综述：反兴奋剂检测中的干血斑分析：技术挑战、分析进展及未来展望

《Bulletin of the Korean Chemical Society》：Dried blood spot analysis in antidoping: Technical challenges, analytical advances, and future perspectives

　　摘要

干血斑（DBS）分析是一种样本采集技术，所需血液量极少，同时具备许多实际优势，如采集程序简单、样本稳定性高以及运输和储存便捷。由于这些优点，DBS已广泛应用于新生儿筛查、治疗药物监测以及临床和生命科学中的药代动力学研究。近年来，DBS在反兴奋剂检测中的潜力受到了关注，世界反兴奋剂机构（WADA）积极推动基于DBS的分析方法作为传统尿液和静脉血液样本的补充策略。因此，开展了多项研究，旨在开发高灵敏度的分析方法来检测违禁物质，评估DBS采样设备，并改进样本制备技术以克服与样本基质相关的挑战。本文概述了DBS分析的发展及其临床应用，并讨论了其在反兴奋剂检测中的应用理由及WADA的相关策略。同时，还全面探讨了DBS采样和仪器分析中存在的挑战以及为解决这些挑战所取得的最新进展。WADA技术文件中主要关注了类固醇酯类及其他物质的分析方法，以及血液兴奋剂检测中红细胞生成素（EPO）及其标志物的新兴检测方法。最后，本文还讨论了DBS分析在大型体育赛事反兴奋剂检测中的前景。

引言

干血斑（DBS）是一种适用于实际和临床需求的新型采样技术，其起源可以追溯到大规模新生儿筛查项目——仅需几滴毛细血管血液即可实现前所未有的大规模先天性代谢异常检测。这一技术背景对反兴奋剂研究具有重要意义，因为它证明了采样、干燥、储存及分析流程的标准化。在实际应用环境中（通常非受控临床条件下），DBS能够提供可靠的信息支持。在过去二十年里，DBS的应用范围已从筛查扩展到定量生物分析、治疗药物监测、传染病诊断和多组学研究。从方法学角度来看，DBS现已与液相色谱-质谱（LC-MS）和高分辨率质谱（HRMS）平台结合使用，这些技术能够弥补样本量有限的缺陷，并实现高选择性的多重残留物检测。然而，研究人员也指出，DBS并非简单的“小体积全血”样本：血细胞比容（Hct）对样本扩散的影响、取样位置差异、沉积体积的变化以及不均匀的干燥过程可能引入分析前的变异性，这些问题需要积极控制或解决。这些因素在病毒性肝炎和HIV检测等医疗领域得到了广泛应用，其中远程采样和环境运输等DBS物流方式在确保样本稳定性和追溯性方面发挥了重要作用。在蛋白质定量和蛋白质组学研究中，DBS也被视为实现纵向或分散采样的有效工具，但需针对具体应用进行提取效率、卡片吸附性和基质效应的验证。

与此同时，反兴奋剂科学正进入一个分析范围、灵敏度和解释严谨性不断提高的时代，这一趋势受到不断更新的违禁物质清单和日益复杂的兴奋剂行为的推动。下一代反兴奋剂技术有望借助微尺度分离技术、先进的质谱工作流程和集成数据解析方法（包括代谢组学和机器学习）实现更高效的分析。在这种背景下，DBS作为传统静脉血液和尿液检测的补充手段，通过提供更多基于血液的检测指标，同时减轻了物流负担，并实现了更频繁或策略性安排的样本采集。反兴奋剂领域的DBS相关研究和评论强调，DBS并非替代尿液或静脉血液，而是扩展了实际操作可能性的补充工具。

DBS样本通常通过刺破手指或上臂采集，如图1所示，这种方法减少了运动员的负担。从操作角度来看，DBS的优势在于毛细血管采样快速且所需设备简单，降低了静脉穿刺相关的各种挑战（如人员配备、冷链管理和锐器处理）。新型采样设备进一步优化了样本采集过程，实现了更标准化的体积控制和多种解剖部位采样（如上臂），从而在保持微采样优势的同时减少变异性。在反兴奋剂检测中，这些设备创新直接关系到实验室和结果管理的信心——即DBS检测结果能否达到与传统样本相同的可信度。为实现这一目标，需要确保分析性能以及明确的样本适用性、文档记录、储存、重新分析和确认测试操作规则。

