家猫卵母细胞的获取方法及运输条件对体外胚胎生产的影响

《Theriogenology》：Impact of retrieval method and transport conditions of domestic cat oocytes on In vitro embryo production

　　安德烈亚·普里戈-冈萨雷斯（Andrea Priego-González）|安娜·穆诺兹-马塞达（Ana Munoz-Maceda）|豪尔赫·埃尔南德斯-马塔拉佐（Jorge Hernández-Matarazzo）|华金·塞尔德拉（Joaquín Cerdeira）|曼努埃尔·加尔多基·阿里亚斯（Manuel Gardoqui Arias）|爱德华多·R·S·罗尔丹（Eduardo RS. Roldan）|玛丽亚·赫苏斯·桑切斯-卡拉布伊格（María Jesús Sánchez-Calabuig）
马德里康普顿斯大学（Complutense University of Madrid, UCM）兽医学院医学与外科系，西班牙马德里

**摘要**
随着辅助生殖技术在野生猫科动物中的重要性日益增加，建立可靠的样本运输协议成为当务之急。最近在猫科动物中开发的卵子采集（OPU）技术凸显了卵子运输缺乏标准化协议的问题，尤其是在野外条件下。本研究评估了卵子回收方法（切片法与离体OPU）和卵子运输条件对后续体外发育能力和胚胎产量的影响。在初步实验中，卵巢在4°C下储存24小时以观察整个卵巢运输的效果。与立即处理的对照组相比，未观察到囊胚产生率的显著差异（9.8% vs 16.1%）。在另外两个实验中，通过切片法（SLI）或OPU回收的卵子分别立即处理（0小时）或在胚胎培养基中储存18小时后处理，并评估了核成熟（实验2）、裂变和胚胎发育（实验3）。未发现储存时间和处理方法之间的显著交互作用（P > 0.05），表明储存时间对评估参数的影响与处理方法无关。此外，储存时间和处理方法均无显著的主效应（P > 0.05）。成熟阶段也未受影响。囊胚产生率对储存时间的敏感性高于早期阶段，分别为22.6%（SLI 0小时）vs 11.9%（SLI 18小时）和27.0%（OPU 0小时）vs 13.0%（OPU 18小时）。尽管与其他物种相比发育结果较低，但所有处理组均获得了可接受的囊胚产量和孵化胚胎。这些发现支持了在室温下使用培养基短期保存猫科动物卵子的可行性，并强调了其在无法立即进行实验室处理时对猫科动物体外胚胎生产计划的潜在价值。

