一种基于NiMn2O4催化的DHNP荧光团转化的、稳健的双读数比率测定方法，用于检测多巴胺

《RSC Advances》：A robust dual-readout ratiometric assay for dopamine based on NiMn2O4-catalyzed DHNP fluorophore conversion

　　多巴胺（DA）是一种与神经系统疾病的发生和发展密切相关的关键生物标志物，通过使用双酶模拟的NiMn2O4纳米花实现了对其的灵敏量化。这种纳米酶同时表现出过氧化物酶和氧化酶样的活性，催化DA与1,3-二羟基萘（DHNP）之间的高度选择性环化反应。随着DA浓度的增加，DHNP在440纳米处的固有荧光逐渐被抑制，同时形成了一种新的光学活性荧光团，其发射波长为485纳米，相应的吸收波长为455纳米。这种双模式比率荧光-比色传感策略实现了自我校准的检测，有效减少了信号波动和基质干扰。该平台在0–250微摩尔的范围内表现出优异的线性，能够准确、灵敏且选择性地测定DA。由于其稳健性和可靠性，所提出的方法非常适合于在各种生物样本基质中进行高通量多巴胺分析。

3.1 特性分析

扫描电子显微镜（SEM）分析证实了NiMn2O4纳米酶形成了由径向排列的纳米片组成的结构（图S1A）。这种分层结构提供了较大的暴露表面积和大量的可访问催化位点。粒径分析显示粒径分布在285至315纳米之间，平均直径为297.7 ± 3.21纳米（图S1B），表明形态上的均匀性良好。这种结构有序且均匀的纳米结构有利于电子的快速传输和反应物的有效质量扩散，共同促进了NiMn2O4纳米酶所观察到的显著过氧化物酶模拟活性。图S1C展示了合成材料的EDX光谱，确认了Ni、Mn和O是主要组成元素。XRD图谱证实了NiMn2O4纳米酶的良好结晶性质（图S1D）。衍射谱在2θ值为19.6°、28.9°、34.2°、43.8°、56.5°和63.4°处显示了一系列清晰明确的反射峰，这些峰分别对应于（111）、（220）、（311）、（400）、（511）和（440）晶面。这些衍射特征与标准尖晶石NiMn2O4相（JCPDS编号71-0852）非常吻合，34证实了纯度高且结晶度高的混合金属氧化物结构的成功形成。傅里叶变换红外光谱（FTIR）进一步验证了NiMn2O4纳米酶的成功制备，通过显示纳米催化剂的特征振动模式（图S1E）。在3380 cm?1和1640 cm?1处出现的宽吸收带分别归因于表面吸附水分子的O–H伸缩和弯曲模式。35在指纹区域，780 cm?1和670 cm?1处出现的明显带分别被分配给八面体位点的Mn–O振动和四面体位点的Ni–O振动。这些金属–氧伸缩模式与NiMn2O4的典型尖晶石晶格非常吻合，证实了混合金属氧化物框架的成功建立。34

NiMn2O4纳米酶的拉曼光谱显示了尖晶石晶格的特征振动模式（图S1F）。在648 cm?1处观察到的强烈A1g模式归因于MnO6八面体内的对称Mn–O伸缩振动，而545 cm?1处的带对应于与Ni–O伸缩相关的F2g模式。这些拉曼特征进一步证实了尖晶石NiMn2O4框架的形成，并与XRD分析得到的相鉴定结果一致。35

通过XPS分析阐明了NiMn2O4纳米酶的表面元素组成和氧化态（图1）。扫描和高分辨率光谱确认了O 1s、Mn 2p和Ni 2p信号的存在，验证了所有组成元素的成功掺入（图1A）。高分辨率的O 1s光谱（图1B）可以分解为两个成分，分别位于542.6和545.4 eV的结合能，这些成分被分配给与表面吸附的水和氧化物晶格内的金属–氧（M–O）键相关的H–O–H物种。36这些特征反映了晶格氧和表面氧物种的共存，这在过渡金属氧化物纳米酶中是常见的。图1C显示Ni 2p峰位于856.1 eV（2p3/2）和873.3 eV（2p1/2），其自旋能量分离约为18 eV，与Ni2+物种一致。858.7和868.9 eV处的卫星峰进一步证实了这一分配。37在图1D中，Mn 2p峰分别位于643.3和654.3 eV，对应于Mn 2p3/2和Mn p1/2。38

