经过重新设计的具有拓扑刚性的环状DNA酶，可用于多重荧光时间条形码技术

《Chemical Engineering Journal》：De novo-engineered circular DNAzymes with topological rigidity for multiplexed fluorescent-temporal barcoding

　　静生|瑞家登|刘锋|本牛|梅琳贡|双赵|左伟谢|双谢|宇唐|杰罗|景森曹|家琦刘|大勇杨|明陈|凯昌
中国重庆市第三军医大学西南医院临床实验室医学系，400038

摘要：
环状DNA酶（C-Dz）作为一种强大的拓扑催化工具正在崭露头角，但其环形结构与切割动力学之间的相互作用尚未得到充分利用。在这里，我们利用这些拓扑特性开发了一种荧光-时间（FLUO-TIME）条形码平台，称为CLOCK（封闭型环状DNA酶试剂盒），该平台在不需要额外光谱通道的情况下显著提升了多重检测能力。CLOCK采用了一种工程化的C-Dz设计，其中拓扑结构调控了功能分化以实现协同编码：环序列通过杂交实现传统的荧光编码，而环大小则通过拓扑刚性调节催化核心的折叠。这种约束机制控制着切割效率，从而可以通过改变环长度来调节滚环扩增的动态过程。通过结合光谱特征和不同的荧光信号峰值时间，CLOCK生成了多维的FLUO-TIME条形码。AlphaFold3的结构洞察和分子动力学模拟进一步揭示了拓扑约束如何影响C-Dz的酶活性。作为概念验证，CLOCK实现了对四种呼吸道病毒RNA的一锅检测，灵敏度达到了1 fM。通过将时间作为可编程的编码维度，CLOCK为下一代生物传感和多重检测技术提供了一个多功能且可扩展的框架。

1. 引言
分子诊断技术长期以来一直致力于实现高通量检测，而DNA条形码作为一种基于可编程核酸编码架构的解决方案，显著提高了多目标分析的并行性[1]。DNA条形码利用序列可编程的核酸进行分子加密，并通过可寻址的DNA杂交解码特定目标的身份，从而提供序列定义的荧光团用于分子解密[2]。
凭借这些高通量分析能力，DNA条形码已在包括空间分辨的分子谱型分析[3]、[4]、[5]、高通量多目标检测[6]、[7]以及生物多样性保护基因组学[9]、[10]、[11]在内的多个生物医学领域得到广泛应用。然而，光谱重叠和有限的光谱位移会导致干扰误差，限制了基于荧光的DNA条形码的实际编码通道数量[12]，从而缩小了编码能力[13]。为了解决这些限制，人们已经尝试将荧光各向异性与DNA纳米结构工程相结合以实现信号区分[14]，以及利用计算机辅助设计荧光团与DNA自组装来扩展信号[15]。尽管这些技术增强了编码能力[16]，但对一维光谱策略的依赖仍然从根本上限制了多重检测技术的进步。
环状DNA酶（C-Dz）作为线性DNA酶的拓扑衍生物，已被广泛整合到DNA纳米技术中[17]、[18]。值得注意的是，C-Dz具有核酸酶抗性和结构稳定性，同时保留了RNA切割的催化功能[19]、[20]。最近，人们对其应用进行了的一些探索[21]、[22]：曹及其同事利用其催化活性构建了一种RNA引物介导的滚环扩增（RCA）系统，以实现低丰度目标的信号放大，但缺乏对C-Dz本身的功能研究[23]；范及其同事仅将C-Dz作为工具用于细胞内高拷贝数RNA的成像[24]；余及其同事利用C-Dz结构的拓扑屏障效应实现基因沉默，但将C-Dz的功能调控限制在单模模式下，没有对其骨架进行可编程探索[25]。因此，具有结构可编程性和催化可控性的C-Dz在多维生物编码领域尚未得到充分开发。此外，最近在拓扑环状DNA工程方面的进展表明，重新激活的Cas12a整合的自催化系统可以在无需逆转录的情况下实现ctDNA和病毒RNA的亚原子级灵敏度检测[26]。这些发现展示了拓扑DNA工程的潜力。
来自分子电路的动态时间特征构成了生物信息编码的一个未充分利用的维度。滚环扩增（RCA）是一种高效的等温扩增方法[27]，能够产生超高拷贝数，从而提供出色的信号放大保真度和可编程的分子条形码能力[28]，为细胞内分子监测[29]、肿瘤来源的外泌体液体活检[31]、[32]以及癌症诊疗[33]、[34]等突破性应用奠定了基础。尽管基于RCA的荧光编码技术已经成熟，但其内在的时间动态特性却常被忽视。

