点及其相关的信号通路。

引言

炎症反应是抵御病原体感染和组织损伤的重要防御机制。然而，过度的炎症反应可能导致慢性或系统性疾病，如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和神经退行性疾病（Furman等人，2019年）。非甾体抗炎药和皮质类固醇等抗炎药物虽然有效，但长期使用会带来严重的副作用。这促使我们探索来自天然产物的高效低毒的新抗炎药物。

瑶药小传是属于五味子科植物Kadsura longipedunculata的根和茎。它是广西瑶族传统的“老班药”之一，常用于民间医学治疗类风湿性关节炎、胃痛和胃出血等疾病（Lu等人，2022年）。小传的主要活性成分是木脂素和萜类化合物，其中木脂素具有显著的抗炎活性（Idrees等人，2022年）。安五灵烷（AN）是从K. longipedunculata中提取的木脂素（Tang等人，2020年），已证实具有抗胃溃疡（Liu等人，2021年）、抗氧化（Li等人，2020年）、抗癌（Xie等人，2021年）和护肝（Zhang等人，2020b年）等药理作用。我们的初步研究发现，AN可以显著抑制LPS在RAW264.7巨噬细胞中诱导的促炎因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌，表明其具有潜在的抗炎活性。然而，关于其抗炎作用分子机制的研究仍停留在炎症因子层面，尚未有蛋白质组学研究系统分析该木脂素调控的关键靶点和信号通路（Meier等人，2020年）。这项技术已应用于中药活性成分的靶点筛选（Wang等人，2018年）。此外，分子对接可以通过模拟小分子的结合构象和亲和力来高效验证候选靶点的特异性，成为研究中药多靶点机制的重要辅助工具（Fraternali等人，2013年）。这两种方法的结合可以为天然产物的多通路作用机制提供强有力的支持。

以LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞为模型，本研究首次将数据独立获取（DIA）蛋白质组学与分子对接相结合，用于筛选AN的潜在抗炎靶点并分析核心信号通路。我们的结果增加了对AN抗炎分子机制的认识，为木脂素药物的研发和治疗炎症相关疾病做出了贡献。

部分摘录

细胞培养和刺激

小鼠RAW264.7巨噬细胞系购自中国上海EK-Bioscience Biotechnology有限公司。细胞在含有10%胎牛血清（10099141，同样来自GIBCO）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，C11995500BT，购自Grand Island Biological Company, GIBCO）中培养，培养条件为37°C、5% CO₂湿润培养箱，培养至80%汇合度后使用。RAW264.7细胞以每孔4×10⁵个细胞的密度接种在培养皿中。

筛选AN相关的炎症靶点

通过DIA蛋白质组学研究AN对蛋白质组的影响。共鉴定出4158个蛋白质，其中129个被选中。图1A显示了蛋白质筛选的结果。

PPI网络构建和核心靶点分析

使用STRING软件为129个差异表达蛋白（DEPs）构建了PPI网络。共有99个DEPs被纳入网络，生成99个节点和184条边（图1B）。如图1C所示，通过MCODE筛选出四个关键网络，并确定了18个候选关键基因

讨论

本研究结合DIA蛋白质组学和系统生物信息学，探讨了AN在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞模型中的抗炎机制。我们鉴定出129个对AN有反应的DEPs作为潜在的抗炎靶点。后续的综合分析包括PPI网络的拓扑评估、KEGG通路富集、分子对接和Western blot验证，确认CYCS、MAPK14、ATM、CDKN1A、EIF2AK2和RBX1为核心调控蛋白，并明确了

结论

总之，本研究表明，AN通过协同调节内质网蛋白质加工、p53、FoxO和RIG-I样受体信号通路，以及多维抗炎网络（包括CYCS、CDKN1A、MAPK14、ATM、RBX1和EIF2AK2）发挥抗炎作用。其分子机制包括：蛋白质稳态的调节、DNA损伤反应的激活、炎症-抗氧化反应的平衡以及病毒模拟的调控

CRediT作者贡献声明

Rilun Li：撰写 – 审稿与编辑。Chunli Ou：正式分析、数据管理。Dandan Mo：监督、概念构思。Lang Qin：软件操作、资金获取、数据管理。Ben Qin：撰写 – 审稿与编辑。Binglan Tang：撰写 – 原稿撰写、可视化、实验设计、资金获取、正式分析、数据管理、概念构思

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（81660721）、广西药用资源保护与遗传改良重点实验室（KL2023ZZ07）和广西大学青年和中年教师基础科研能力提升项目（2024KY1438）的支持。

利益冲突声明

我们声明不存在可能影响《安五灵烷的抗炎机制的整合蛋白质组学和分子对接研究》手稿解释结果的利益冲突。我们也充分认识到，如果不披露利益冲突，可能会导致手稿被拒绝或撤回。

致谢

作者感谢伦敦帝国理工学院的Dev Sooranna博士对手稿的英文编辑。