利用真空辅助顶空固相微萃取技术从克里特百里香蜂蜜中提取挥发性和半挥发性物质

《Microchemical Journal》：Vacuum-assisted headspace solid-phase microextraction arrow sampling of volatiles and semi-volatiles from Cretan thyme honey

　　安杰利基·帕特拉基（Angeliki Pateraki）、梅利娜·阿里斯蒂亚·库索斯皮鲁（Melina Aristea Koutsospyrou）、埃莱尼·阿纳格诺斯托（Eleni Anagnostou）、埃莱夫特里亚·普西拉基斯（Elefteria Psillakis）

克里特技术大学化学与环境工程学院水化学实验室，希腊哈尼亚-克里特，73100

**摘要**

首次使用真空辅助顶空固相微萃取箭头（Vac-HS-SPME Arrow）技术来分析克里特百里香蜂蜜中存在的挥发性及半挥发性化合物。这种优质的单花蜂蜜在希腊和国际上都备受推崇。研究目标共29种分析物，包括先前报道的植物标志物，以及首次发现的多种源自蜂巢的化合物。通过比较不同采样时间（15–60分钟）和温度（30–60摄氏度）下的Vac-HS-SPME与传统HS-SPME的方法性能，发现部分化合物在真空条件下提取效果更佳。在选定的提取条件下（Vac-HS-SPME Arrow为15分钟、60摄氏度；HS-SPME Arrow也为15分钟、60摄氏度），真空处理可使采样时间缩短四倍，同时仍能检测到所有已知的百里香蜂蜜植物标志物，并保持与常规压力采样相当的灵敏度。将该优化方法应用于另外7份克里特手工蜂蜜样本后，证实了这些蜂蜜具有稳定的化学成分特征，并且确实含有上述蜂巢来源的化合物。总体而言，Vac-HS-SPME Arrow是一种快速且无需使用溶剂的技术，为蜂蜜的化学特性分析、 authenticity鉴定以及作为蜂群健康状况指标提供了新的途径。

**1. 引言**

蜂蜜是由蜜蜂从花蜜或植物分泌物中提取的天然甜味物质，通常分为花蜜和蜜露蜂蜜两类[1]、[2]、[3]。除了其长期以来的营养价值外，蜂蜜还因其抗氧化、抗菌和抗炎特性而受到重视[4]。这些特性及其感官品质和商业价值深受其植物学和地理来源的影响，因此可靠的成分分析对于保护消费者权益和准确标注产品至关重要[5]、[6]。

蜜花粉学（Melissopalynology）通过显微镜观察花粉颗粒，一直是养蜂人和实验室用于蜂蜜植物学及地理分类的传统方法[2]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。然而，这种方法劳动强度高、耗时较长，且可能存在主观解释，从而导致结果差异[8]、[9]、[11]。此外，这种方法难以区分来自植物学上相似但花源重叠的蜂蜜。例如，仅凭花粉难以区分希腊柑橘类蜂蜜[12]，而麦卢卡（Leptospermum scoparium）和卡努卡（Kunzea ericoides）蜂蜜的花粉形态几乎相同[13]。为克服这些限制，业界正朝着更快、更客观的分析方法发展。

挥发性有机化合物是蜂蜜香气的主要来源。由于这些成分种类繁多，蜂蜜的香气特征可被视为其“指纹”，可用于确定其植物学或地理来源[5]、[6]、[11]、[14]、[15]、[16]、[17]。在各种分析技术中，气相色谱-质谱联用（GC–MS）已成为蜂蜜挥发性成分分析的最常用方法[2]、[3]、[6]、[11]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。更先进的技术如二维气相色谱-质谱联用（GC×GC–MS）[20]、[21]和飞行时间质谱（GC×GC-TOF-MS）[22]也有所探索，但它们的广泛应用受到仪器复杂性和成本的限制。

