《ChemBioChem》：Identification of Secondary Nucleation Inhibitors of Amyloid-β Aggregation by Cellular Selection of a SICLOPPS Library
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研究人员为寻找能够特异性靶向淀粉样蛋白-β (Aβ) 寡聚体 (AβOs) 的抑制剂，利用SICLOPPS (Split-Intein Mediated Circular Ligation of Peptides and Proteins) 技术构建了一个大于107成员的环肽文库，并进行了细胞筛选。他们鉴定出了具有活性的序列cyclo-CRLISFF，并通过深入研究揭示了其真正的活性形式是内含肽 (intein) 结合的中间体，该中间体通过抑制Aβ42聚集级联反应中的次级成核步骤来发挥作用。此研究不仅发现了一种新的AβO结合物，也揭示了SICLOPPS技术应用中一个被忽视的活性中间体形式，为开发针对阿尔茨海默病的疗法提供了新策略，并将该活性序列成功移植到其他蛋白支架上，展现了其作为蛋白基结合物的潜力。
在人类大脑的神经元之间，淀粉样斑块是阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease, AD) 的标志性病理特征，其核心成分是错误折叠并聚集的淀粉样蛋白-β (Aβ)。过去的研究揭示了Aβ的聚集是一个复杂的级联过程：可溶的Aβ单体先形成寡聚体 (Aβ oligomers, AβOs)，这些寡聚体进一步聚合成成熟的淀粉样纤维。在这一链条中，一个被称为“次级成核 (secondary nucleation)”的关键步骤尤为危险——已形成的纤维表面能像催化剂一样，加速单体转化为更多寡聚体和纤维，从而指数级放大病理聚集。然而，越来越多的证据指出，那些早期出现的、可溶的Aβ寡聚体，而非最终的淀粉样斑块，才是导致神经元毒性、认知功能障碍的“元凶”。因此，能够特异性识别并中和Aβ寡聚体的分子，成为对抗阿尔茨海默病极具潜力的治疗策略。
尽管针对Aβ的单体和纤维已开发出多种抗体和环肽抑制剂，但能精准靶向不稳定且异质性高的Aβ寡聚体的工具却寥寥无几。这背后的挑战在于，AβOs难以分离和稳定存在，使得传统的体外展示筛选方法难以施展。为了突破这一瓶颈，研究人员将目光投向了一种创新的细胞内筛选技术。
本项发表于《ChemBioChem》的研究，正是为了解决上述问题。研究人员利用一种基于cCadC-Aβ42融合蛋白的细胞报告系统，该系统能够感应Aβ寡聚体的形成并激活报告基因表达。他们将此系统与一种被称为SICLOPPS (Split-Intein Mediated Circular Ligation of Peptides and Proteins) 的强大技术相结合。SICLOPPS能够在大肠杆菌细胞内，从随机序列文库中，通过内含肽介导的剪接反应，高效地生成并展示数以千万计的环状多肽 (cyclic peptides)。
主要技术方法
研究首先利用SICLOPPS技术构建了一个大于107成员的7聚体环肽（首个残基为半胱氨酸）文库。然后，他们采用了基于cCadC转录因子的细胞选择策略，将cCadC与Aβ42 (ΔE22突变体) 融合，当有分子结合并稳定Aβ寡聚体时，可激活下游抗生素抗性基因的表达，从而在含氯霉素的培养基中筛选出能结合AβOs的环肽。在分子机制研究中，他们运用定点突变技术，构建了一系列在SICLOPPS剪接通路不同步骤（如前体、硫酯中间体、套索中间体等）暂停的突变体，以鉴定活性物种。最后，通过体外硫黄素T (ThT) 荧光聚集动力学实验，分析候选分子对Aβ42聚集过程的影响，并使用AmyloFit软件对动力学数据进行全局拟合，以明确抑制剂作用于聚集的哪个具体步骤（如延长延迟期或抑制次级成核）。
研究结果
2.1 针对结合cCadC-Aβ42寡聚体的SICLOPPS环肽筛选
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研究人员利用cCadC-Aβ42系统筛选SICLOPPS环肽文库，最终鉴定出三个富集序列：CFVQLFF、CRLISFF和CGLLVFP。其中，CRLISFF序列伴随着C末端内含肽(CfaC)的一个P23L突变。实验证实，CFVQLFF和CRLISFF (P23L)能够显著激活cCadC-Aβ42野生型的转录，但对Aβ42的单体突变体（F20S/L35P）无效，表明其活性依赖于Aβ的寡聚化。然而，初步通过引入已知的、可分别在剪接前体1和套索中间体3阶段阻断剪接的内含肽突变（T69A/H72A和H24L/F26L）进行验证时，发现这两种突变都严重削弱了CFVQLFF和CRLISFF (P23L)的活性，这最初让研究者认为活性完全依赖于成熟的环肽产物5。