在这里，我们开发了一种多维FLUO-TIME检测平台，称为CLOCK（封闭型环状DNA酶试剂盒）。CLOCK采用重新设计的C-Dz驱动的RCA，实现两参数FLUO-TIME信号的一步生成。C-Dz的环序列可编程性使其能够通过与不同荧光发夹的特异性杂交实现荧光编码；同时，环大小的调节通过拓扑刚性调控切割效率，进而改变RCA的动力学过程。FLUO-TIME条形码结合了光谱信号（M）和时间信号（N），实现了扩展的多重检测能力（C_N^1×C_M^1）。此外，还应用AlphaFold3进行模型构建以初步阐明Dz/RNA复合物的结构。分子动力学模拟显示，环形拓扑通过形成更紧凑的结构对增加碱基堆叠（尤其是π-π键）来提高催化效率。最终，CLOCK实现了对四种呼吸道病毒RNA的一锅检测，检测限为1 fM，展示了良好的临床诊断性能。总体而言，CLOCK为下一代多重分子诊断技术建立了一个可扩展的框架。

2. 结果与讨论
2.1. CLOCK检测平台的FLUO-TIME DNA条形码分析
DNA条形码建立了标记的短DNA序列与生物学信息之间的对应关系，通过预定义的序列编码和信号解码机制实现复杂样本中多个目标的并行识别。然而，静态DNA条形码不可避免的光谱重叠问题尚未得到解决。因此，我们开发了一种使用具有工程化功能基元的封闭型环状DNA酶的检测方法，如图1A所示，该方法展示了增强的时间编码特性。人工设计的C-Dz包含检测臂、DNA酶催化核心、荧光编码（FLUO）模块和时间识别（TIME）模块。FLUO条形码由一系列锁形探针组成。通过调节Poly-T长度的TIME条形码，可以工程化C-Dz的RNA切割效率。进一步的RCA介导扩增通过引入具有不同RCA动力学特性的荧光编码实现正交编码，扩增过程通过荧光通道读取。累积的荧光曲线绘制了双重FLUO-TIME条形码输出。FLUO和TIME参数最终解码了初始输入的靶标RNA（图1A）。时间尺度可以与荧光维度正交结合，形成多维FLUO-TIME DNA条形码（图1B）。我们将该系统应用于多重呼吸道病毒检测（图1C）。工作流程从采集鼻咽拭子以提取病毒RNA开始。CLOCK加密的靶标RNA用于信号编码，随后进行RCA反应以获得FLUO-TIME条形码输出。CLOCK为高通量靶标检测提供了一个稳健且多功能的平台，成为下一代多重检测的新颖高维度DNA条形码。

