《Theriogenology》：Optimization of sperm cryopreservation and analysis of cryodamage mechanism in spotted sea bass (Lateolabrax maculatus) based on ultrastructure, oxidation and DNA integrity
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张玉欣|王庆华|阮青欣|张伟伟|吴英欣|李家杰|郭凡明|杨森|杨阳|孟子宁生命科学学院，生物控制国家重点实验室/南方海洋科学与工程广东实验室（珠海）/中山大学广东省水生经济动物重点实验室，中国广州，510275摘要精子冷冻保存对于种质资源和人工繁殖至关重要。本研究旨在建立一种优化
张玉欣|王庆华|阮青欣|张伟伟|吴英欣|李家杰|郭凡明|杨森|杨阳|孟子宁
生命科学学院，生物控制国家重点实验室/南方海洋科学与工程广东实验室（珠海）/中山大学广东省水生经济动物重点实验室，中国广州，510275
摘要
精子冷冻保存对于种质资源和人工繁殖至关重要。本研究旨在建立一种优化的斑点海鲈（Lateolabrax maculatus）精子冷冻保存方案，并明确其冷冻损伤特征。我们筛选了包括保护剂、稀释比例、平衡时间、冷却速率和解冻条件在内的冷冻参数。优化后的方案使用含有10%乙二醇（EG）的Hank's缓冲液，精子与保护剂的比例为1:3，平衡时间为10分钟，在液氮上方5厘米处进行10分钟的预冷冻，然后在40°C下解冻6秒。解冻后的精子活力达到72.0 ± 8.6%，受精率为83.4 ± 3.3%，与新鲜精子相当。与新鲜精子相比，冷冻保存的精子在活性氧水平、线粒体膜电位、SOD活性和DNA完整性方面发生了变化，但表现显著优于未经处理的样本。超微结构观察证实，适当的保护剂能够维持质膜和细胞器的完整性。本研究为斑点海鲈提供了一种有效的精子冷冻保存方法，并揭示了EG对结构损伤、氧化损伤和DNA损伤的防护作用。
引言
精子冷冻保存技术已在无脊椎动物和脊椎动物物种中广泛应用了五十多年，主要研究方向是方案的开发和优化[[1], [2], [3]]。迄今为止，已有超过300种水生动物的精子成功实现了冷冻保存，涵盖了从小型辐鳍鱼到大型软骨鱼的各种分类群[4,5]。这项生物技术在水生种质资源管理和保护中起着关键作用。该技术实现了三个主要的保护目标：保持配子的可持续供应、对濒危物种采取保护措施以及提高遗传资源的质量[[6], [7], [8], [9]]。
解冻后精子的质量评估需要评估其活力特征、受精能力、胚胎存活率和后代存活率[[10], [11], [12]]。这些参数可以通过选择性配子富集或方案优化来改善[13]。然而，开发有效的鱼类精子冷冻保存方案需要系统地优化六个相互依赖的参数（保护剂组成、稀释比例、平衡时间、冷冻速率和冷却持续时间），这是一个复杂的多因素过程。关于斑马鱼、青鳉和剑尾鱼的综述也强调了这些参数在鱼类精子冷冻保存中的关键作用[11,14]。冷冻保护剂的配方——保护剂和稀释剂的协同组合——是方案效果的主要决定因素[15]。从机制上讲，保护剂可以减轻相变过程中的热冲击和渗透压应力造成的冷冻损伤，同时保持酶的完整性。稀释剂的作用是维持静止的代谢状态并提供代谢底物，同时抑制过早激活[8,16,17]。此外，冷冻速率是影响细胞完整性的关键因素，与解冻后的存活率有显著相关性。目前，除了优化上述方案的关键参数外，向保护剂中添加外源性抗氧化剂以减少精子冷冻损伤和提高精子质量已成为鱼类精子冷冻保存领域的主流策略[18]。研究表明，褪黑素和谷胱甘肽等抗氧化剂可以显著改善解冻后精子的质量，其在未来精子冷冻保存保护研究中的合理应用也将成为核心考虑因素[19,20]。
尽管精子冷冻保存技术取得了显著进展，但在冷冻过程中精子不可避免地会遭受冷冻损伤，从而影响其功能完整性和繁殖潜力[21]。当代研究表明，冷冻暴露会对多个精子质量参数产生不利影响，包括活力特征、膜结构、核完整性、线粒体功能、活性氧（ROS）水平和酶谱[22]。冷冻损伤主要通过三种机制表现出来：超微结构损伤、氧化应激和DNA片段化。成功冷冻保存的关键取决于对冷冻速率的精确控制。过快的冷却速率会导致细胞内冰晶形成（由于水分排出不完全），而过慢的冷却速率则会导致细胞脱水和高渗应力（通过溶液效应损伤）[23,24]。这两种情况都会主要导致质膜、细胞器和线粒体结构的超微结构损伤。在冷冻保护剂暴露期间，氧化失衡会通过ROS过度产生和抗氧化防御机制受损而加剧冷冻损伤，ROS的产生被认为是冷冻保存引起的DNA损伤的主要致病因素[17,26]。值得注意的是，来自牛和水牛的实验证据证实了ROS对冷冻保存精子运动参数、脂质过氧化过程、线粒体膜极化和遗传物质完整性的损害[27]。
