《PLOS One》：Transcriptomic study of WSSV infection in Litopenaeus vannamei lymphoid organ via single nuclei RNA sequencing
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本研究聚焦于对虾养殖中由白斑综合征病毒(WSSV)引发的白斑病(WSD)这一严重威胁，通过建立针对对虾淋巴器官的新型单核RNA测序(snRNA-seq)技术，首次构建了凡纳滨对虾淋巴器官的细胞图谱，并系统比较了感染与对照样本的基因表达差异。研究发现多个与病毒入侵、免疫调控及细胞应激相关的关键基因(如Slc2a1、Xpo1、Atf3等)，为利用CRISPR基因编辑培育WSSV抗性对虾品系提供了潜在靶点，对推动对虾养殖业的可持续发展具有重要意义。
在水产养殖这个全球食物供给的重要支柱中，甲壳类养殖，尤其是凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei，俗称南美白对虾）的养殖，是其中最具经济价值的板块之一。然而，这个蓬勃发展的产业一直笼罩在一种致命病毒的阴影之下——白斑综合征病毒（White spot syndrome virus, WSSV）。由它引发的白斑病（White spot disease, WSD）发病迅猛，可在短短几天内导致虾群全军覆没，给全球对虾养殖业造成了难以估量的经济损失。更棘手的是，与人类等哺乳动物不同，对虾等无脊椎动物缺乏基于抗体的适应性免疫系统，其防御完全依赖于先天的细胞和体液免疫，这使得传统疫苗开发路径受阻。因此，深入理解对虾在面对WSSV入侵时的“内部战场”究竟发生了什么，寻找其免疫防御的关键“开关”和“漏洞”，成为培育抗病虾种、实现产业可持续发展的迫切需求。
在这项发表于《PLOS One》的研究中，研究人员将目光投向了对虾体内一个关键的免疫器官——淋巴器官（Oka organ）。这个器官被认为是防御病原体（尤其是病毒）入侵的前线堡垒，其中的类球形细胞（Lymphoid organ spheroid, LOS）被证实具有吞噬和降解病毒的能力。然而，由于技术限制，以往基于整体组织（bulk RNA-seq）的转录组研究只能得到所有细胞的平均基因表达信号，无法窥见这个“堡垒”内部由哪些不同类型的“士兵”（细胞）组成，以及每种“士兵”在病毒入侵时具体承担了何种任务。为了破解这一黑箱，研究团队采用了前沿的单核RNA测序（single nuclei RNA sequencing, snRNA-seq）技术，以期在单细胞分辨率下，绘制出对虾淋巴器官的首幅“细胞图谱”，并精准定位那些在WSSV感染中发挥关键作用的细胞类型和基因。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们使用32只成年凡纳滨对虾，通过注射和饲喂两种方式人工感染WSSV，建立了感染模型。其次，他们成功优化并建立了一种适用于对虾组织（特别是微小的淋巴器官）的新型细胞核分离方案。接着，利用Parse Biosciences公司的Evercode? WT Mega v2试剂盒，对来自对照组和感染组对虾的淋巴器官细胞核进行了snRNA-seq文库构建，并通过Illumina NovaSeq X Plus平台进行测序。最后，利用包含对虾和WSSV基因组的联合参考序列，通过Seurat等生物信息学软件包进行数据比对、质量过滤、细胞聚类、差异基因表达分析（DEG）和基因集富集分析（GSEA），从而解析细胞异质性和感染应答机制。
研究结果
WSSV感染与病毒定量
通过定量PCR（qPCR）对感染虾肌肉组织进行检测，证实所有WSSV感染组对虾均携带高载量病毒，注射组和饲喂组的病毒载量范围分别为3x106–3x107和 3x105–1.5x107WSSV拷贝/微升，而对照组未检测到病毒，成功建立了感染模型。
细胞核分离
新开发的淋巴器官细胞核分离方案效果良好，获得的细胞核样本碎片少，单核率超过95%，质量符合下游snRNA-seq建库要求。
细胞图谱构建与组织病理学数据整合
通过对超过1.5亿条测序reads和18,541个高质量细胞核的分析，成功构建了凡纳滨对虾淋巴器官的首个单核分辨率细胞图谱。UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）可视化分析共识别出17个不同的细胞簇。
淋巴器官细胞簇
基于标志基因的表达谱，研究者为大多数细胞簇鉴定了可能的身份：