2.2. C-Dz的尺寸依赖性催化效率
为了研究不同尺寸C-Dz的催化活性，我们通过改变DNA骨架中的Poly(T)间隔长度，制备了间隔长度从10 nt到60 nt的C-Dz样品（间隔长度以10 nt为增量）。通过DNA酶回收实验分析了C-Dz的切割活性（图2A）。成功制备了六种C-Dz并通过12%PAGE验证了其活性（图2B）。然而，逐渐延长的Poly(T)间隔对C-Dz切割活性的影响尚不明确。为此，我们使用FAM-BHQ1标记进行了差异时间反应，检测了C-Dz对靶标RNA的切割活性。PAGE分析确认了切割活性随间隔长度的增加而减弱：具有20 nt Poly(T)间隔的C-Dz在60分钟内实现了超过80%的底物切割，而较长的间隔（40 nt和50 nt）则需要大约120分钟，显示出与间隔延长相关的2倍时间延迟（图2C、D和补充图S1）。时间过程凝胶电泳显示切割活性随间隔长度的增加而减弱，10 nt和20 nt的较短Poly(T)间隔具有快速切割特性，而超过40 nt的较长间隔则表现出延迟动力学（图2C、D和补充图S1）。为了明确T间隔依赖的C-Dz活性调控机制，我们将所有反应标准化为统一的一小时终点，以便直接进行平行比较。在该固定时间下的PAGE分析再现了时间过程实验中观察到的间隔长度依赖的活性梯度（图2E）。此外，为了通过酶动力学量化半定量PAGE观察结果，我们计算了在标准化动力学条件下的切割底物浓度和最大反应速率（Vmax）。通过对荧光团-淬灭剂进行标记，计算了C-Dz在不同底物浓度下的切割底物浓度（补充图S2）。荧光强度与切割组和非切割组之间的强线性相关性使得实时荧光曲线可以直接转换为切割进度曲线（补充图S3）[35]。如图2F所示，在0.0195–0.156 μM的底物浓度范围内，切割动力学显示出最小的偏差。当底物浓度超过0.625 μM时，具有20 nt Poly(T)间隔的C-Dz的转化速率比其他C-Dz组高出1.3至1.7倍，表明了尺寸依赖的催化优势（图2F）。此外，20 nt Poly(T) C-Dz的计算最大反应速率（Vmax）几乎是其他变体的两倍。随着间隔长度的延长，Vmax逐渐降低，在超过40 nt时达到动力学平台（图2G）。这些结果表明了切割活性的尺寸依赖性调控。这一观察机制将催化效率与C-Dz的拓扑结构联系起来。