**引言**
辅助生殖技术（ARTs）在兽医领域变得越来越重要，不仅因其应用于畜牧业生产，还因其对伴侣动物繁殖、生物医学研究以及濒危物种保护计划的重要性[[1], [2], [3]]。在此背景下，体外胚胎生产（IVP）和配子（精子和卵子）及胚胎的冷冻保存已在家猫中得到广泛应用，家猫作为其他猫科物种的宝贵生物医学和转化模型[[4,5]]。这些进展的最终目标是优化和标准化家猫的繁殖协议，以便随后应用于受威胁的野生猫科动物，从而支持种群恢复工作，并有助于管理、保护和增强遗传多样性[[6,7]]。
根据IUCN红色名录，目前全球约有一半的猫科物种被列为易危或受威胁[[8]]。对于这些物种而言，ARTs尤其具有价值，因为它们的个体数量通常有限[[9]]。这些技术可以帮助克服异地繁殖计划中遇到的许多限制，例如机构间的动物转移可能存在后勤挑战，以及行为不兼容、压力相关疾病或病理条件可能导致自然交配受阻[[10,11]]。此外，ARTs使得可以使用冷冻库中的遗传材料，便于从多年前死亡的个体中恢复和重新引入遗传多样性，加强长期保护和管理策略[[12], [13], [14]]。迄今为止，家猫领域的ARTs进展支持了精液[[15,16]]、卵子[[17], [18], [19], [20]]和胚胎冷冻保存协议[[21], [22], [23]]的发展，以及胚胎移植[[24,25]]、通过体细胞核转移（SCNT）进行克隆[[26,27]]和IVP[[28], [29], [30]]，尽管结果差异很大[[31]]。许多这些技术已成功应用于野生猫科动物，取得了有希望的结果，并支持将家猫作为开发和完善适用于保护计划的协议的宝贵生物医学和转化模型[[32], [33], [34], [35], [36], [37], [38]]。然而，家猫的IVP在不同实验室之间的结果差异显著。报道的卵子成熟率通常在40%到80%之间，囊胚产生率约为10%到40%[[31,39,40]]，这些数值远低于其他物种（如牛[[41]]）。这些次优且高度可变的结果主要是由于猫科IVP协议的显著异质性，包括配子回收方法、培养时间和培养基配方的差异[[42,43]]。这种变异性强调了深入了解家猫特定生殖生理学的必要性，最终目标是建立标准化协议并提高猫科IVP系统的效率和可重复性[[6]]。
在此背景下，将生殖组织或配子运输到实验室的方法是协议中的关键步骤，但目前尚无明确共识。在家猫中，用于IVP的生殖器官主要来自合作兽医医院或诊所的常规卵巢切除术[[31]]。此类程序具有一定的可预测性，通常在受控条件下进行。相比之下，野生猫科动物的情况截然不同，组织回收往往在野外意外发生，因此必须建立稳健的协议以最大化保存这种高价值遗传材料的效率[[44]]。目前家猫IVP协议中，卵巢通常在无菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水（PBS）中运输，有时添加抗生素。根据卵巢子宫切除术与实验室处理之间的时间间隔，卵巢在温暖条件下（30至37°C）或室温（RT）运输（如果运输时间较短<4小时），或在预期运输时间较长时在4°C的冷藏条件下运输[[45], [46], [47]]。多项研究表明，猫科卵巢具有显著的耐冻性，可在4°C下储存长达24小时而不显著影响胚胎产生[[48], [49], [50], [51]]。然而，长时间冷藏会导致卵子超微结构改变，从而影响其发育能力[[52], [53], [54]]。同样，长时间在室温下保存卵巢也会影响胚胎产量[[55]]。
最常用的猫科卵子回收方法是卵巢切片法，这需要在动物死亡后或出于医疗原因进行绝育后进行卵巢切除[[56]]。该技术包括在卵巢皮质上做多个小切口以破裂卵泡并释放卵子，因此通常在实验室中进行[[56]]。然而，最近描述了一种新的技术——卵子采集（OPU），即通过超声引导抽取卵巢卵泡，这种方法在越来越多的野生物种中作为微创卵子回收方法得到应用，并取得了有希望的结果[[57], [58], [59]]。在牛和马物种中，OPU已在野外条件下常规使用，并被证明是一种安全的技术，可以重复应用而不影响动物的生殖状态[[60], [61], [62]]。此外，对于不再适合繁殖的个体来说，这种方法可能特别有价值[[60]]。尽管切片法因是猫科IVP实验室的标准方法而提供可预测的结果，但OPU在该物种中的应用仍然很新，仍存在关于抽吸压力对卵子的影响以及可能因主要穿刺较大卵泡而引入的选择偏倚的问题[[63]]。
随着我们实验室在家猫中开发出OPU技术[[57]]，关于这种物种中分离卵子的最佳运输策略出现了新的问题。尽管已经研究了不同成熟阶段的卵子玻璃化协议[[20]]，但迄今为止尚无研究评估分离猫科卵子的短期运输协议，而这种操作在马和牛物种中是常规进行的[[64,65], [66,67]]。在牛中，最常用的方法是将卵子在维持温度、湿度和大气条件的便携式培养箱中运输[[68]]。然而，这种策略存在重要限制，因为这些系统价格昂贵、运输困难，且通常需要使用减数分裂抑制剂来优化IVF结果[[67,69]]。相比之下，马科卵子的运输更常使用培养基，无论是市售的还是实验室制备的，通常由TCM-199、Hanks盐和Earle盐、胎牛血清和HEPES组成[[70]]。这种方法允许在室温下运输卵子，并在胞浆内精子注射（ICSI）后保持满意的囊胚率[[65,70]]。
为解决这一空白，本研究的目的是确定家猫卵子是否可以使用市售的胚胎培养基（EHM）在室温下运输长达18小时，该培养基含有葡萄糖、丙酮酸、BSA、氨基酸、生长因子和抗生素。作为一种商业产品，这种培养基以小容器密封提供，以确保稳定性，并经过严格的质量控制。这确保了批次间的一致性，通过避免实验室制备培养基的变异性来促进实验的可重复性，并便于在野外条件下使用。首先进行了初步实验，以确认先前描述的4°C卵巢储存协议与我们标准的IVP协议兼容。随后，评估了通过OPU或切片法（SLI）获得的卵子在EHM中立即处理或储存18小时后的减数成熟能力和胚胎产量。这一协议的成功建立具有重要的实际意义，特别是对于在野外条件下应用OPU于野生猫科动物，因为它可以允许将卵子运输到实验室进行进一步处理，同时避免玻璃化过程中常见的活力损失。