图1

（A）NiMn2O4纳米酶的完整XPS扫描；（B–D）分别是O 1s、Ni 2p和Mn 2p的分解光谱。

3.2 动力学分析

为了定量评估NiMn2O4纳米酶的类似过氧化酶的催化活性，系统地使用了经典的米氏-门滕（Michaelis–Menten）分析方法进行了酶模拟动力学研究。在保持一种底物（TMB或H2O2）浓度恒定的同时，改变另一种底物的浓度来进行动力学实验。所得到的反应速率曲线表现出典型的米氏-门滕行为，证实了催化过程遵循类似酶的饱和动力学（图2A和B）。为了提取动力学参数，进一步使用Lineweaver–Burk双倒数图（图2C和D）分析了实验数据。H2O2的表观米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）分别为1.671 mM和21.750 × 10?8 M min?1，而TMB的相应值分别为0.119 mM和19.621 × 10?8 M min?1。H2O2相对较低的Km值表明了其对底物的强亲和力，这暗示了过氧化物物种在NiMn2O4表面的有效吸附和活化（表S1）。这种增强的催化性能可以归因于Ni2+/Ni3+和Mn3+/Mn4+中心之间的协同氧化还原耦合，这种耦合促进了电子的快速转移，并促进了活性氧中间体的生成。此外，NiMn2O4的层次化纳米结构提供了大量的可访问活性位点，从而加速了底物的扩散和转化。综上所述，这些特性赋予了NiMn2O4纳米酶高的催化效率，使其能够有效地进行DHNP环化，并突显了其作为氧化传感应用中稳健人工酶的潜力。图2

NiMn2O4纳米酶的酶样动力学研究及其条件优化。当底物分别为TMB和H2O2时，NiMn2O4纳米酶的酶促反应动力学曲线。当底物分别为TMB和H2O2时，NiMn2O4纳米酶的Lineweaver–Burk倒数方程曲线。在不同pH值和温度下NiMn2O4纳米酶的过氧化酶样活性。如图2E所示，NiMn2O4纳米酶在3.0到8.0的宽pH范围内保持了显著的过氧化酶样活性，这一范围明显宽于许多传统纳米酶的报道。这种宽pH耐受性对于实际和生物应用特别有利，因为它能够在酸性和接近生理的环境下保持稳定的催化性能。这种稳健的pH适应性可能归因于混合价态Ni–Mn氧化物框架的结构稳定性，该框架保持了氧化还原活性位点，并防止了质子引起的失活。此外，NiMn2O4纳米酶在20–55°C的温度范围内表现出出色的热稳定性（图2F）。这种热稳定性反映了纳米酶的内在无机性质以及尖晶石结构中强金属–氧键的作用，有效抑制了天然酶中常见的热变性。总的来说，宽pH耐受性和出色的热稳定性强调了NiMn2O4纳米酶在复杂分析和生物相关环境中可靠操作的适用性。

3.3 反应条件优化

与大多数催化纳米材料一样，NiMn2O4纳米酶的酶模拟活性对周围反应条件非常敏感。因此，为了实现可靠且高灵敏度的DA检测，系统地优化了控制催化反应的关键实验参数。如图3A所示，纳米酶的活性明显依赖于溶液的pH值，这显著影响了反应系统的荧光强度和发射光谱轮廓。确定了最佳的pH值为5.5，这一条件通常对许多报道的纳米酶来说是不利的，从而突显了NiMn2O4催化剂的卓越pH适应性。传感反应在pH 5.5的醋酸缓冲液中进行，因为这种条件提供了最高的荧光响应和最佳的信号再现性。尽管生物样本通常接近中性pH值，但在分析前它们被稀释或在醋酸缓冲液中预处理，以提供统一的反应介质并最小化基质依赖的pH变化。重要的是，微酸性的条件有助于抑制DA的自发氧化，从而减少背景干扰，使NiMn2O4/H2O2系统能够主导氧化环化过程。时间依赖的动力学研究（图3B）显示产物形成逐渐增加，然后在大约20分钟时达到平台期，表明反应饱和和完成。因此，选择了20分钟的反应时间来平衡分析灵敏度和通量。温度也被发现对催化效率起着关键作用，在37°C时观察到最大的荧光响应（图3C），这对于生物和临床应用特别有利。H2O2的浓度被证明是一个关键参数，对于准确的信号生成至关重要。虽然低水平的过氧化物限制了催化转化，但过量的H2O2会导致DHNP的非催化氧化，从而导致信号失真和选择性降低。因此，确定了最佳的H2O2浓度为4.5 mM（图3D）。此外，由于NiMn2O4和DHNP之间的光谱重叠引起的内部滤波效应（IFE），仔细优化了纳米酶的剂量。荧光测量显示，NiMn2O4的浓度为20 μg/mL时提供了最高的信号响应，同时不损害光谱完整性（图3）。