2.2 环状CRLISFF (cyclo-CRLISFF) 的体外Aβ42聚集活性
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为了验证筛选结果，研究团队化学合成了cyclo-CRLISFF，并在体外测试其对Aβ42聚集的影响。令人意外的是，尽管cyclo-CRLISFF在体外能强烈抑制Aβ42聚集，但其作用模式主要表现为显著延长聚集的延迟时间 (tlag)，这与已知的、通过结合寡聚体来抑制次级成核的抑制剂行为不一致，反而更类似于结合单体Aβ的抑制剂。这种细胞筛选结果与体外活性机制之间的不一致，促使研究人员重新审视SICLOPPS系统中可能的活性形式。
2.3 所选序列以内含肽结合中间体的形式具有活性
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为了澄清上述矛盾，研究者探索了SICLOPPS剪接过程中其他中间体是否具有活性。他们测试了更多在剪接不同步骤暂停的突变体。结果显示，在C末端内含肽引入N36A突变（可阻止天冬酰胺环化，将剪暂停在套索中间体3）会严重降低活性。然而，在N末端内含肽引入C1A突变（预测也会将剪接暂停在前体1）却显示出中等活性。最关键的是，将环肽序列本身的第一个半胱氨酸突变为丙氨酸（外显子C1A突变），这个突变预计会将剪接暂停在初始N到S酰基转移后形成的硫酯中间体2。出乎意料的是，CRLISFF和CFVQLFF的C1A突变体表现出了与未突变亲本相当的强大活性。这强烈暗示，真正的活性物种可能是剪接初期形成的、仍与内含肽结合的中间体（前体1或硫酯中间体2）。随后，他们纯化了CRLISFF的C1A突变体（即Cfa(P23L)-ARLISFF蛋白），并在不含有机溶剂的缓冲液中进行体外测试。结果显示，Cfa(P23L)-ARLISFF能够抑制Aβ42聚集，并且其主要作用方式是选择性降低次级成核速率，这与Aβ寡聚体结合剂的预期机制完全一致。
2.4 移植到不同蛋白支架上的肽序列保留Aβ42活性
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为了进一步验证活性序列的普适性，研究人员将CRLISFF和CFVQLFF序列移植到一个完全不同的、名为SXkmer的工程化钙结合蛋白支架的环区中。结果显示，移植后的SXkmer-CRLISFF和SXkmer-CFVQLFF在细胞cCadC报告系统中仍然具有活性，尽管活性水平低于内含肽结合形式。更重要的是，纯化的SXkmer-CRLISFF在体外ThT实验中同样表现出对Aβ42聚集的抑制，且其作用机制同样是抑制次级成核。这证明了从SICLOPPS筛选中获得的序列，其活性构象可以被成功移植到其他蛋白骨架上，从而创造出更稳定、更易于生产的蛋白基Aβ寡聚体结合剂。
研究结论与讨论
本研究通过创新的细胞筛选策略，成功从大型SICLOPPS环肽文库中鉴定出能够结合Aβ42寡聚体的序列。研究最重要的发现之一，是揭示了在SICLOPPS技术应用中，一个之前被忽视的活性形式：内含肽结合的硫酯中间体。具体来说，序列CRLISFF的真正活性物种并非最终的头尾环化产物cyclo-CRLISFF，而是其剪接过程中的一个中间体Cfa(P23L)-ARLISFF。这个中间体在体外能通过特异性抑制Aβ42聚集的次级成核步骤来发挥作用，这与Aβ寡聚体结合剂的预期机制相符。这一发现提示，在使用SICLOPPS技术进行筛选时，需要更全面地考察不同剪接中间体的活性，以避免对活性物种的误判。
此外，本研究还证实了SICLOPPS筛选所得序列具有良好的“可移植性”。CRLISFF序列在三种截然不同的分子形式下均显示出对Aβ42聚集的抑制活性：作为化学合成的头尾环肽、作为内含肽融合的中间体蛋白、以及作为移植到SXkmer蛋白支架上的环区。其中，后两种形式（Cfa(P23L)-ARLISFF和SXkmer-CRLISFF）被明确鉴定为Aβ寡聚体结合剂。这为将筛选到的活性肽序列转化为更稳定、更具成药潜力的蛋白药物提供了有力支持。
总之，这项工作不仅发现了一种新的、通过抑制次级成核来靶向Aβ寡聚体的抑制剂，更重要的是，它揭示了SICLOPPS技术应用中一个关键的、可能影响结果解读的混杂因素，并展示了将筛选所得肽序列成功移植到其他蛋白支架上的可行性，为开发针对阿尔茨海默病等蛋白质错误折叠疾病的新疗法开辟了新的思路。