2.3. 拓扑刚性结构对C-Dz催化活性的影响
接下来，我们系统研究了构象受限拓扑对C-Dz催化活性的影响，并与线性DNA酶（L-Dz）进行了比较，包括核酸酶抗性、反应动力学和结构建模机制[36]、[37]。凝胶电泳显示，C-Dz在大约两小时后仍然保持完整，而L-Dz在15分钟内显著降解，表明在富含核酸酶的条件下，环形拓扑具有更高的结构稳定性（补充图S4A）。为了定量评估催化活性的差异，我们使用相同的荧光团-淬灭剂报告试剂进行实时切割动力学监测，从而准确比较了C-Dz和L-Dz的性能（补充图S4B）。最终产物和对照组使用12% PAGE进行分析，结果显示C-Dz的RNA切割效率几乎与标准L-Dz相当（补充图S4C）。我们系统比较了具有相同参数的工程化C-Dz和L-Dz结构，这些C-Dz和L-DZ的Poly(T)间隔长度分别为10 nt、20 nt和30 nt，以探讨拓扑结构对催化功能的影响（图3A）。然后使用结合了荧光团-淬灭剂（FQ）修饰的底物RNA计算了L-Dz和C-Dz组的催化效率（kcat/KM）。与L-DZ相比，C-DZ在 spacer延长条件下仍保持了稳健的切割活性，显示出更高的结构耐受性。特别是在30 nt Poly(T)长度时，C-DZ的催化效率是L-DZ的两倍（图3B）。同时，动力学分析显示，C-DZ的最大反应速率（Vmax）随着T间隔长度的增加而提高了1.1至2.6倍（图3C）。总体而言，全面的动力学分析表明，在浓度梯度范围内，C-Dz 的底物周转率显著高于 L-Dz，在饱和条件下提高了 1.4 倍（图 3D，补充图 S2 和 S5）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像。图 3. C-Dz 在催化活性上的结构刚性优势 (A) C-Dz 和 L-Dz 的示意图，均经过了 poly(T) 的修饰。(B) C-Dz 和 L-Dz 的动力学参数比较。用于估计动力学参数的 DNAzyme 浓度均为 100 nM。顶部的三个图表显示了初始速率/DNAzyme 浓度 (V0/[E]) 与 RNA-FQ 底物浓度的关系。红色曲线代表 C-Dz 引发的反应，蓝色曲线代表 L-Dz 引发的反应。kcat/KM 值以平均值 ± 标准差 (n = 3 次独立实验) 表示。(C) C-Dz 和 L-Dz 组之间的最大反应速率比较。数据以平均值 ± 标准差 (n = 3 次独立实验) 表示。星号表示显著性水平：p > 0.05 (ns)，p < 0.05 (*)，p < 0.001 (***)。(D) 被切割的底物浓度图。左图：C-Dz 和 L-Dz 与 10-nt poly(T)；中图：C-Dz 和 L-Dz 与 20-nt poly(T)；右图：C-Dz 和 L-Dz 与 30-nt poly(T)。(E) 左图：20-nt poly(T) C-Dz/RNA 复合物的结构模型。中图：G-G 切割位点附近的键。右图：全局 pi-pi 键。板岩蓝表示 C-Dz 分子；品红色表示 RNA 分子。绿色虚线表示氢键。黄色虚线表示 pi-pi 相互作用。(F) 左图：30-nt poly(T) C-Dz/RNA 复合物的结构模型。中图：G-G 切割位点附近的键。右图：全局 pi-pi 键。板岩蓝表示 C-Dz 分子；品红色表示 RNA 分子。绿色虚线表示氢键。黄色虚线表示 pi-pi 相互作用。(G) 左图：20-nt poly(T) L-Dz/RNA 复合物的结构模型。中图：G-G 切割位点附近的键。右图：全局 pi-pi 键。板岩蓝表示 C-Dz 分子；品红色表示 RNA 分子。绿色虚线表示氢键。黄色虚线表示 pi-pi 相互作用。(H) 左图：30-nt poly(T) L-Dz/RNA 复合物的结构模型。中图：G-G 切割位点附近的键。右图：全局 pi-pi 键。板岩蓝表示 C-Dz 分子；品红色表示 RNA 分子。绿色虚线表示氢键。黄色虚线表示 pi-pi 相互作用。(I) 四种 Dz/RNA 复合物的结合自由能。VDW：范德华能项；EEL：静电能项；EGB：极性溶剂化能；SURF：非极性溶剂化能；GGAS：分子力学项（气相中的能量），GGAS = VWD + ELE；SOLR：溶剂化能，SOLR = EGB + ESURF；TOTAL：总结合自由能，TOTAL = GGAS + GSOLV。为了阐明催化效率差异的结构基础，我们使用 AlphaFold3 建模预测了具有扩展 poly-T 间隔物（20-nt 和 30-nt）的 C-Dz/RNA 和 L-Dz/RNA 复合物的三级结构（补充图 S6）。随后对 AlphaFold3 预测的结构进行分子动力学模拟，以评估构象稳定性和结合能。对 Dz-底物复合物的定量键长分析显示，C-Dz/RNA 结构中的 pi-pi 堆叠相互作用增强，其在催化切割位点（5′-rGrG-3′）以及整个 RNA–DNA 杂合双链中都有优化的碱基堆叠几何结构（图 3E–H，补充表 S2–6）。与 L-Dz/RNA 复合物相比，C-Dz/RNA 复合物形成了更多的氢键和 pi-pi 堆叠相互作用，表明环形拓扑结构对催化核心施加了构象约束（图 3E–H，补充表 S2）。值得注意的是，尽管 +20 nt 的 C-Dz/RNA 复合物的总 pi-pi 相互作用比 +30 nt 变体少，但它形成了更多的氢键，从而形成了更紧凑的活性位点，使得 RNA 结合更紧密（补充表 S2）。分子动力学模拟显示，与 L-Dz 相比，C-Dz 的构象收敛速度更快，这一点通过均方根偏差 (RMSD) 分析得到证实（补充图 S6）。20-nt (T) 的 C-Dz 形成了一个紧凑的闭合环，强加了空间约束，限制了构象波动，产生了具有低 RMSD 的稳定折叠状态。相比之下，30-nt (T) 的 C-Dz 使环延长，减少了这些拓扑约束（补充图 S6 G, H）。这种快速稳定可能反映了 C-Dz 在 RNA 识别过程中受限的构象自由度，从而提高了 RNA 切割速度。此外，通过 MM/PBSA 分解结合自由能显示 C-Dz 的 RNA 结合亲和力优于 L-Dz（图 3I，补充表 S7–10）。30-nt (T) 的 C-Dz 的 RMSD 值显著更高，表明其构象稳定性显著低于 20-nt (T) 的 C-Dz（补充图 S6）。C-Dz 的环形拓扑结构锁定了检测臂、催化核心和 poly(T) 间隔物的相对空间排列，保持了预组织的、具有催化能力的构象。此外，闭合环促进了催化核心内部以及核心与 RNA 底物之间的分子内碱基堆叠、氢键和 pi-pi 相互作用（补充表 S2–S6）。相比之下，L-Dz 的自由端允许随机构象波动，导致催化核心频繁错位，降低了底物结合效率。值得注意的是，增加环的大小可能会导致拓扑骨架的灵活性，从而影响催化活性。