3.4 检测机制

为了验证NiMn2O4在DA检测中的催化贡献，使用TMB作为显色探针进行了一系列对照实验。如图4A所示，缺乏NiMn2O4催化剂的系统在655 nm处没有明显的吸光度，证实了TMB没有自发氧化。相比之下，引入NiMn2O4后引起了明显的吸收带，并伴随着强烈的蓝色变色，无论是否添加了外部H2O2。这种行为表明了在温和的、接近生理条件下有效地产生了活性氧物种（ROS），特别是超氧阴离子（O2˙?）和羟基自由基（˙OH），这些活性氧物种来源于Ni和Mn活性中心之间的内在氧化还原循环。NiMn2O4在温和、接近生理条件下的自由基生成能力突显了其作为高灵敏度DA检测催化平台的稳健性。为了阐明负责DA–DHNP环化的活性中间体，使用了DMPO作为自旋捕获剂进行了电子自旋共振（ESR）光谱研究。如图4B所示，清楚地观察到了与DMPO–OH˙和DMPO–O2˙?加合物相对应的特征四重线和六重线ESR信号，直接证明了˙OH和O2˙?自由基的同时生成。当反应在氮气氛围下进行时，观察到产物生成显著减少（图4C），这强调了溶解的分子氧在维持催化循环中的不可或缺的作用。此外，随着超氧化物歧化酶和异丙醇的添加——分别是O2˙?和˙OH的特异性清除剂——荧光信号的逐步减弱进一步证实了这两种自由基在驱动环化过程中的协同作用（图4D）。总的来说，这些结果确立了NiMn2O4催化的DA–DHNP反应背后的双自由基介导机制。

图4
（A）NiMn2O4 + H2O2、TMB + H2O2、NiMn2O4 + TMB、NiMn2O4 + H2O2 + TMB、NiMn2O4的吸光度光谱；
（B）自由基捕获实验表明NiMn2O4生成了O2˙?和˙OH；
（C）在常温和氮气氛围下评估了NiMn2O4的催化性能，以研究其对氧的依赖性；
（D）通过使用超氧化物歧化酶和异丙醇进行自由基清除实验，确认了ROS的参与。

3.5 定量数据

使用经过验证的分析方案，DA在荧光和吸光模式中都表现出出色的线性响应进行了定量测定。如图5A和B所示，比率荧光信号（F485/F440）随DA浓度的增加而线性增加，根据方程（F485/F440）= 0.0312 [DA] + 0.5315，在0–250 μM的范围内显示出优异的相关系数（R2 = 0.9977）。同时，比色响应（ΔA）也显示出类似的线性关系（ΔA = 0.0032 [DA] + 0.1387，R2 = 0.9972；图5C和D）。基于3:1的信噪比，荧光法和比色法的检测限分别估计为3 nM和17 nM。荧光模式中实现的优越灵敏度可以归因于其内在的比率读数，这有效地抑制了背景波动和仪器漂移，从而提高了微量DA量化的分析可靠性。所提出的传感平台的分析性能与之前报道的比色和荧光方法进行了系统比较，如表1中所总结的。关键定量参数——包括线性动态范围、检测限和检测模式——被比较，以突出当前方法的相对灵敏度和可靠性。值得注意的是，所提出的双模式策略在检测限和操作简便性方面表现出竞争性，在某些情况下甚至更优越，特别是在检测限和操作简便性方面，突显了其在实际DA分析中的潜在优势。比率荧光测定在不同基质中显示出出色的准确性和精确度，在缓冲溶液中的回收率为95.3–104.9%（RSDs：2.15–3.87%，表S2），在人血清中的回收率为95.0–107.0%（RSDs：3.10–4.46%，表S3），在尿液样本中的回收率为95.6–105.2%（RSDs：2.76–3.87%，表S4）。比色方法也表现出一致的良好性能，回收率在缓冲溶液中的范围为97.7–102.7%（RSDs：1.76–3.19%，表S5），在血清中的回收率为97.4–106.9%（RSDs：2.87–4.34%，表S6），在尿液中的回收率为97.4–104.1%（RSDs：2.76–3.87%，表S7）。一致地，即使在复杂的生物介质中，也比色方法也表现出强大的性能。

