《BMC Veterinary Research》：CRISPR/Cas12a-assisted visual and on-site detection of porcine circovirus type 2
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【编辑推荐】为解决猪圆环病毒2型（PCV2）现场快速诊断难题，研究人员开发了一种结合重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a的新型核酸检测方法。该方法靶向PCV2的Cap和Rep基因保守区，在37°C下1小时内完成检测，灵敏度达10拷贝/μL，且与其他猪病毒无交叉反应。该研究利用快速释放试剂替代传统DNA提取，实现了血清样本的高效现场检测，其结果与PCR高度一致，为猪场疫病防控提供了简便、快速、高灵敏度的现场诊断新工具。
在养猪产业中，猪圆环病毒2型（PCV2）是一种全球流行的病原体，会导致猪只免疫抑制，进而引发猪圆环病毒相关疾病，如断奶仔猪多系统衰竭综合征，给行业带来巨大的经济损失。控制该病传播的关键在于早期、准确的诊断。然而，传统的实验室诊断方法，如聚合酶链式反应，虽然灵敏特异，但通常需要精密的设备、专业的操作人员和较长的检测周期，难以满足养殖场现场即时、快速的检测需求。近年来，一种名为CRISPR（规律间隔成簇短回文重复序列）的基因编辑技术，其核心成员Cas12a蛋白被发现在靶向切割特定DNA序列后，会被激活并“误伤”周围的其他单链DNA分子，这种“附带切割”活性使其在核酸检测领域展现出巨大潜力。将其与另一种能在恒定低温下快速扩增核酸的重组酶聚合酶扩增（RPA）技术结合，便构成了快速、便捷核酸检测的新策略。正是为了解决猪场一线对PCV2现场快速诊断工具的迫切需求，研究人员开展了这项旨在建立一种RPA-CRISPR/Cas12a辅助的、可实现可视化及现场检测PCV2新方法的研究，其成果发表在《BMC Veterinary Research》上。
为开展此项研究，研究人员应用了几个关键的技术方法。首先，采用了重组酶聚合酶扩增，在37°C恒温下对样本中的PCV2 DNA进行快速等温扩增。其次，设计并优化了靶向PCV2 Cap和Rep基因保守区的CRISPR RNA。之后，利用激活后的Cas12a蛋白切割单链DNA-荧光基团-淬灭基团报告分子，通过荧光检测或肉眼观察产生信号。此外，研究使用了快速释放试剂处理临床血清样本，以替代传统复杂的DNA提取步骤，简化了现场操作流程。临床样本来源于实际检测，用于验证所建立方法的可靠性。
结果
针对PCV2 Cap和Rep基因保守区设计并优化了crRNA
研究人员成功设计并优化了靶向猪圆环病毒2型（PCV2）衣壳蛋白基因和复制酶基因保守区域的CRISPR RNA序列，为后续特异性识别奠定了基础。
建立了RPA-CRISPR/Cas12a检测体系，可在37°C下1小时内完成检测
通过将RPA扩增与CRISPR/Cas12a检测相结合，建立了一套完整的检测流程。整个反应在37°C的单一温度下进行，从样本处理到结果读出可在1小时内完成，体现了快速简便的特点。
检测体系灵敏度达到10拷贝/微升，且与其他主要猪病毒无交叉反应
通过对系列稀释标准品的检测，该方法的检测限低至10拷贝/微升，显示出高灵敏度。同时，检测体系对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒等其他常见猪病毒样本的检测结果均为阴性，证明了其高度特异性。
使用快速释放试剂处理血清样本，实现了免DNA提取的现场检测
研究采用了一种快速释放试剂直接处理临床血清样本，省去了耗时的传统DNA提取步骤，极大简化了前处理流程，使该方法更适用于资源有限的现场环境。
临床样本验证结果与PCR方法高度一致
使用临床血清样本对该检测方法进行验证，并将其结果与常规PCR方法的检测结果进行对比。结果显示，两种方法的结果具有高度一致性，证实了本研究所建立方法的临床检测可靠性。
结论与讨论
本研究成功开发了一种基于RPA与CRISPR/Cas12a的新型检测方法，用于猪圆环病毒2型的快速、灵敏、特异检测。该方法的核心优势在于其“快”、“简”、“灵”。“快”体现在整个检测过程仅需1小时，且为恒温反应，无需复杂的PCR热循环仪；“简”体现在通过快速释放试剂简化了样本前处理，并可实现荧光仪检测或肉眼可视读结果，大大降低了对专业设备和人员的依赖；“灵”则体现在其检测灵敏度高达10拷贝/微升，并且与其他猪病毒无交叉反应，确保了结果的准确性。临床样本验证结果与金标准PCR方法的高度一致性，进一步佐证了其可靠性。
综上所述，这项研究为解决猪圆环病毒2型现场快速诊断的难题提供了一个极具应用前景的解决方案。该方法将先进的CRISPR诊断技术与现场适用的RPA扩增及样本处理技术相结合，构建了一个完整、高效的现场检测平台。它不仅为猪场一线人员提供了强有力的早期疫情监测工具，有助于及时采取防控措施，减少经济损失，也为其他动物疫病乃至人类传染病的现场快速分子诊断提供了可借鉴的技术思路，在生命科学和公共卫生领域具有重要的实践意义和推广价值。