蜂蜜挥发性成分的分析通常需要样品预处理步骤，以有效分离复杂基质中的目标化合物。早期研究采用蒸汽蒸馏-萃取法[3]、[23]、[24]，随后发展为动态顶空技术[25]、[26]、[27]。其他提取方法如吹扫捕集[28]、[29]、[30]和超声辅助萃取[31]也被用于蜂蜜挥发性成分的分析。在另一项比较研究中，同时评估了蒸馏-萃取、液-液萃取和固相萃取法从迷迭香蜂蜜中分离挥发性化合物的效果[32]。然而，近年来顶空固相微萃取（HS-SPME）因操作简便、无需溶剂且适用于挥发性成分分析而成为首选方法[5]、[6]、[11]、[15]、[16]、[17]、[18]、[21]、[33]。在希腊蜂蜜分析中，通常采用60摄氏度、60分钟的HS-SPME条件来表征蜂蜜香气特征，并区分百里香蜂蜜的植物学和地理来源[5]、[6]、[12]。最近的一项西班牙研究还采用了更高温度（100摄氏度）以更好地提取低挥发性化合物[17]。此外，HS-SPME/GC×GC-TOF-MS联用技术用于分析中国单花蜂蜜，鉴定出超过130种挥发性化合物[22]。高容量SPME Arrow纤维的使用进一步提升了分析性能，其与GC×GC–MS联用可识别蜂蜜样本中的290多种挥发性化合物[21]。

尽管HS-SPME适用范围广泛，但提取半挥发性化合物仍具有挑战性，通常需要较长的提取时间或较高温度才能获得足够灵敏度[34]、[35]、[36]。为解决这些问题，真空辅助HS-SPME（Vac-HS-SPME）应运而生。通过降低采样瓶内的压力，Vac-HS-SPME提高了低挥发性化合物进入气相的效率，从而在较低温度和较短时间内实现更高效的提取[35]、[37]。这种改进源于低压加速了HS-SPME采样过程中的质量传递，而在平衡状态下提取效率与压力无关[38]、[39]。该技术已应用于鳄梨[39]、番茄[40]、葡萄[41]等食品基质[34]、[42]、[43]、[44]、[45]，其分析结果优于传统HS-SPME。在蜂蜜分析中，Vac-HS-SPME还用于定量检测5-羟基甲基糠醛（5-HMF），这是一种受法律监管的蜂蜜成分，广泛用于指示热处理和储存过程中的变质情况，其信号强度比HS-SPME高约十倍[20]。

本研究首次结合高容量SPME Arrow纤维使用Vac-HS-SPME技术，不仅分析了挥发性化合物，更重要的是研究了蜂蜜中此前未被探索的半挥发性成分。该方法以克里特百里香蜂蜜为研究对象，这种蜂蜜在希腊和国际上均享有盛誉[5]。系统优化了提取温度和时间，并直接比较了Vac-HS-SPME Arrow与传统HS-SPME Arrow的分析性能。优化后，该方法应用于来自克里特不同地区的7份手工蜂蜜样本，以评估其挥发性及半挥发性成分的稳定性和可靠性。

**2. 材料与方法**

**2.1. 化学试剂与材料**

用于计算线性保留指数（LRI）的正烷烃混合物（C7-C30）购自Sigma-Aldrich Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。作为内标（IS）的苯酚酮（纯度>99%）同样来自Sigma-Aldrich Chemical Co。苯酚酮的乙醇储备溶液浓度为10,000 mg/L，工作内标溶液（10 mg/L）通过稀释制备。试剂级氯化钠购自Penta（捷克共和国布拉格）。Barnstead EASYpure II纯水系统（Thermo Scientific，美国迪比克）用于制备超纯水。

本研究使用的二乙烯基苯/碳宽范围/聚二甲基硅氧烷（DVB/Carbon-WR/PDMS）SPME Arrow纤维由Restek Corporation（美国贝尔方特）提供，其相厚度为120 μm，长度为20 mm，外径为1.1 mm。SPME Arrow纤维按照制造商建议进行预处理。使用前，所有样品瓶和盖子均用超纯水清洗、冲洗，并在65摄氏度下处理以去除潜在污染物。