图5
（A）添加不同量DA后NiMn2O4的荧光读数（0–250 μM）；
（B）绘制（F485/F440）与DA浓度之间的关系；
（C）添加不同量DA后NiMn2O4 + DHNP的吸光度读数（0–250 μM）；
（D）绘制ΔA与DA浓度之间的关系。重复次数为四次。表1

提出的方法与其他已报道的方法用于测定多巴胺（DA）的定量参数

技术
探针/系统
线性范围（μM）
检测限（μM）
响应时间（分钟）
参考文献

比色法
NAC@AuNPs
7.45–24.40
8.4
120
39

3D-MoS2/Graphene/TMB
1–400
0.21
10
40

Cu-MOFs/TMB
10–100
10
10
41

h-CuS NC/TMB
2–150
1.67
30
42

Graphene纳米带/TMB
0.1–50
0.035
10
43

HP-Co3O4@C NBs/TMB
0–100
0.24
3
44

Pt/CoFe2O4/TMB
20–80
0.42
3
45

β-CD/N@GQDs/TMB
0.12–7.5
0.04
5
46

NiMn2O4 + DHNP
0–250
0.017
20

本工作

荧光法
β-CD/N@GQDs/TMB
0.028–1.5
0.009
20
46

碳点
0.1–15
0.037
90
47

FNP (OS0.2ANS0.8-LEuH)
1–200
0.29
600
48

N-CQDs
0–100
0.0972
10
49

Arg-CDs
10–100
0.28
15
50

NiMn2O4 + DHNP
0–250
0.003
20

3.6. 选择性和稳定性

为了严格评估所提出的传感平台的选择性——这是可靠生物标志物分析的基本要求——在存在一系列可能在生物基质中遇到的潜在干扰物种的情况下，评估了其对DA的响应。这些干扰物种包括无机离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cl?）、小分子（尿酸、抗坏血酸、谷胱甘肽、葡萄糖）、氨基酸（甘氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸）、核苷酸（三磷酸腺苷钠）、蛋白质（牛血清白蛋白）以及结构相关的儿茶酚胺（肾上腺素和去甲肾上腺素）。所有干扰物都以比DA高十倍的浓度引入，作为初始的抗干扰测试，在受控的实验条件下进行。尽管这种设计有助于评估选择性，但它并不能完全再现生理流体中遇到的内源性浓度比，因为在生理流体中，某些干扰物的含量可能远高于DA。如图6所示，只有DA在荧光和吸光信号中引起了明显且同时的变化，而所有其他物种产生的响应可以忽略不计。这种卓越的选择性归因于特定的DA驱动的环化反应及其在传感系统中的独特氧化还原行为，有效地将DA与密切相关的化合物区分开来。这些结果证明了在测试的实验条件下良好的抗干扰性能，并支持了该平台对DA的选择性响应。然而，在更具生理代表性的分析物/干扰物比例下进一步验证将有助于扩展其在内源性微量DA分析中的适用性。

3.7. 反应机制

反应机制涉及在H2O2和O2存在下，通过NiMn2O4的催化活性生成活性氧（ROS），进而氧化DA。这种氧化产生一个DA-醌中间体，该中间体具有高度亲电性。然后DHNP作为亲核试剂，通过Michael加成攻击醌，随后发生分子内环化和芳香化，形成四氢异喹啉衍生物。该产物稳定，并表现出强烈的发色和荧光特性，可以通过UV-Vis和荧光光谱进行检测和定量（方案2）。LC-MS/MS确认了产物的分子量，使用清除剂和替代分析物的对照实验确认了反应的选择性和对ROS的依赖性（图S3）。