2.4. 依靠刚性调节的 C-Dz 切割活性实现的 TIME 条码
由于 poly(T) 间隔物的长度直接影响催化切割动力学，我们认为这种大小依赖的拓扑调控能够实现 RCA 启动时间的不同延迟编程。因此，我们设计了一系列具有不同 poly(T) 长度的 C-Dz 变体作为 TIME 条码，使得不同的切割动力学转化为 RCA 放大后可区分的到达峰值时间信号。为了实现这一设计，我们从头构建了具有双功能区域的 C-Dz：一个荧光编码块和一个时间标识信息块（TIME）区域（图 4A）。环序列通过特异性杂交实现荧光编码，环的大小调节切割效率，从而通过 RCA 反应实现时间编码。首先，上游的 5′-切割产物在 3′ 端含有 2′, 3′-环状磷酸基团，这可能会降低 RCA 的效率 [23]。因此，使用 T4 Polynucleotide Kinase (PNK) 进行去磷酸化处理，在 3′ 端生成羟基。我们使用凝胶电泳验证了 C-Dz 触发的 RCA，并通过实时荧光和 12% PAGE 分析确认了这一策略（补充图 S7）。此外，优化的实验条件实现了最佳的 RNA 引发 RCA 性能（补充图 S8）。荧光编码块被设计为与带有荧光团的发夹探针互补，而 TIME 块包含 poly-胸腺嘧啶 (T) 序列以实现时间延迟。在识别 RNA 目标后，C-Dz 在 Mg2+ 存在下特异性结合并催化切割目标，从而在 RNA 上产生新的 3′ 端，触发 RCA 反应，生成时间信号。通过不同的 TIME 长度获得了不同的 RCA 动力学（补充图 S9A）。

下载：下载高分辨率图像（674KB）下载：下载全尺寸图像。图 4. 依靠刚性调节的 C-Dz 切割活性实现的 TIME 条码。(A) 从线性 DNAzyme 到具有荧光编码区域（用于荧光条形码）和时间标识信息区域（用于 TIME 条码）的圆形模板的功能性人工 C-Dz 构造示意图。(B) C-Dz 中插入的四种 TIME 长度的方案：TIME-10 含有 10 nt T 基因，TIME-20 含有 20 nt T 基因，TIME-30 含有 30 nt T 基因，TIME-40 含有 40 nt T 基因。(C) 用累积分布函数 (CDF) 对原始荧光曲线进行伽马分布拟合。(D) 从荧光强度随时间的导数获得的伽马拟合的概率分布函数 (PDF)，绘制出随时间变化的瞬时强度变化图，其中形状参数 (α) 和尺度参数 (β) 通过 MATLAB 计算，以确定原始荧光曲线达到峰值的理论 ΔT。(E) 四种 TIME 生成的四种荧光曲线的伽马拟合 PDF，用于计算理论上的到达峰值时间。(F) 四种调节 TIME 的不同到达峰值时间。平均值 ± 标准差，n = 3。星号表示显著性水平：p < 0.01 (**)，p < 0.001 (***)，p < 0.0001 (****)。(G) 通过调节 TIME 块长度在功能性 C-Dz 中构建 TIME 条码的示意图。