**2.2. 蜂蜜样品的采集与制备**

Vac-HS-SPME Arrow方法的优化使用来自克里特哈尼亚Kolymvari地区的百里香蜂蜜样本（图1中的C1）进行。经蜜花粉学分析确认，该样本含有25%的百里香花粉。根据希腊法规，当百里香花粉占比超过总花粉的18%时，蜂蜜被归类为百里香蜂蜜[46]。样本C1由当地养蜂人于2023年10月提供，采集自当年的百里香开花期。另外7份克里特蜂蜜样本（C2-C8）也进行了分析，图1显示了它们的蜂箱地理位置。这些样本均采集于2022–2023年的百里香开花期间。其中只有C4的植物来源得到确认，被归类为含73%百里香花粉的单花蜂蜜；其余样本根据当地植物群被暂时认定为百里香蜂蜜。为评估日内和日间精度，使用了从当地超市购买的商业克里特百里香蜂蜜样本。

蜂蜜样品的制备方法参考了先前报道的方法并进行了部分调整[11]、[47]。每次将2克蜂蜜样品加入20毫升带压盖的长颈样品瓶（Shimadzu Europa GmbH，德国杜伊斯堡），然后加入2毫升10%（w/v）氯化钠溶液。再加入20 μL内标溶液，用带有丁基/丁基橡胶/聚四氟乙烯（PTFE）隔膜的20毫米铝压盖密封样品瓶，使用Unimax 1010振荡器（Heidolph Instruments GmbH & Co. KG，德国施瓦巴赫）进行混匀。所有样品均储存在-18摄氏度的冷冻柜中直至分析。优化研究的样品分析于2023年10月进行，其余样品分析于2023年12月完成。

**2.3. 真空辅助HS-SPME（Vac-HS-SPME）与传统HS-SPME的采样程序**

Vac-HS-SPME采样时，按照2.2节描述的方法解冻样品，然后使用ExtraTECH Analytical Solutions SMPC（希腊哈尼亚）提供的密封件重新密封样品瓶。每个密封件均配有Thermogreen? LB-1隔膜（Supelco，美国贝尔方特），通过该隔膜进行空气抽排和SPME Arrow采样。所有隔膜在分析前需在150摄氏度下热处理16小时以避免硅氧烷释放和潜在污染。使用Vacuubrand VP 2 Autovac抽气装置（德国维尔泰姆）进行60秒的空气抽排，最终真空度达到7 mbar（0.007 atm），过程中不使用气体平衡器[44]。空气抽排时间基于先前研究确定[34]、[48]、[49]。如既往报道，对冷冻样品进行空气抽排可减少由于吸入造成的分析物损失[50]。对于传统HS-SPME Arrow，省略了空气抽排步骤。

样品转移至GC–MS自动进样器架。设置20分钟平衡时间后，使用DVB/Carbon-WR/PDMS SPME Arrow纤维在预设的采样时间和温度下进行提取。平衡和提取过程中样品以250转/分钟的速度搅拌。SPME Arrow纤维在自动进样器中的插入深度为40毫米。所有优化实验重复三次（n=3），而对蜂蜜样本（C2-C8）进行两次重复分析（n=2）。