图1：DBS采样方法的示意图。DBS能够为类固醇酯类、肽类激素等物质提供额外的检测机会，并比尿液提供更直接的生理信息。比较研究评估了DBS样本与尿液在检测合成代谢类固醇（AAS）和类固醇酯类方面的表现，但低估了其潜力及基质特异性限制（如样本量有限和需要高灵敏度分析流程）。关于不同生物基质中AAS检测的综合性综述进一步支持了基于血液的样本作为尿液补充手段的作用，后者能够提供不同的检测窗口、代谢物模式和分析目标。在仪器分析过程中，离子化效率和样本制备对灵敏度有显著影响，这推动了化学衍生化方法的发展，以提高LC-MS对类固醇的检测灵敏度。由于DBS每个样本仅提供数十微升全血，因此关键分析物（包括类固醇激素）的稳定性和储存行为成为关键因素。比较不同基质中内源性类固醇的定量结果也表明，基质定义在分析和生理学上具有重要影响。

反兴奋剂应用依赖于结果的可靠性、完整性和稳健性。DBS已被用于个人身份识别，这引发了通过采样增强身份验证的兴趣。此外，反兴奋剂检测分析范围的扩大为多类别、高通量和可扩展策略提供了支持。WADA发布的官方技术文件（TDs）规定了DBS的采集设备标准、样本适用性、储存条件、分析流程以及实验室与结果管理部门之间的接口。这些文件明确了DBS作为常规检测新样本的期望，并提出了设备与样本的最小要求。

当前挑战与DBS分析方法学进展

尽管DBS采样在反兴奋剂活动中具有物流和操作优势，但仍需解决一些技术挑战以实现可靠的分析结果。DBS的局限性主要与血细胞比容（Hct）变化、基于血液基质的偏差、采样不准确、材料干扰或工作流程限制有关。最新研究表明，通过技术和流程优化可以显著缓解这些问题。Hct依赖的偏差和体积变化是DBS分析中最主要的偏差来源之一；红细胞计数的差异会影响样本中目标分析物的分布和回收率，从而影响结果准确性。Abu-Rabie等人通过使用内标喷雾结合全斑提取和自动化洗脱程序显著降低了Hct引起的偏差。非破坏性的Hct估算方法（如图像分析）也被提出用于化学补偿。Barroso等人开发了一种灰度扫描方法，能够在定量前准确估计Hct值，从而识别和排除Hct值异常的样本。这些方法在反兴奋剂检测中尤为重要，因为个体间的血液学差异较为常见。认证参考物质的开发也有助于统一标准。Woo等人强调了全斑采样的重要性，以减少样本间的异质性和采样偏差。

为了协调这些要求，WADA通过官方技术文件（TDs）推广了DBS的应用。这些文件规定了采集设备、样本适用性、储存条件、分析流程以及实验室与结果管理部门之间的接口。TD2023DBS确立了DBS作为常规检测新样本的标准，TD2026DBS进一步明确了设备和样本的最小要求，并介绍了包括性能验证在内的最小DBS检测项目。

综上所述，我们从整体角度总结了DBS技术在反兴奋剂检测中的应用：（i）DBS样本特性如何影响分析变异性和结果追溯性；（ii）现代分析流程如何在微采样限制下实现多类别检测；（iii）哪些物质类别和分析策略已在DBS中得到验证（包括类固醇、类固醇酯类、小分子和肽类）；（iv）WADA的TD-DBS要求如何影响验证、确认和常规应用。通过将这些方法学文件与TD2023DBS和TD2026DBS的规定保持一致，我们进一步阐述了DBS技术在反兴奋剂检测中的现状和未来发展方向。

当前挑战与DBS分析方法学进展

尽管DBS采样在反兴奋剂活动中具有物流和操作优势，但仍需解决一些技术挑战以确保分析结果的可靠性。DBS的局限性主要源于Hct变化、基于血液基质的偏差、采样不准确、材料干扰或工作流程限制。最新研究表明，通过技术和流程优化可以显著改善这些问题。Hct依赖的偏差和体积变化是DBS分析中最主要的偏差来源之一；红细胞计数的差异会影响样本中目标分析物的分布和回收率。Abu-Rabie等人通过结合内标喷雾和自动化洗脱程序显著降低了Hct引起的偏差。非破坏性的Hct估算方法（如图像分析）也被提出。Barroso等人开发了一种灰度扫描方法，能够在定量前准确估计Hct值。这些方法在反兴奋剂检测中尤为重要，因为个体间的血液学差异较为常见。认证参考物质的开发也有助于统一标准。

