快速简便的微波辅助DNA固定方法，用于构建高灵敏度的无标记电化学生物传感器，并实现级联酶促循环切割扩增功能

《Microchemical Journal》：Rapid and simple microwave-assisted DNA immobilization for sensitive label-free electrochemical biosensor with cascade enzymatic recycling cleavage amplification

　　

Xudong Zhou|Mingrui Zhang|Ying Jiang|Ruo Yuan|Yali Yuan

发光分析与分子传感重点实验室（西南大学），教育部，西南大学化学与化学工程学院，中国重庆400715

摘要

本文提出了一种新型的快速、简单的微波辅助DNA固定方法，该方法具有较高的装载效率，用于构建灵敏的无标记电化学生物传感器，并利用级联酶促循环切割实现信号放大。目标物质引发的DNA构象变化能够促使Mg²⁺依赖性DNA酶在DNA三链结构中进行循环切割，从而暴露出活性位点，促进引物延伸反应（PER）的进行。这一过程产生了大量两端含有Poly A序列的DNA产物。随后，这些DNA产物可以通过快速简便的微波加热方法（800 W，3分钟）固定在AuNPs改性的导电玻璃电极（CGE，2.5厘米×2.5厘米）上。这种创新方法克服了传统方法的局限性，如探针间距复杂、固定时间繁琐以及DNA在电极上的装载效率低下等问题，这些因素可能影响检测灵敏度。结果表明，该电化学生物传感器对miRNA-21的浓度范围（100 pM至1 μM）表现出线性响应，检测限低至20 pM。这一策略为简单、快速、高效和灵敏的DNA检测提供了一种有效方法。

引言

生物标志物的快速、准确和灵敏检测在疾病监测中起着关键作用，这促使研究人员开发了多种便捷的传感技术，包括光电化学（PEC）[1]、荧光（FL）[2]、电致发光（ECL）[4]和电化学（EC）[5]。其中，基于DNA的电化学生物传感器因其操作简便和选择性强而受到广泛关注[6]、[7]、[8]。通常，探针的装载效率和稳定性显著影响基于DNA的电化学生物传感器的选择性和灵敏度，因此实现探针的高效快速固定是提高检测性能的关键。

通过将DNA标记上-SH、-NH₂等基团并将其连接到贵金属（如Au、Pt等）上进行化学修饰是一种常见方法[9]，但这一过程需要较长时间（数小时），且会导致DNA排列无序[10]、[11]。最近，发现了一种基于腺嘌呤疏水相互作用的新型DNA固定方法。富含腺嘌呤的单链DNA（Poly A）可以作为传统-SH[12]或-NH₂[13]基团的替代品，不仅实现了无标记的低成本过程[14]、[15]，还通过疏水作用实现了高吸附亲和力和特异性。更重要的是，通过调控Poly A的长度，可以有效地调节探针之间的间距和密度。尽管有这些优势，但腺嘌呤疏水相互作用仍需要较长时间。此外，调节脱附-核酸链相互作用通常需要精确控制pH值[16]、离子强度[17]或溶剂组成[18]，这在实际操作中存在很大难度。采用快速微波加热技术可以显著加快样品固定速度，整个过程仅需几分钟，且无需额外控制条件，但这种方法仅能将DNA锚定在溶液中的Au表面[19]。

除了探针固定外，对低丰度生物标志物的超灵敏检测还需要强大的信号放大能力。虽然无酶技术（如HCR[20]、CHA[21]等）具有成本效益，但其较慢的动力学和较低的放大效率限制了其在微量分析中的灵敏度。酶辅助方法由于具有高催化效率和底物选择性，能够实现快速动力学和指数级的信号增强，因此具有明显优势。酶可以将单一目标结合事件转化为多个可检测信号，这对于早期诊断至关重要。因此，结合设计良好的酶辅助级联放大策略是实现高灵敏度和快速响应的有效途径。

本文创新性地利用微波加热技术将DNA探针固定在固态Au改性表面上，并进一步通过与扩增引物延伸反应（PER）结合，构建了一种新型生物传感器，用于超灵敏检测miRNA-21。如图1所示，目标miRNA-21能够识别预DNA酶，并在DNA locker/Au@Fe₃O₄纳米探针的辅助下暴露出形成Mg²⁺依赖性DNA酶的位点，从而触发PER反应，生成大量两端含有Poly A的单链DNA（A2）。通过微波加热技术，这些A2可以快速有效地固定在AuNPs改性的导电玻璃电极上，增强电子阻碍效应，便于定量分析。该方法巧妙地将目标引发的DNA循环放大与位于两端的Poly A序列相结合，显著提高了探针装载效率并缩短了DNA在电极表面的固定时间。此外，该平台对miRNA-21具有出色的选择性，几乎不受其他miRNA的干扰，并在不同批次之间表现出优异的重现性。微波辅助DNA固定与DNA循环放大的结合为开发快速、灵敏且成本效益高的生物传感器提供了有前景的策略。

章节片段

材料与设备

HAuCl₄·4H₂O购自Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯），K₃[Fe(CN)₆]和K₄[Fe(CN)₆购自北京化学试剂有限公司（中国北京）。氨基功能化的Fe₃O₄磁珠来自天津Baseline Chromtech研究中心（中国天津）。5.0 mM [Fe(CN)₆]^3?/4-溶液（pH 7.0）用于循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）测量。CV、EIS和电沉积实验均在CHI760E仪器上进行。

生物传感器的可行性和电化学表征

如图1A所示，展示了电极组装的示意图。CGE过程包括三个连续步骤：电极抛光、AuNPs固定以及带有Poly A修饰的DNA链的锚定，从而通过简单快速的方法使组装好的电极具备电化学性质。首先通过EIS测量验证了所构建生物传感器的可行性。如图1B所示，在没有目标miRNA-21的情况下，

结论

总之，本文开发了一种用于超灵敏检测miRNA-21的平台，该方法结合了Mg²⁺介导的酶促切割循环和微波辅助DNA固定技术。该方法巧妙地将目标引发的DNA循环放大与两端含有Poly A的序列相结合，显著提高了探针装载效率并缩短了DNA在电极表面的固定时间。值得强调的是

CRediT作者贡献声明

Xudong Zhou：撰写初稿、数据可视化、验证、方法学设计、数据管理。Mingrui Zhang：验证、数据分析、数据管理。Ying Jiang：数据分析、数据管理。Ruo Yuan：研究指导、实验设计。Yali Yuan：撰写初稿、研究指导、资源协调、资金申请。

资金信息

本研究得到了国家自然科学基金（22274133）、重庆市自然科学基金（CSTB2025NSCQ-GPX0477）以及

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。