**2.4. GC–MS分析**

GC–MS分析使用Shimadzu GC–MS-QP2020 NX仪器进行，配备Shimadzu AOC-6000多功能自动进样器。载气为氦气，流速为1毫升/分钟。分离柱为DB-5MS（内径30毫米、壁厚0.25毫米），购自Agilent J&W（美国圣克拉拉）。GC oven温度按程序升温：从60摄氏度开始（保持1分钟），随后以8摄氏度/分钟的速度升至100摄氏度，最后以5摄氏度/分钟的速度升至280摄氏度（保持3分钟）。进样器温度设定为250摄氏度。SPME Arrow在GC进样口脱附5分钟。质谱仪采用电子离子化模式（EI），离子源和传输线温度分别设定为250摄氏度和300摄氏度。全扫描模式用于监测35至400 Da范围内的质荷比（m/z）碎片。每次分析前，SPME Arrow纤维在270摄氏度下预处理10分钟，分析后进行5分钟的后处理。为了排除分析之间的交叉污染，定期进行了空白运行。2.5 数据处理和目标分析物的半定量分析色谱图积分和质谱分析是使用Shimadzu Lab Solutions软件（GC–MS Solution版本4.53SP1）进行的。化合物的鉴定采用了NIST17和Wiley7库，仅考虑相似度因子高于90%的匹配结果。为了进一步确认这些鉴定结果，使用C7–C30正烷烃系列计算了实验LRI（线性响应指数），并与NIST数据库中的参考LRI值进行了比较，这些参考值是在相同的固定相、柱几何结构和载气条件下获得的[39]，[40]。为了比较峰数据，还使用了LabSolutions Insight GC–MS软件，能够批量可视化特定分析物的结果。通过使用苯甲酮作为内标（IS），采用半定量方法检查了蜂蜜样品中分析物浓度的潜在差异，从而实现了所有检测分析物的相对定量。选择苯甲酮是基于之前关于希腊蜂蜜的研究[5]，[6]，[11]，[12]，[15]，[47]，[51]，[52]，[53]，以及它能够提供不干扰其他分析物洗脱的可重复信号[51]。初步实验确认所选浓度（20 μL的10 mg L?1）处于目标分析物的中低峰面积范围内（参见例如，补充图S1）。使用的公式如下[40]，[54]，[55]：(1) Ci = VIS × CIS / m × Ai / AIS，其中Ci是样品中分析物i的浓度（ng g?1），VIS是加入的内标体积（μL），CIS是内标的浓度（mg L?1），m是样品质量（g），Ai是分析物i的峰面积，AIS是内标的峰面积。3. 结果与讨论3.1 克里特百里香蜂蜜的挥发性和半挥发性成分在初步实验中，通过使用Vac-HS-SPME Arrow和HS-SPME Arrow在60°C下对样品的顶空进行15分钟的采样，研究了克里特百里香蜂蜜样品（C1）的挥发性和半挥发性成分。选择60°C的温度是因为它在HS-SPME蜂蜜研究中被广泛使用，并且有助于分析物在提取过程中进入顶空[5]，[6]，[12]。图2展示了在真空和常压条件下获得的两个代表性色谱图，清楚地显示了它们在检测能力和信号强度方面的差异。下载：下载高分辨率图像（262KB）下载：下载全尺寸图像图2. 使用（i）Vac-HS-SPME Arrow（黑色，上图）和（ii）HS-SPME Arrow（洋红色，下图）采样克里特百里香蜂蜜的挥发性成分时获得的总离子色谱图对比。放大了色谱图的部分区域。峰编号对应于表1。其他参数：DVB/Carbon-WR/PDMS SPME Arrow，在60°C下采样15分钟。使用Vac-HS-SPME Arrow在色谱图中鉴定出29种挥发性和半挥发性分析物。这些化合物的列表在表1中给出，并附有参考文献，这些文献报告了它们在希腊百里香蜂蜜和/或与蜜蜂相关研究中的存在。它们的鉴定基于商业质谱库，并将实验LRI与文献值进行了比较，误差在±10单位范围内。