反兴奋剂检测领域的最新进展扩展了DBS的分析范围，包括样本制备和仪器程序的发展，以及检测目标的分析范围。多重DBS技术的总结介绍了WADA技术文件中列出的多种违禁物质类别的检测方法，推动了DBS从可行性研究向实际应用的转变。此外，还发展了超出当前技术文件覆盖范围的检测方法，如红细胞生成素（EPO）和血液兴奋剂检测，或基于蛋白质的生物标志物检测（结合免疫测定）。类固醇酯类的分析进展表明，DBS在反兴奋剂检测中具有复杂性和挑战性；尽管存在基质效应和离子抑制问题，但仍可通过LC-MS实现高灵敏度的检测。早期研究证实了使用DBS监测类固醇酯类的可行性，并证明了定量时间曲线的分析能力。此外，早期研究还表明，通过评估葡萄糖醛酸化模式可以监测类固醇的给药情况，说明DBS既适用于母体化合物检测，也适用于代谢物分析。方法论的扩展随后包括了气相色谱-串联质谱（GC–MS/MS）平台的适配。GC–MS/MS方法结合微量采样技术，实现了对干血中合成类固醇的可靠定量，并成功应用于睾酮凝胶给药研究。这表明，在严格优化提取和衍生化步骤的前提下，DBS分析可以整合到反兴奋剂实验室现有的色谱基础设施中。最近的进展集中在提高灵敏度和分离效率上。衍生化策略提高了难电离类固醇酯的离子化效率。其中，使用Girard试剂P的带电标记衍生化显著增强了信号强度，并通过与高分辨率质谱（HRMS）联用，实现了从DBS样本中检测多种类型的类固醇酯，如图3所示。补充的LC–MS配置提供了额外的结构信息，减少了结构相似的同位素或酯类化合物的干扰，提高了分析的稳健性。这些发展标志着从简单的目标检测向提供可靠结构信息的转变。

DBS样品制备的自动化进一步提高了重复性和通量。与LC–MS/MS集成在线提取系统已被引入用于类固醇酯的检测，这减少了人为错误并提高了通量。后续研究显示，在单次LC–MS运行中可以同时检测睾酮、诺龙、博德龙、甲基睾酮和睾酮丙酸酯。这种将多种酯类目标整合到单一方法中的做法表明了分析技术的进步和操作适用性的提升。DBS在解释性应用以及目标物质的存在检测中也显示出价值。尿液和DBS的联合分析揭示了口服和经皮给药途径之间的差异，突显了基于血液的矩阵在解释中的互补信息。关于样品稳定性的研究确保了DBS中睾酮酯的检测能力，支持了常规反兴奋剂操作中的适当储存和运输条件。这些数据为定义样品采集前的处理要求提供了重要依据。WADA实验室之间的比较研究支持了DBS方法的可靠性。比较血清和DBS对睾酮酯的分析显示了多个实验室之间的一致性和可重复性。对替代分析工作流程的研究也阐明了可能影响稳健性的关键因素。此外，关于全血和DBS矩阵中雄烯二酮、睾酮和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的纵向监测的研究支持了DBS在运动员生物护照（ABP）相关内分泌监测中的适用性。

