一种新型的、快速且精确的黄嘌呤氧化酶活性测定方法

《Dyes and Pigments》：A new, rapid, and accurate method for measuring xanthine oxidase enzyme activity

　　Ayat A. Abdulhassan | Mahmoud Hussein Hadwan 伊拉克巴比伦省希拉市巴比伦大学科学学院化学系，邮编51002 **摘要** 黄嘌呤氧化酶（XO）在黄嘌呤氧化过程中产生过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2•-），从而引发氧化应激。该酶与活性氧相关疾病密切相关。准确测量XO活性对于诊断和药物研究至关重要，尤其是在分析植物来源的酶抑制剂和抗氧化剂时。本研究报道了一种新型的两阶段耦合动力学光谱法，用于测量XO活性，该方法基于XO介导的黄嘌呤氧化过程中生成的H2O2对吡咯 gallol红染料（PGR）的催化氧化（PGR-XO测定法）。在0.5–4.5分钟的反应时间内监测PGR吸光度的逐渐减弱，与H2O2的生成量呈直接正比，从而提供了对XO催化活性的敏感测量。在测定法中加入了叠氮化钠以消除内源性过氧化氢酶的干扰，确保了在复杂生物基质中的测量特异性。 **分析验证** 结果显示该方法具有较高的重复性，重复内变异系数和重复间变异系数分别为3.2%和4.5%。通过Bland–Altman分析和Passing–Bablok回归评估了方法的一致性，相关系数为0.99，证实了该方法的高度一致性和分析等效性。该测定法成功应用于多种生物组织匀浆样本，其结果与传统方法高度一致。 **引言** 黄嘌呤氧化酶（XO，EC 1.17.3.2）是一种含有钼的黄素蛋白，在嘌呤代谢和氧化应激的传播中起着关键作用。该酶最早由Morgan及其同事于1922年在牛奶中发现，他们证明它可以氧化黄嘌呤和次黄嘌呤，并将分子氧还原为过氧化氢。这一活性后来被归因于“Schardinger酶”，1938年Booth提供了有力证据表明这两种酶实际上是相同的。XO通过依次催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤和黄嘌呤氧化为尿酸，同时产生活性氧（ROS），即超氧阴离子（O2•-）和过氧化氢（H2O2）。这些生化特性使XO成为氧化应激的主要生物来源，在生理和病理过程中都占据核心地位。 **病理意义** XO活性升高会导致高尿酸血症和痛风，这是一种由尿酸结晶沉积引起的关节炎症性疾病。除了嘌呤代谢紊乱外，XO产生的ROS还会通过促进炎症和加速动脉粥样硬化斑块的积累而导致内皮损伤和心血管疾病。值得注意的是，XO活性在缺血-再灌注损伤中起着重要作用，血流恢复会引发ROS生成骤增，进一步加剧组织损伤。当XO水平长期升高时，身体的抗氧化防御系统可能会不堪重负，从而放大氧化应激及其下游后果，包括DNA损伤、膜脂质过氧化和蛋白质功能异常。调节XO活性的治疗意义显而易见；例如别嘌醇和非布司他等抑制剂被广泛用于降低尿酸生成和减轻氧化应激。因此，开发可靠的方法来定量XO活性至关重要，不仅对于临床诊断和监测酶抑制剂的效果，而且对于高通量筛选植物来源的抗氧化剂和新药候选物也非常重要。 **多年来已开发出多种测定XO活性的方法** 最传统的方法是监测295 nm处因尿酸形成导致的吸光度增加；另一种方法则是跟踪烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的还原；还有一种方法是在270 nm处测量黄嘌呤的解离。尽管这些基于紫外线的方法被广泛采用，但在复杂的生物基质或色素混合物中容易受到光谱干扰。为克服这些限制，研究人员开发了显色和荧光测定方法。Atlante等人提出了一种荧光测定法，利用XO介导的H2O2将非荧光蝶呤氧化为高荧光异黄蝶呤（Ex/Em：345 nm/390 nm），其灵敏度比传统的尿酸测定法高100–500倍。Beckman等人对该方法进行了改进，证明其适用于XO活性较低的样本（如脑和肾活检样本），并发现加入亚甲蓝作为替代电子受体可以区分黄嘌呤脱氢酶（XDH）和XO的活性。Fried描述了一种灵敏的比色法，使用硝基蓝四唑（NBT）作为电子受体，并加入苯嗪甲硫酸盐等添加剂以加速反应；Naoghare等人随后将类似的NBT基芯片技术应用于光电二极管阵列微芯片上的高通量抑制剂筛选。此外，还开发了一种基于尿酸酶/过氧化物酶催化的2,2′-偶氮二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐）（ABTS）氧化的传感器系统，通过10分钟后ABTS在410 nm处的吸光度增加来反映XO活性。 **更先进的技术** Liu等人开发了一种超高效液相色谱-三重四极质谱联用方法，使用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑作为H2O2检测的底物，提高了筛选草药XO抑制剂的准确性和速度。Wu等人引入了一种基于毛细管电泳的XO固定化酶微反应器，利用多巴胺/氧化石墨烯膜进行酶固定化，实现了动力学评估和黄酮类抑制剂筛选。还应用了分光光度法测定铜还原抗氧化能力（CUPRAC）；?zyürek等人通过直接测量H2O2和尿酸生成量，并检测多酚介导的Cu(II)-neocuproine试剂的还原来定量XO活性。Ahlam和Mahmoud改进了这种CUPRAC方法，解决了催化酶介导的H2O2降解和多酚类测试化合物的固有还原能力等问题，得到了更简单、更可靠的测定方法，并在多种生物基质中得到了验证。最近，Azeez和Hadwan提出了一种基于TMB-铜离子的催化系统，用于H2O2定量，生成的黄色二亚胺产物在450 nm处可检测到，加入叠氮化钠以防止过氧化氢酶的干扰。该方法表现出高精度和与传统方法的强一致性。 **尽管取得了显著进展，但仍需要易于使用、在可见光范围内工作的测定方法**