对于碳氢化合物（n21，n23，n26，n28，n29），通过将其保留时间与正烷烃标准混合物的保留时间匹配来进行鉴定。有两种分析物（n12和n19）略微偏离了±10 LRI阈值（表1），然而根据质谱库的匹配结果和之前报道的色谱数据[5]，[6]，[11]，确认了它们的存在。29种目标分析物的理化性质在表S1（补充材料）中进行了总结。值得注意的是，百里酚在11.3分钟时洗脱，根据质谱成功检测并鉴定出来。然而，这种化合物没有包括在目标分析物列表中，因为它是一种有机杀螨剂[56]，并且是由一位养蜂人使用的。因此，它在蜂蜜样品中的存在可能归因于蜂蜜的植物来源或养蜂实践。表1. 目标分析物列表及其化学组、实验计算的LRI（LRIExp）和文献中报告的LRILib、分子量（MW，g mol?1）以及鉴定离子（m/z）。每个分析物的参考文献都报告了其在希腊百里香蜂蜜（使用HS-SPME或USAE）或与蜜蜂相关研究中的先前检测结果。序号化合物化学组LRIExpLRILibMW (g mol?1)鉴定离子 (m/z)参考文献希腊百里香蜂蜜蜂巢相关化合物HS-SPMEUSAE空蜂房n1*苯甲醛醛972962106106,77,105[5]，[11][31]-n2*苯乙醛醛1048104312091,92,120[5]，[6]，[11][31]-n3**壬醛醛1105110114257,41,43[5]，[11][31][57]-n4**苯乙基醇醇1114111212291,92,122[5]，[11][31][58]，[59]-n5*苄基腈腈11381142117117,90,116[5][31]-n6辛酸乙酯酯1187119017288,57,101[11]-n7十一烷醛醛1198120315657,43,41[5]，[11][31]-n8*1-苯基-丁-2,3-二酮酮1202121116291,119,162[5]，[6][31]-n9壬酸乙酯酯1285129418688,101,70[11]-n10*香芹酚酚12901298150135,150,91[5]，[11][31]-n11**十一烷醛醛1298130517043,57,41[5]，[11]-[57]-n12*3-羟基-4-苯基-2-丁酮酮13361348164103,91,121[5]，[6][31]-n134-甲氧基-苯乙基醇醇13641374152121,152,77[5]，[6][31]-n14**癸酸乙酯酯1385138120088,101,70[11]-[60]-n15**十二烷醛醛1400140218457,43,41[5]-[57]-n16*3-羟基-4-苯基-3-丁酮酮1423143316291,43,119[5]，[6][31]-n171-十二烷醇醇1467147318655,69,43---n18**月桂酸乙酯酯1586158122888,43,55[11]-[60]-n19*3,4,5-三甲基氧基-苯甲醛醛15951608196196,181,125[5][31]-n20**肉豆蔻酸乙酯酯1788179225688,101,43[11]-[60]，[61]-n21**十九烷烷1896–26957,71,43–[31][57]，[62]-n22**棕榈酸乙酯酯1989199128488,101,43–[31][61]，[63]，[64]-n23**二十一烷烷2098–29757,71,43–[31][57]，[65]-n24**油酸乙酯酯2163216831155,69,83–[31][61]，[63]，[64]，[66]，[67]，[68]-n25**硬脂酸乙酯酯2191218831288,101,43--[63]，[64]，[66]，[69]-n26**二十二烷烷2198–31157,71,43–[31][57]-n27**(Z)-9-三烯烷烯2271228132383,97,57–[31][65]，[70]-n28**二十三烷烷2302–32457,71,85–[31][57]，[65]，[70]-n29**二十五烷烷2503–35257,71,85--[57]，[65]，[70]?