此外，为了证明 TIME 条码的可行性，我们设计了四种不同长度的 TIME：TIME-10 含有 10-nt poly(T)，TIME-20 含有 20-nt poly(T)，TIME-30 含有 30-nt poly(T)，TIME-40 含有 40-nt poly(T)（图 4B）。进行了 12% PAGE 分析，以比较每种 TIME 编码的 C-Dz 与 L-Dz（补充图 S9B）。我们选择伽马分布来拟合 RCA 的实时荧光曲线，基于三个关键理由：生物学相关性、拟合精度和参数可解释性。接下来，使用自定义的 MATLAB 代码分析原始荧光曲线并将其拟合到伽马分布，以便进行更详细的解释（图 4C）。记录了实时荧光曲线，并直接使用原始荧光轨迹进行伽马分布拟合（补充图 S9C）。伽马分布由两个参数组成：形状参数 (α) 和尺度参数 (β) [38]。先前的研究已经使用伽马分布对时间编码检测的动力学曲线进行了分析，表现出出色的曲线拟合性能。原始荧光信号随时间的累积分布函数 (CDF) 被转换为概率密度函数 (PDF)（图 4D）。根据这两个参数，计算出的分布中概率最低的时间是原始荧光曲线的理论峰值时间。这种拟合准确反映了 RCA 放大曲线的动态，因此对应于通过编码 C-Dz 中 TIME 块长度调节的切割效率。最终，目标通过到达峰值时间解码。先前的研究已经验证了 DNA 聚合酶和 dNTP 浓度是能量和速率限制因素，因此我们优化了 phi29 DNA 聚合酶和 dNTPs 的反应条件（补充图 S10）[38]。使用 5 U 的 phi29 DNA 聚合酶和 1 mM dNTPs 获得了两个到达峰值信号之间的最佳相对宽度比，这是在后续实验中使用的。然后，使用 MATLAB 代码计算每个 TIME 到峰值的时间，生成具有 α 和 β 参数的 PDF 曲线（图 4E）。每个组中 poly(T) 的长度都调节了到达峰值的时间，且这些值具有显著性（图 4F）。在 phi29 DNA 聚合酶和 dNTPs 的量相对于引物充足的情况下，放大过程遵循零阶动力学。如补充图 S11 所示，不同浓度的单独目标在插入不同 TIME 区域时表现出相同的延迟时间和可区分的荧光强度变化。最后，带有 TIME 块的功能性 C-Dz 能够通过 RCA 放大累积时间差，构建 TIME 条码（图 4G）。

2.5. 基于双重功能工程化 C-Dz 的多维 FLUO-TIME 条码
为了实现多维编码，我们将 DNA 序列的可编程性与环大小的可调节性结合起来，构建了一个多维 FLUO-TIME 动态条形码。通过发夹结构 DNA 序列的环形域的可编程设计，结合荧光团-淬射剂 (FQ) 标记，可以实现荧光条形码。同时，TIME 块 (N) 的可调长度与可设计的荧光团相结合，用于光谱区分（M）和正交扩展的 N×M 编码能力（图 5A）。为了展示正交编码的潜力，我们证明了结合四种荧光团和四种 TIME 长度可以生成 16 种可区分的条形码组合（图 5B，补充图 S12）。这一结果表明，正交编码策略具有可扩展性、易于编程性和巨大的指数编码潜力。同时，在四种荧光信号实验中，相同的 TIME 长度下的 TIME 到峰值值没有统计学上的显著差异（图 5C）。模块化设计允许通过添加额外的 TIME 长度或荧光团进行进一步扩展。在这项研究中，我们验证了 4 种 TIME 长度和 4 种荧光团的检测方法，理论上可以实现多路复用能力（通过这种正交双向 FLUO-TIME 条码）。

下载：下载高分辨率图像（463KB）下载：下载全尺寸图像。图 5. 基于双重功能工程化 C-Dz 的多维 FLUO-TIME 条码。(A) FLUO-TIME 条码构建的示意图。荧光比例和 TIME 比率的乘积导致条形码的扩展。(B) FLUO-TIME 编码能力分析。四种类型的荧光团与四种 TIME 长度正交结合，产生 16 种代码。FAM：EXmax = 494 nm，EMmax = 518 nm；HEX：EXmax = 535 nm，EMmax = 556 nm；Texas Red：EXmax = 595 nm，EMmax = 615 nm；Cy5：EXmax = 643 nm，EMmax = 667 nm。(C) 通过放大累积时间差获得的四种荧光团的每个 TIME 到峰值时间。平均值 ± 标准差，n = 3。星号表示显著性水平：p > 0.05 (ns)。

2.6.FLUO-TIME条形码用于呼吸病毒的多重检测
呼吸道病毒感染的高发期通常由多种病毒引起。我们之前曾使用简单的荧光编码发夹结构实现对四种呼吸道病毒（H1N1流感、B型流感、呼吸道合胞病毒和人类鼻病毒）的多重检测，取得了相对良好的灵敏度和线性检测范围（补充图S13）。然而，这种一次检测方法只能同时检测四到五种目标病毒。我们进一步探索了将C-Dz与FLUO-TIME条形码结合使用，以实现多种呼吸道病毒的同时按需检测。

