《Engineering Microbiology》：Prospects and Challenges in Using Engineered Lactic Acid Bacteria in Aquaculture Applications
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本文系统性评述了基因工程乳酸菌的改造策略与水产应用进展。利用CRISPR/Cas、Red/ET重组等功能性修饰技术，可显著提升工程菌株的靶向递送、环境耐受和益生功能，成功获得可表达病原体抗原的口服疫苗株、高产抗菌肽的抑菌株及降解亚硝酸盐的水质改良株。与野生型相比，这些工程菌株在疾病预防、促生长和环境修复方面展现出更优性能，是推动水产养殖绿色可持续发展的核心解决方案之一。
引言
水产养殖是全球食物系统的关键支柱，为人类提供优质蛋白质，并对减贫、营养和可持续经济发展至关重要。然而，集约化养殖伴随着疾病爆发和环境恶化等持续挑战，抗生素的广泛使用导致了耐药性病原体出现、药物残留和生态系统破坏等问题。因此，开发有效、安全且环保的抗生素替代品迫在眉睫。乳酸菌作为一种水产益生菌，因其多样的有益功能而成为有前途的候选者。
天然乳酸菌在水产养殖中的应用现状
乳酸菌是一类革兰氏阳性细菌，其主要代谢终产物为乳酸，包括乳杆菌属、片球菌属、乳球菌属和双歧杆菌属等。由于其在鱼类促生长、免疫激活、病原拮抗和水质修复等方面的多功能作用，已成为绿色鱼类养殖的核心益生菌。
2.1. 促进消化吸收和生长性能
乳酸菌具有耐酸性，能在鱼类肠道定植并产生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等消化酶，从而增强鱼类的消化吸收能力。其酸性代谢物可改善肠道pH值、菌群组成和消化酶活性，协同优化营养分解并促进鱼类生长。研究证实，乳酸菌不仅能增强消化吸收，还能协同改善肠道结构形态和微生物丰度。
2.2. 增强免疫调节功能
补充乳酸菌作为益生菌，除了改善生长性能和肠道健康外，还能增强免疫反应和疾病抵抗力。口服乳酸菌可通过靶向调节免疫基因表达、增强先天和适应性免疫等方式，提升鱼类的整体免疫状态。乳酸菌还能刺激先天免疫和适应性免疫，通过口服释放细胞因子和免疫刺激肽，增强粘膜免疫力。
2.3. 增强疾病预防和病原生物防治能力
许多乳酸菌菌株对鱼类病原体具有优异的拮抗活性。这种拮抗主要通过分泌抗菌物质和竞争性排斥两种生化机制实现。在肠道环境中，乳酸菌通过竞争生态位和营养物质来阻碍或抑制病原体定植。乳酸菌还产生抗菌肽，直接抑制鱼类病原体的生长，这被认为是生物防治的核心机制。当乳酸菌同时通过生态位竞争和次级代谢物产生作用于病原体时，可表现出更强的抑制活性。
2.4. 改善水产养殖环境
乳酸菌通过间接和直接方式改善鱼类养殖环境。它们通过竞争营养或产生抗菌物质来抑制特定腐败菌和病原体的生长，直接促进水体生物净化。海洋来源的乳酸菌还能通过降低污染物水平和环境压力来直接改善水质。乳酸菌还能竞争性地利用氨氮进行蛋白质合成，从而降低水中游离氨的浓度。
2.5. 天然乳酸菌在水产养殖中应用的瓶颈与挑战
尽管天然乳酸菌菌株在水产养殖中具有广阔应用前景，但其广泛应用仍存在显著瓶颈。首先，天然菌株的益生效果取决于其特定来源和特性，不同来源的菌株在鱼类肠道中的定植能力存在显著差异。其次，天然菌株面临环境稳定性不足的问题。在鱼类养殖过程中，环境条件易受温度、pH和各种胁迫因素波动的影响。尽管乳酸菌可以缓解水质恶化和应激反应，但在极端条件下的功效仍然有限。
乳酸菌的工程化策略
工程化策略可分为三个核心方向：基因编辑策略利用CRISPR/Cas等工具实现高效精确的基因组修饰；功能化策略通过调节基因表达或引入外源功能模块，赋予菌株新功能；安全优化策略侧重于提高工程菌株的生物安全性。
3.1. 基因编辑策略
CRISPR/Cas基因编辑技术最初是作为细菌和古菌的适应性免疫机制被发现的。其介导的适应性免疫包括三个阶段：适应阶段、表达阶段和干扰阶段。随着研究的深入，CRISPR/Cas系统已被广泛应用于基因编辑。然而，其在乳酸菌工程中的应用仍面临多重挑战，包括工具可行性、操作效率和转化应用等方面。
CRISPRi编辑技术是CRISPR/Cas系统的变体，它不切割DNA，而是利用催化失活的Cas9变体与引导RNA结合，特异性结合靶DNA序列，物理阻断转录机制的作用，从而可逆地抑制靶基因的mRNA合成。与传统的CRISPR/Cas9切割系统相比，CRISPRi具有可逆性和特异性等优点。
Red/ET重组技术是一种源自噬菌体的同源重组系统。该技术模拟噬菌体的同源重组机制，通过短同源臂介导线性DNA片段与靶染色体的高效重组，从而实现靶向基因修饰。与依赖RecA蛋白和自杀载体的传统同源重组方法相比，Red/ET重组更灵活、精确和高效。
3.2. 功能工程策略
功能工程策略旨在通过精确的基因修饰，赋予乳酸菌增强的生物学功能或新性状，从而将其转化为高性能的“细胞工厂”或活体生物治疗剂。该方法侧重于通过合理设计代谢网络和遗传电路，深度定制菌株的表型和生理功能。目前，该领域的研究已从工具开发转向特定功能表型的优化，主要集中于高效代谢物合成、增强对复杂环境胁迫的适应性以及生物活性分子的生物合成和递送。
功能工程显著提高了乳酸菌在微生物细胞工厂中的生产能力。通过重塑中心碳代谢途径，研究人员成功实现了目标产物的大量积累。例如，精细调控乳酸脱氢酶基因及其相关调控元件的表达，显著提高了糖酵解效率和底物转化率。
在环境适应性和胁迫耐受性方面，增强菌株在工业发酵和胃肠道转运过程中的生存能力是功能工程的关键目标。利用多组学分析和合成生物学工具，研究人员鉴定并修改了与胁迫响应相关的关键基因，从而显著提高了乳酸菌对酸、胆盐、氧化胁迫和渗透压的耐受性。
工程化的乳酸菌可以合成治疗分子和功能因子，用于生物活性物质合成和医学应用。通过构建人工启动子和遗传电路，这些菌株可以控制抗菌肽、抗氧化剂和抗炎细胞因子等的表达和分泌，从而在食品保鲜和宿主免疫调节中发挥重要作用。