使用HS-SPME [5]，[6]或USAE [31]报告为希腊百里香蜂蜜的植物标记物。??表1突出显示了八种分析物（用星号标记），这些分析物对应于使用传统HS-SPME [5]，[6]、超声辅助提取（USAE）[31]或吹扫-捕集提取[29]报告的希腊百里香蜂蜜的植物标记物。值得注意的是，在目前的实验条件下，其中两种标记物（3-羟基-4-苯基-3-丁酮（n16）和3,4,5-三甲基氧基-苯甲醛（n19）仅在真空条件下被检测到，而1-苯基-丁-2,3-二酮（n8）、香芹酚（n10）和3-羟基-4-苯基-2-丁酮（n12）在真空条件下的提取效果明显优于常压条件（图2）。值得一提的是，这是第一项使用仅15分钟的采样时间在希腊百里香蜂蜜中检测到这一组完整百里香植物标记物的HS-SPME研究。之前关于这种蜂蜜的HS-SPME研究需要更长的提取时间（60°C下60分钟）才能成功检测到它们[5]，[6]。除了植物标记物外，表1还包括十六种蜂巢相关分析物（用双星号标记），这些分析物来源于蜜蜂群体，包括信息素以及来自蜜蜂、幼虫和蜂巢环境的信号[57]，[58]，[59]，[60]，[61]，[62]，[63]，[64]，[65]，[66]。在大多数养蜂研究中，这些化合物主要在从蜜蜂身体或角质层中提取的溶剂中检测到[63]，[64]，[65]，[66]，[67]，[68]，[69]，或者在使用基于SPME的方法收集的蜜蜂的顶空中检测到[57]，[61]，[70]。在目前的实验条件下，油酸乙酯（n24）、硬脂酸乙酯（n25）、(Z)-9-三烯烷（n27）和二十五烷（n29）仅在真空条件下被检测到，而苯乙基醇（n4）、十九烷（n21）、棕榈酸乙酯（n22）、二十一烷（n23）、二十三烷（n22）和二十二烷（n26）在真空条件下的提取效率高于常压条件。这同样是第一项使用仅15分钟的采样时间在蜂蜜中检测到如此多蜂巢相关化合物的HS-SPME研究。在之前关于希腊百里香蜂蜜的HS-SPME研究中，化合物n3、n4、n14、n15、n18和n20仅在延长提取时间（≥ 30分钟，45或60°C）后才能检测到[5]，[11]，而n21-n24和n26-n28是在使用USAE时报告的[31]。应当注意的是，分析物n21、n23和n27仅在45°C下使用SPME Arrow采样50分钟后在欧洲蜜露、花蜜和松树蜜中被报告[21]。总体而言，过去的研究主要限于报告这些蜂巢相关化合物的存在，而没有探讨它们在蜜蜂生理、行为或化学通讯中的具体作用。例如，壬醛（n3）能引起蜜蜂触角的强烈电生理反应，表明其具有感官相关性，尽管其在蜂巢通讯中的具体作用尚不明确[71]。苯乙基醇（n4）是另一种对蜜蜂生物重要的挥发性物质，它与苯乙酸酯一起与蜜蜂的卫生行为有关[58]，[59]。癸酸乙酯（n14）、月桂酸乙酯（n18）和肉豆蔻酸乙酯（n20）已被鉴定为与蜂王相关的挥发性混合物的成分，尽管它们的确切生物学功能尚不清楚[60]。同样，十一烷（n11）、十二烷（n15）、十九烷（n21）和二十二烷（n26）已在觅食工蜂的顶空中被检测到，但它们的具体作用尚未明确[57]。此外，几种检测到的化合物在蜂群中起着关键的调节作用。例如，棕榈酸乙酯（n22）是一种主要的幼虫酯类信息素，参与幼虫与工蜂之间的通讯，也是蜂王信息素的一部分，同时它还被发现是瓦螨利用的化学信号[61]，[63]，[64]。油酸乙酯（n24）是另一种多功能信息素，由幼虫和成年觅食蜂产生[66]。