在我们的设计中，通过简单地增加或减少相应C-Dz中的T碱基数来实现多重检测（图6A）。我们调制了四种对应于不同呼吸道病毒的TIME序列，这些TIME序列在达到峰值的时间上存在显著差异（图6B），并使用MATLAB计算了准确的达到峰值的时间码（补充图S14）。通过凝胶电泳验证了不同长度的C-Dz的成功制备（图6C）。接着，我们使用伪病毒（H1N1、FLUB、RSV和HRV）作为样本提取目标RNA以验证概念的可行性（补充表S11）。标准化的反应条件减少了样本矩阵带来的变异性。此外，使用具有稳健参数估计的伽马分布拟合进一步防止了单个样本的随机动力学波动。首先，我们验证了四种目标RNA的RCA过程顺利进行并产生了大的片段产物（补充图S15）。如图6D所示，结果表明，每种目标RNA的检测灵敏度都很高，低至1 fM，并且具有良好的线性回归R2值。不同目标RNA组的达到峰值的时间也清晰可辨，且在不同浓度下没有差异（补充图S16）。然后，我们将每个目标RNA组的浓度设置为不同的值，以验证荧光信号与金标准方法——逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的一致性（图6E）。通过C-Dz RCA计时器检测的四种目标RNA的水平与RT-PCR检测的结果高度一致。

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图6. FLUO-TIME条形码用于呼吸道病毒的多重检测。
（A）四种目标RNA（H1N1、FLUB、RSV和HRV）的TIME调制示意图，用于编码时间条形码以解码信号，其中插入了四种不同长度的TIME序列（TIME 15、TIME 30、TIME 45和TIME 65）。TIME数字指的是插入C-Dz模板中的poly(T)的数量。
（B）通过放大四种调制TIME序列的累积时间差来区分达到峰值的时间。平均值±标准差，n=18。星号表示显著性水平：p<0.0001（**），p<0.01（**）。
（C）凝胶电泳验证成功制备了具有不同TIME序列的四种C-Dz。
（D）从伪病毒样本中提取的目标呼吸道病毒RNA的检测结果。
TIME 15—H1N1：Y=28.35×+573.6，相关系数（R2）=0.9468，检测限（LOD）=1.58 fM；
TIME 30—FLUB：Y=51.35×+902.9，R2=0.9623，LOD=0.480 fM；
TIME 45—RSV：Y=42.31×+774.3，R2=0.9746，LOD=1.89 fM；
TIME 65—HRV：Y=34.64×+752.0，R2=0.9420，LOD=6.19 fM。平均值±标准差，n=3。星号表示显著性水平：p<0.001（***），p<0.01（**），p<0.05（*），p>0.05（ns，无显著性）。
（E）CLOCK平台与金标准方法RT-PCR在H1N1、FLUB、RSV和HRV检测上的一致性：R2分别为0.9606、0.9517、0.9712和0.9919。平均值±标准差，n=30。
（F）临床应用示意图，从鼻咽拭子采集到RNA提取，再到使用CLOCK平台进行多重时间条形码读取。
（G）CLOCK检测临床样本中的H1N1、FLUB、RSV和HRV病毒感染情况：
H1N1：100个阴性样本和100个阳性样本；
FLUB：20个阴性样本；
RSV：20个阴性样本和20个阳性样本；
HRV：20个阴性样本和20个阳性样本。星号表示显著性水平：p<0.0001（****）。
（H）CLOCK平台在四种呼吸道病毒诊断中的临床效果评估，其临床状态已得到确认：
H1N1：100%灵敏度和99%特异性；
FLUB：100%特异性；
RSV：100%灵敏度和85%特异性；
HRV：100%灵敏度和85%特异性。