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非免疫相关细胞簇：包括 visceral-like cells（类内脏细胞）、secretory/parenchymal-like cells（分泌/实质样细胞）、多种 nervous system cells（神经系统细胞）、endo-epithelial cells（内上皮细胞）、myocytes（肌细胞）、connective-fibroblast-like cells（结缔-成纤维样细胞）等。其中，一个几乎全部由对照组细胞构成的簇高表达热激蛋白基因，被鉴定为 stressed/dying cells（应激/死亡细胞）。
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免疫相关细胞簇：研究发现两个关键的免疫相关细胞簇（Cluster 9和10）几乎完全由感染组细胞构成。Cluster 9被鉴定为 lymphoid spheroid cells（淋巴类球形细胞，LOS），其前20个标志基因中有9个是WSSV基因，强烈提示该类细胞是病毒攻击和聚集的主要靶点。Cluster 10被鉴定为 immune-like cells（免疫样细胞），也含有WSSV基因标志。此外，Cluster 12被鉴定为 haemocytes（血细胞）。
差异基因表达分析
通过比较感染组与对照组的基因表达，共发现85个上调基因和70个下调基因。其中许多差异表达基因（DEGs）与病毒免疫、细胞应激或凋亡相关，例如：
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Slc2a1 (Glut1)：一个已知在人类中可作为某些病毒受体的葡萄糖转运蛋白基因，在“Myocytes 2”簇中上调，在“Endo-epithelial cells 1”簇中下调，提示其可能参与WSSV的细胞进入或宿主代谢重编程。
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Xpo1：一个介导病毒核糖核蛋白核输出的基因，在“Connective tissue-fibroblast-like”簇中上调。
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Ivns1abp：一个与流感病毒相互作用的抗病毒相关基因，在“Secretory/parenchymal-like cells”簇中下调。
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Slk 和 Plxna3：与细胞凋亡和应激信号通路相关的基因，分别在不同簇中上调。
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Egr1、Atf3、Cebpa 等免疫调节或转录因子基因也发生显著变化。
研究结论与讨论
本研究的核心结论在于，通过创新的snRNA-seq技术，首次在单细胞水平上系统描绘了凡纳滨对虾淋巴器官的细胞组成图谱，并精准揭示了WSSV感染期间不同细胞类型的特异性转录应答。
研究表明，淋巴器官是一个细胞类型高度异质的免疫器官，不仅包含行使免疫功能的类球形细胞和免疫样细胞，还含有上皮细胞、肌细胞、神经细胞、分泌细胞等多种支持性细胞。WSSV感染会特异性地招募或激活淋巴类球形细胞和免疫样细胞，这些细胞簇中高表达的WSSV基因强烈表明它们是病毒复制和宿主-病毒相互作用的关键战场。
更重要的是，差异基因表达分析鉴定出了一系列具有潜在关键功能的基因。例如，Slc2a1 (Glut1) 可能作为病毒受体或通过调节细胞代谢状态影响感染；Xpo1 作为多种病毒复制所依赖的核输出因子，其上调可能被WSSV利用；而 Ivns1abp、Egr1 等基因的下调，则可能是病毒为逃避免疫识别和清除而采取的“主动”调控策略。GSEA分析进一步显示，感染后显著富集的通路与物质转运、细胞信号传导和应激反应密切相关。
这些发现具有重要的科学意义和应用价值。在科学上，该研究极大地增进了我们对无脊椎动物（特别是甲壳类）免疫器官细胞构成和抗病毒免疫机制的理解，为比较免疫学提供了宝贵资源。在应用上，研究鉴定出的多个关键差异表达基因（如 Slc2a1、Xpo1、Atf3 等），为通过 CRISPR基因编辑 等手段培育具有WSSV抗性的对虾新品种提供了明确的、位于特定细胞类型的候选靶点。通过精准编辑这些靶点，有望增强对虾的先天免疫防御或阻断病毒的生命周期，从而从根本上减少对虾养殖业对化学药物和抗生素的依赖，推动其向更加可持续、高效和环保的方向发展。
综上所述，这项研究不仅为对虾免疫学提供了高分辨率的细胞图谱，更架起了一座从基础研究发现通向抗病育种实际应用的桥梁，为应对WSSV这一全球对虾养殖业的头号威胁带来了新的希望。