3.8. 实际样品分析

为了评估所开发的基于纳米酶的传感器的实际性能，使用标准添加方法分析了真实的人类血清样品。双模式荧光/比色传感器的检测结果与高效液相色谱（HPLC）的结果进行了比较。如表2和表3所示，两种检测模式与HPLC结果高度一致。该方法显示出令人满意的回收率，范围从95.6%到106.4%（荧光法）和95.6%到104.8%（比色法），证实了其在实际样品中检测DA的准确性和可靠性。这些发现突显了该平台在早期疾病诊断中的潜在应用价值。

表2 使用荧光法（n = 3）分析实际样品

样品
添加量（μM）
NiMn2O4 + DHNP
HPLC/UV51

检测量（μM）
回收率%
RSD%
注射量
0.0
9.78 ± 0.23
—
—
9.56 ± 0.45
—
—

5.0
14.76 ± 0.14
99.6
2.67
14.89 ± 0.34
106.4
3.78

10.0
20.34 ± 0.26
104.5
2.78
19.96 ± 0.67
104.0
4.19

20.0
30.45 ± 0.47
103.4
3.21
31.21 ± 0.76
108.3
4.65

血清
0.0
ND
—
—
ND
—
5.0
4.78 ± 0.38
95.6
2.65
5.23 ± 0.23
104.6
3.78

10.0
9.97 ± 0.54
99.7
3.19
10.34 ± 0.44
103.4
4.62

20.0
21.28 ± 0.67
106.4
3.00
19.67 ± 0.64
98.4

尿液
0.0
ND
—
—
ND
—
5.0
5.32 ± 0.32
106.4
2.89
4.93 ± 0.67
98.6

表3 使用比色法（n = 3）分析实际样品

样品
添加量（μM）
NiMn2O4 + DHNP
HPLC/UV51

检测量（μM）
回收率%
RSD%
注射量
0.0
9.63 ± 0.43
—
—
9.55 ± 0.76
—
—

5.0
14.42 ± 0.44
95.8
1.76
14.09 ± 0.48
90.8

10.0
20.04 ± 0.26
104.1
1.88
19.76 ± 0.67
102.1
4.19

20.0
30.19 ± 0.47
102.8
2.49
31.71 ± 0.66
110.8

4. 结论

在这项研究中，合理开发了一种具有内在双过氧化物酶和氧化酶活性的NiMn2O4纳米酶，作为多巴胺（DA）传感的多功能催化平台。与依赖于非特异性氧化或单信号转导的传统基于纳米酶的检测方法不同，所提出的系统独特地利用了DA和1,3-二羟基萘（DHNP）之间的活性氧驱动的环化反应，从而在原位形成一种新的光学活性产物。这种选择性的化学转化是本工作的核心创新点，因为它将纳米酶催化与反应特异性的分子识别相结合，而不仅仅是简单的信号放大。由此产生的比率荧光-比色双模式传感策略提供了内在的自校准能力，显著提高了信号的真实性和对探针不稳定性、光漂白和基质效应的鲁棒性。重要的是，高选择性来源于DA在纳米酶介导条件下对DHNP的专属反应性，有效抑制了生物流体中常见的结构相似生物分子的干扰。由于选择性反应化学、双模式读数和纳米酶催化的协同整合，该方法在复杂的生物样品中实现了高灵敏度、宽线性动态范围和出色的分析可靠性。总体而言，这项工作引入了一种概念上的新传感范式，其中利用纳米酶触发的、分析物特异性的环化反应来构建自我验证的比率平台，从而扩展了纳米酶的功能范围，超出了传统酶模拟物的限制。所提出的策略为准确的DA定量提供了一种稳健且通用的方法，具有早期诊断DA相关疾病和治疗药物监测的强大潜力。

伦理声明

本研究获得了阿苏特大学机构伦理委员会的批准。在样本收集之前，所有参与者都获得了书面知情同意。所有程序均符合赫尔辛基宣言和适用的国家法规。

作者声明没有竞争利益。

数据可用性

数据可向相应作者索取。补充信息请参见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra00996d。

致谢

本工作得到了伊玛目穆罕默德·伊本·沙特伊斯兰大学（IMSIU）科研部的支持和资助（授权号IMSIU-DDRSP2601）。