在工蜂中，它作为一种启动信息素，可以在觅食蜂数量较多时延迟年轻蜜蜂转变为觅食蜂的过程，并且在蜂王和幼虫中起到通用群体信号的作用[63]，[64]，[67]。此外，油酸乙酯还能刺激哺育蜂的咽下腺活动，从而支持幼虫的喂养[66]，[68]。硬脂酸乙酯（n25）也是一种关键的幼虫酯类信息素，参与调节工蜂的发育和蜂群的生长，并且是蜂王信息素的组成部分[63]，[64]，[66]，[69]。晚洗脱的化合物（Z)-9-三烯烷（n27）和二十五烷（n29）以前与觅食和防御有关。这些碳氢化合物作为招募信息素成分，由摇摆舞蜜蜂释放以刺激更多的觅食蜂[70]，而n29也被报告为与警报和防御反应相关的毒囊成分[60]。二十三烷（n23）和二十二烷（n26）同样在工蜂的毒囊中被发现，并与警报和防御功能有关[60]。总体而言，使用Vac-HS-SPME Arrow获得的色谱图包括了植物来源的化合物和调节蜂群功能的蜂巢相关化学物质，这些化学物质影响个体生理、协调社会行为并介导蜂群的防御。3.2 温度和采样时间的影响在三种采样温度（30、45和60°C）下评估了Vac-HS-SPME Arrow和HS-SPME Arrow的性能，每种温度下使用了四种提取时间（15、30、45和60分钟）。结果在图3中给出，而平均峰面积和相对标准偏差（RSD）在补充表S2中给出。图3证实了以往的理论预测，即真空对低顶空亲和力分析物的提取有积极影响[37]，并且如预期，随着采样温度和时间的增加，提取效率得到了提高。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图3. 在不同采样温度（30、45和60°C）下克里特百里香蜂蜜中挥发性和半挥发性化合物的提取时间曲线（15–60分钟采样）。数据分别来自常规（HS-SPME Arrow；蓝色条形）和降低总压（Vac-HS-SPME Arrow；橙色条形）。此可视化图中无法包含误差条，详细信息见补充表S2。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）为了更详细地研究图3中的结果，还计算了每种提取时间和温度下的Vac-HS-SPME Arrow/HS-SPME Arrow峰面积比，结果在表2中给出。在这些计算中，比率值>1表示真空条件下的提取效果更好，<1表示常规压力下的性能更优；接近1表示Vac-HS-SPME Arrow和HS-SPME Arrow的表现相似，即在两种压力条件下都达到了平衡[35]。需要注意的是，由于在常压下获得的绝对信号为零，某些峰面积比无法计算。表2. 在30、45和60°C下，每种采样时间下Vac-HS-SPME Arrow与HS-SPME Arrow的峰面积比。仅在真空条件下检测到的化合物标记为“Vac”并显示为蓝色，而在两种条件下均未检测到的化合物标记为“n.d.”（未检测到）。为了便于观察变化，对峰面积比应用了从0到1的红色渐变和从1到表S3展示了Vac-HS-SPME Arrow在不同提取时间（15分钟、30分钟、45分钟和60分钟）下的提取效率与最佳HS-SPME Arrow条件下的比较结果。尽管在真空条件下较长的提取时间（30-60分钟）增加了几种分析物的峰值面积，但有一组化合物（例如n1、n3、n6、n9、n14、n15、n18和n20）在真空条件下的响应始终低于大气条件下的响应，无论提取时间如何。尽管存在这些差异，15分钟的Vac-HS-SPME Arrow提取仍能够以足够高的信号强度检测到所有目标化合物。此外，对于关键植物标记物（例如n2、n8、n10、n16）和蜂巢来源的半挥发性化合物（n21-n29），真空条件下的提取效率相当或更高（表S3）。因此，对于Vac-HS-SPME方法，选择了15分钟的提取时间作为提取效率和分析通量之间的折中方案。