斑点海鲈（Lateolabrax maculatus）是一种具有生态和商业价值的鲈形目物种，分布于中国、日本和朝鲜半岛的沿海水域[28]。作为中国重要的水产养殖品种，野生种群由于过度捕捞和栖息地丧失而大幅减少，而圈养种群则因长期近亲繁殖而出现遗传退化[29]。目前，郭等人已经建立了斑点海鲈精子的冷冻保存方案：使用MPRS作为稀释剂，10% DMSO作为保护剂，采用三步梯度冷冻方法冷却，在?196°C的液氮中储存，然后在37°C的水浴中解冻。该方案实现了67%的解冻后活力率，初步验证了其可行性和实际应用潜力。然而，该研究评估的参数较少，尚未建立系统化和标准化的技术体系[28]。在本研究中，系统优化了六个关键冷冻保存参数，并使用Hanks溶液作为稀释剂、10%乙二醇（EG）作为保护剂，为斑点海鲈精子开发出了特定物种的最佳方案。该方案显著提高了解冻后精子的活力和受精能力。此外，我们系统研究了冷冻-解冻过程中的精子冷冻损伤，为阐明冷冻损伤机制提供了实验证据。这些结果将有助于种质资源的保护、优良品系的选育以及斑点海鲈的大规模水产养殖生产。
部分摘录
亲鱼和配子采集
实验在繁殖高峰期（10月至12月）进行，使用了来自福建省漳浦县志强水产养殖场的性成熟的斑点海鲈亲鱼（3-4岁，体重2.8-3.5公斤）。共使用了20条雄鱼和6条雌鱼，它们在流式混凝土水箱（6 × 10 × 1.5米）中饲养，光照周期为自然光照15小时：黑暗9小时，通过调节海水交换将水温维持在21-23°C。
不同稀释剂对解冻后精子活力的影响
修订后的结果显示，用10% EG冷冻保存的精子与Hank's溶液（71.1 ± 7.6%）和Ringer溶液（68.7 ± 2.8%）之间的活力相当，组间无显著差异（P > 0.05）。尽管冷冻保存组的活力显著低于新鲜对照组（P < 0.05），但其表现优于使用其他稀释剂处理的精子（P < 0.05）（图1A）。
不同冷冻保护剂及其浓度对解冻后精子活力的影响
结果显示，当使用Hank's溶液时...
讨论
在本研究中，我们使用Hanks溶液作为稀释剂、10% EG作为保护剂，开发并优化了一种可靠的、高效的斑点海鲈精子冷冻保存方案，并通过评估超微结构完整性、氧化状态和DNA稳定性系统地表征了精子冷冻损伤。与使用DMSO的传统冷冻保存方法[29]相比，当前方案通过系统优化显著提高了效率
结论
本研究旨在为斑点海鲈精子建立一种特定物种的优化冷冻保存方案，并系统评估解冻后精子的冷冻损伤特征以验证方案的有效性。为此，我们成功开发了一种使用10% EG作为保护剂、Hanks溶液作为稀释剂的优化冷冻保存方案，通过单因素梯度筛选方法确定了最佳技术参数。
CRediT作者贡献声明
张玉欣：撰写——原始草稿、可视化、资源准备、方法论、数据分析、概念化。王庆华：撰写——审阅与编辑、可视化、软件使用、资源准备。阮青欣：撰写——审阅与编辑、可视化、软件使用、资源准备。张伟伟：可视化、资源准备、数据分析。吴英欣：可视化、资源准备、数据分析。李家杰：可视化、资源准备、数据分析。郭凡明：可视化、资源准备、数据分析。
资助
本研究得到了南方海洋科学与工程广东实验室（珠海）（SML2024SP001）、BIO-KEY种质保存计划（HT-99982021-0392）、广东省科学技术计划（2023B1212060023）、海南省自然科学基金项目（324QY575）以及海南省“南海新生”科技创新人才平台项目（NHXXRCXM202374）的支持。
利益声明
作者声明他们在“斑点海鲈（Lateolabrax maculatus）精子冷冻保存方案的优化及冷冻损伤机制分析：超微结构、氧化和DNA完整性评估”方面没有利益冲突。
致谢
作者衷心感谢林志强先生（福建省漳浦县志强水产养殖场）、叶振标先生（广东省珠海市长丰水产种苗科技有限公司）和陈超先生（广东省阳西县金源海洋生物技术有限公司）在亲鱼管理和实验系统实施方面的专业贡献。