在内源性合成代谢物（AAS）分析中，通过使用DBS平台取得了技术进步。基于超高效液相色谱（UHPLC）–MS/MS的类固醇分析工作流程显示出足够的灵敏度，能够检测到与睾酮给药相关的生理变化。结合体积吸收微量采样（VAMS）设备和LC–MS/MS的分析能力得到了提升，允许在有限体积的血液中定量内源性AAS和II期代谢物。这些发展可能减少与血液稀释（Hct）相关的问题，并为类固醇分析的标准化提供信息。由于结构异构体导致的解释模糊性给类固醇酯分析带来了重要挑战。针对DBS中E/Z类固醇异构体的紫外光谱特性和计算建模的研究为异构体区分提供了可行性。这些技术对于识别超出当前筛查标准的设计或结构改良类固醇可能变得更加重要。DBS在反兴奋剂检测中的分析范围已迅速从早期可行性验证扩展到经过验证的、操作上可行的方法，涵盖了WADA技术文件中提到的多种物质类别。这一扩展是由以下因素推动的：（i）需要与频繁检测兼容的微创血液采集方法；（ii）LC–MS/MS和LC–HRMS在复杂全血矩阵中的灵敏度提升；（iii）自动化和高通量工作流程的出现，减少了分析前和分析过程中的变异性。早期的概念和技术工作确立了DBS作为比赛内和比赛外策略的补充矩阵的实用性，同时考虑了全血特有的限制因素，如Hct效应和有限的样本体积。

从单一分析物或单一类别检测到多类别初始检测程序的演变是一个显著趋势。完全自动化的DBS样品制备已被证明能够敏感地检测低分子量化合物，并支持高通量处理，增强了常规反兴奋剂操作的可行性。同时，专门为兴奋剂控制设计和验证了全面的DBS ITPs，整合了自动化工作流程以减少操作依赖性并标准化提取和分析过程。这些方法由基于HRMS的筛查方法补充，后者能够对全扫描数据进行回顾性查询，这一点在禁止物质和报告要求不断变化时尤为重要。

肽激素、蛋白质生物标志物和大分子是反兴奋剂检测中的主要挑战，因为它们在DBS中的分析面临矩阵复杂性、吸附和稳定性问题。尽管如此，多项研究报道了有意义的进展。针对小肽的多目标筛查方法表明，优化的提取和HRMS策略可以在单一分析框架内支持更广泛的肽类覆盖。DBS分析工作流程也用于生长激素（GH）滥用检测，证实单个DBS样本可以支持近期GH滥用的检测。

多样化的分析方法专注于针对与体育兴奋剂相关的肽类治疗药物及其类似物的分析。LC–MS/MS在DBS中对促红细胞生成素（GH）的分析显示了在干燥矩阵中的靶向肽类检测的可行性。类似地，DBS中的peginesatide质谱方法证明了其在红细胞生成相关肽类目标检测中的适用性，扩展了DBS在EPO相关领域的应用范围。此外，针对sotatercept的LC–HRMS方法也展示了如何针对兴奋剂控制需求研究靶向大分子方法。

与DBS相关的工作还研究了IGF-1和GH轴标志物。在DBS中定量胰岛素样生长因子-1为GH相关检测策略提供了基础，特别是在需要重复微量采样的纵向解释时。关于使用胰岛素作为模型蛋白的毛细血管干血中完整IGF-I的定量进一步强化了DBS在干燥矩阵中检测完整蛋白质的可行性。其他研究评估了水溶性DBS，提供了关于如何优化DBS化学性质和底物特性以提高大分子回收率和稳健性的更广泛见解。

DBS在反兴奋剂检测中的应用已从早期可行性验证扩展到经过验证的、操作上可行的方法，涵盖了WADA技术文件中提到的多种物质类别。这一扩展得益于：（i）需要与频繁检测兼容的微创血液采集方法；（ii）LC–MS/MS和LC–HRMS在复杂全血矩阵中的灵敏度提升；（iii）自动化和高通量工作流程的出现，减少了分析前和分析过程中的变异性。早期的概念和技术工作确立了DBS作为比赛内和比赛外策略的补充矩阵的实用性，同时考虑了全血特有的限制因素，如Hct效应和有限的样本体积。

从单一分析物检测到多类别初始检测程序的演变是一个显著趋势。完全自动化的DBS样品制备已被证明能够敏感地检测低分子量化合物，并支持高通量处理，增强了常规反兴奋剂操作的可行性。同时，专门为兴奋剂控制设计和验证了全面的DBS ITPs，整合了自动化工作流程以减少操作依赖性并标准化提取和分析过程。这些方法由基于HRMS的筛查方法补充，后者能够对全扫描数据进行回顾性查询，这在禁止物质和报告要求不断变化时尤为重要。