为了证明我们平台在实际应用中的可行性，我们通过鼻咽拭子收集临床样本，并提取目标RNA序列进行检测，而不是使用模拟样本，同时使用CLOCK作为时间条形码读数系统（图6F）。在样本收集期间，H1N1的广泛传播抑制了FLUB的传播，导致该队列中没有FLUB阳性的临床样本。所有300个样本均通过RT-qPCR的金标准方法进行了临床验证，并报告给临床部门。临床队列包括100个H1N1阳性和100个H1N1阴性样本，以及20个FLUB阴性、20个RSV阳性、20个RSV阴性和20个HRV阳性、20个HRV阴性样本，反映了这些呼吸道病毒在临床环境中的流行情况。CLOCK通过要求特定的目标识别和Mg2+激活的切割来产生3′末端，从而防止了错误的RCA启动，其环形拓扑结构还能抵抗核酸酶的降解（补充图S4A）。非特异性核酸片段无法触发这一过程。接下来，我们使用CLOCK检测了所有300个拭子样本，结果显示阳性组和阴性组之间存在显著差异（p<0.0001）（图6G）。CLOCK检测显示能够通过不同的荧光通道检测多种呼吸道病毒。与标准临床结果相比，CLOCK的临床灵敏度和特异性分别为H1N1的100%和99%、RSV的100%和85%、HRV的100%和85%，以及FLUB的100%特异性，证明了该系统在临床检测中的卓越性能（图6H）。假阳性可能是由于CLOCK检测的高灵敏度造成的，它会在临床RT-qPCR判定为阴性的样本中检测到阳性荧光信号，导致RSV、HRV和H1N1的诊断特异性有所不同。

总之，这项工作展示了CLOCK在临床应用中的高性能及其检测大规模目标的能力。

3. 结论
FLUO-TIME条形码的正交策略提供了一个可扩展的框架，可以加入额外的荧光团和TIME模块来提高多重检测能力。虽然本研究验证了4重检测格式，但该架构理论上可以支持更广泛的特定诊断应用。这一创新的核心在于从头工程化C-Dz的拓扑结构，并调节T间隔区长度以调控RNA切割效率。闭环可编程性将DNA酶的效率与扩增动态联系起来，实现确定性的时间控制。AlphaFold3和分子动力学模拟提供了对拓扑调控催化活性的计算视角，但无法完全模拟生理环境或与冷冻电子显微镜获得的高分辨率结构相媲美。我们准备了对比表（补充表S12），总结了现有多重检测方法的关键特征。这项工作建立了一个闭环流程，整合了拓扑工程化的C-Dz设计、机制驱动的动力学编程以及经过临床验证的FLUO-TIME条形码技术，重新定义了可扩展的分子多重检测方法。

此外，这一时间上的突破为空间多组学映射方面的变革性应用铺平了道路，特别是在解析细胞内动态分子相互作用方面。通过将FLUO-TIME条形码与空间转录组学结合，CLOCK可以在亚细胞水平上追踪转录异质性和细胞间信号动态。进一步将当前的双参数时间-荧光条形码扩展为三参数空间-时间-荧光条形码，可以实现多重分子/profileing的指数级扩展。除了体内成像之外，这种工程化的C-Dz架构作为一种自给自足的基因编辑工具具有无可比拟的潜力。其构象锁定的催化核心提高了RNA切割效率，而环形拓扑结构则赋予了抗核酸酶能力和延长的细胞内稳定性。这些特性使工程化的C-Dz成为基因调控应用中的有力工具。

这项工作结合了DNA纳米技术、DNA酶工程和动态信号控制的最新进展，克服了基于荧光的多重检测中的维度限制。CLOCK通过将静态DNA条形码转化为可编程的动态解码方法，重新定义了分子诊断的高度。未来的工作将集中在早期癌症诊断和CRISPR-C-Dz混合系统的体内基因编辑上。同时，结合机器学习辅助的条形码解码和微流控检测技术，可能最终实现无需实验室的即时检测。我们相信，CLOCK平台的多元化潜力将在不久的将来实现可扩展的分子分析和临床诊断。

**作者贡献声明**
盛静：写作——审稿与编辑、初稿撰写、概念构思；
邓瑞佳：正式分析；
刘峰：数据管理；
牛斌：实验研究；
龚梅琳：方法学设计；
赵双：项目协调；
谢卓伟：软件开发；
谢双：数据可视化；
唐宇：方法学设计；
罗杰：验证；
曹建森：数据可视化；
刘佳琪：数据管理；
杨大勇：监督；
陈明：监督与资金争取；
常凯：写作——审稿与编辑、监督。

**资助**
本项目部分得到了国家重大科学技术项目（2025ZD0551200）、国家自然科学基金（82372352、U23A20477、82122042）、重庆市杰出青年科学基金（CSTB2022NSCQ-JQX0007）和重庆市医学科学研究重大项目（2025DBXM004）的支持。