**实验设计**
为实现上述目标，设计了三个独立实验（图1）。
**实验1**：进行了四组重复的比较研究，以确定卵巢在4°C下储存24小时与立即处理对IVP的影响。两组实验中的卵子均通过卵巢切片法回收。
**实验2**：进行了四组重复实验，以评估减数成熟情况，每组包括四个实验组。

**精子质量**
所有精子分析的数据均表示为平均值±标准差（mean ± SD）。所有样本均根据最低质量标准选择，以确保它们之间的同质性，平均移动率为79.6±5.6%，平均形态正常率为80.8±7.0%，收集后立即的运动评分最低为4-5。形态正常的精子比例为77.2±9.3%，所有样本均被分类为正常精子。冷冻保存前的顶体完整性为76.4±8.4%。

**讨论**
本研究评估了在室温下使用EHM运输家猫卵子18小时对其减数成熟能力和随后支持胚胎发育的影响。这种方法解决了当前文献中的一个明显空白，因为据作者所知，尽管在牛和马繁殖中常规使用，但分离猫科卵子的短期储存和运输尚未被研究[[1]]。

**结论**
本研究表明，将整个家猫卵巢冷藏长达24小时是用于IVP的生殖器官运输的合适选择。同样，将分离的猫科卵子在室温下储存过夜也支持了这种方法的潜在适用性，预计囊胚产量会减少约50%。因此，储存时间成为影响核成熟和囊胚产量的主要因素。

**作者贡献声明**
安德烈亚·普里戈-冈萨雷斯（Andrea Priego-González）：撰写——原始草案、可视化、资源、方法学、数据分析。
安娜·穆诺兹-马塞达（Ana Munoz-Maceda）：撰写——审阅与编辑、方法学、研究。
豪尔赫·埃尔南德斯-马塔拉佐（Jorge Hernández-Matarazzo）：方法学。
华金·塞尔德拉（Joaquín Cerdeira）：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、研究。
曼努埃尔·加尔多基·阿里亚斯（Manuel Gardoqui Arias）：验证、监督、方法学。
爱德华多·R·S·罗尔丹（Eduardo RS. Roldan）：撰写——审阅与编辑、验证、监督、数据分析、概念化。

**伦理**
所有描述的程序均按照西班牙动物福利伦理委员会（RD 53/2013）进行。

**资助**
本研究由马德里社区工业博士计划（项目编号IND2022/BIO23496和IND2023/BIO27134）资助。

**利益冲突声明**
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：玛丽亚·桑切斯·卡拉布伊格（Maria Sanchez Calabuig）报告称获得了马德里社区教育科学与大学部门的财务支持。