为了评估Vac-HS-SPME Arrow方法的日内和日间精度，使用了从当地超市购买的商业百里香蜂蜜进行了额外实验。这一决定基于手工制作的蜂蜜样本数量有限，且专门用于Vac-HS-SPME与HS-SPME之间的主要比较分析，而商业蜂蜜仍然代表了克里特百里香蜂蜜的典型特征。为了评估日内精度，在同一天内使用Vac-HS-SPME对样本进行了五次分析。日间精度是通过连续三天分析三次重复样本来评估的。在所得到的色谱图中，所有目标化合物都被检测到，其平均峰值面积及相应的% RSD值显示在表S4中。总体而言，该方法对于大多数分析物显示出令人满意的精度，日内和日间的% RSD值均低于20%，只有少数化合物由于信号较弱而表现出较大的变异性，这主要是由于信噪比限制而非方法本身的固有变异性。

3.3. 在多个克里特百里香蜂蜜样本中探索半挥发性化合物和植物标记物

随后，将优化的Vac-HS-SPME Arrow方法应用于分析另外七个克里特蜂蜜样本。这些样本来自克里特的不同地点（图1；位置C2-C8），由当地养蜂人提供。其中只有C4的植物来源通过花粉分析得到确认，显示其百里香花粉含量为73%。其余样本则根据当地植物群被养蜂人暂时鉴定为百里香蜂蜜。然后使用第2.5节描述的内部标准方法计算了分析物的半定量浓度（ng g?1）。结果数据总结在表S5中，代表性色谱图显示在图S1和S2中。为了便于解释，将每个样本中的分析物浓度分为两类：（i）希腊百里香蜂蜜的植物标记物（n1、n2、n5、n8、n10、n12、n16、n19）和（ii）蜂巢来源的化合物（n3、n4、n11、n14、n15、n18和n20-n29）（数据见图4和表S6）。

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图4. 每个克里特蜂蜜样本（C1-C8）中（i）希腊百里香蜂蜜植物标记物（n1、n2、n5、n8、n10、n12、n16和n19）和（ii）蜂巢来源化合物（n3、n4、n11、n14、n15、n18和n20-n29）的总浓度（ng g?1）。地理来源与图1所示一致。

如图4所示，样本C2、C3、C5和C8中的百里香植物标记物总浓度与单花参考样本（C4）相似，而样本C1、C6和C7的浓度明显较低。值得注意的是，所有七个手工制作的样本都含有八种百里香标记物，支持它们被分类为百里香蜂蜜。在所有情况下，苯乙醛（n2）是主要化合物，这与之前的研究结果一致，即它被认为是希腊百里香蜂蜜的关键标记物[5]、[6]、[11]、[29]。因此，观察到的百里香标记物总浓度变化可能反映了蜜蜂访问的花源相对丰度的差异，而不是表明不同的植物来源。

此外，几乎所有十六种蜂巢来源的化合物在所有样本中都一致被检测到，表明它们的存在是系统性的而非偶然的。唯一的例外是分析物n20，在样本C5和C6中未被检测到，这种变异性与其与蜜蜂相关的来源相符，可能反映了群体特定因素的自然差异。总体而言，这些发现表明蜂巢来源的挥发性和半挥发性化合物可能是克里特百里香蜂蜜化学特征的重要组成部分。

4. 结论

Vac-HS-SPME Arrow方法被证明对于全面分析克里特百里香蜂蜜中的挥发性和半挥发性化合物非常有效。共鉴定出29种分析物，并用于评估该方法在真空和大气条件下的性能。选择了60°C下15分钟的提取时间进行真空采样，不仅能够检测到先前报道的标记物，而且大多数分析物的灵敏度与大气压下60分钟提取相当，同时将分析时间减少了四倍。

除了预期的植物标记物外，化学谱图还揭示了一组调节蜂巢功能、影响个体生理、协调社会行为和介导群体防御的多样化蜂巢来源化合物。真空方法的增强灵敏度至关重要，使得能够检测到在标准条件下无法观察到的几种化合物。将优化的Vac-HS-SPME Arrow方法应用于另外七个克里特百里香蜂蜜样本后，发现化学谱图相似，证实了这些样本中存在与蜜蜂相关的化合物。这一发现强调了蜂蜜不仅仅是植物来源的产物，还是一个包含蜜蜂生物学和蜂巢过程信息的化学动态矩阵。这些蜂巢来源化合物的检测为蜂蜜的特性分析开辟了新的途径，提出了关于其对蜂蜜特性、真实性以及作为群体健康和过程指标的潜力的重要问题。

总体而言，所提出的Vac-HS-SPME Arrow方法被证明是一种可靠且有前景的蜂蜜分析工具，通过将提取时间减少四倍实现了高样本通量、满意的灵敏度以及良好的日内和日间精度。

CRediT作者贡献声明：
Angeliki Pateraki：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、研究、正式分析、数据管理。
Melina Aristea Koutsospyrou：研究。
Eleni Anagnostou：研究。
Elefteria Psillakis：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、数据管理、概念化。