肽激素、蛋白质生物标志物和大分子是反兴奋剂检测中的主要挑战，因为它们在DBS中的分析面临矩阵复杂性、吸附和稳定性问题。尽管如此，多项研究报道了有意义的进展。针对小肽的多目标筛查方法表明，优化的提取和HRMS策略可以在单一分析框架内支持更广泛的肽类覆盖。这通过DBS分析工作流程得到了补充，例如用于生长激素（GH）滥用的检测，证实单个DBS样本可以支持近期GH滥用的确定。

DBS在反兴奋剂检测中的分析范围已迅速扩展，从早期可行性验证发展到经过验证的、操作上可行的方法，涵盖了WADA技术文件中提到的多种物质类别。这一扩展是由以下因素推动的：（i）需要与频繁检测兼容的微创血液采集方法；（ii）LC–MS/MS和LC–HRMS在复杂全血矩阵中的灵敏度提升；（iii）自动化和高通量工作流程的出现，减少了分析前和分析过程中的变异性。早期的概念和技术工作确立了DBS作为比赛内和比赛外策略的补充矩阵的实用性，同时考虑了全血特有的限制因素，如Hct效应和有限的样本体积。

从单一分析物检测到多类别初始检测程序的演变是一个显著趋势。完全自动化的DBS样品制备已被证明能够敏感地检测低分子量化合物，并支持高通量处理，增强了常规反兴奋剂操作的可行性。同时，专门为兴奋剂控制设计和验证了全面的DBS ITPs，整合了自动化工作流程以减少操作依赖性并标准化提取和分析过程。这些方法由基于HRMS的筛查方法补充，后者能够对全扫描数据进行回顾性查询，这在禁止物质和报告要求不断变化时尤为重要。

肽激素、蛋白质生物标志物和大分子是反兴奋剂检测中的主要挑战，因为它们在DBS中的分析面临矩阵复杂性、吸附和稳定性问题。尽管如此，多项研究报道了有意义的进展。针对小肽的多目标筛查方法表明，优化的提取和HRMS策略可以在单一分析框架内支持更广泛的肽类覆盖。这通过DBS分析工作流程得到了补充，例如用于生长激素（GH）滥用的检测，证实单个DBS样本可以支持近期GH滥用的确定。

多样化的分析方法专注于针对与体育兴奋剂相关的肽类治疗药物及其类似物的分析。LC–MS/MS在DBS中对促红细胞生成素（GH）的分析显示了在干燥矩阵中的靶向肽类检测的可行性。类似地，DBS中的peginesatide质谱方法证明了其在红细胞生成相关肽类目标检测中的适用性，扩展了DBS在EPO相关领域的应用范围。同样，针对sotatercept的LC–HRMS方法也展示了如何针对兴奋剂控制需求研究靶向大分子方法。

与DBS相关的工作还研究了IGF-1和GH轴标志物。在DBS中定量胰岛素样生长因子-1为GH相关检测策略提供了基础，特别是在需要重复微量采样的纵向解释时。关于使用胰岛素作为模型蛋白的毛细血管干血中完整IGF-I的定量进一步强化了DBS在干燥矩阵中检测完整蛋白质的可行性。其他研究评估了水溶性DBS，提供了关于如何优化DBS化学性质和底物特性以提高大分子回收率和稳健性的更广泛见解。

DBS应用于GH异构体检测，使用毛细血管DBS。物质给药剂量和大规模现场采集是定义实际场景下分析可靠性的关键因素。对于促红细胞生成素刺激剂，快速筛查方法在DBS中对连续促红细胞生成素受体激活剂的检测表明，即使是对挑战性生物目标的检测，适当的检测设计也能采用DBS兼容的策略。同样，针对肽类兴奋剂如生长激素释放肽2（GHRP-2）的DBS聚焦研究显示，DBS可以提供可行的检测窗口，同时强调了静脉和毛细血管DBS之间的差异以及采样点考虑的重要性。

DBS也被用于检测血液检测窗口可能比尿液短的物质，但在操作上仍有意义。例如，研究表明单次剂量后的克伦特罗可以在DBS中检测到，其稳定性和检测窗口的评估支持了其实际用途。此类工作在反兴奋剂背景下尤为重要，因为在运输/储存期间确认识别和稳定性至关重要。还为特定禁止或监测的治疗药物（包括trimetazidine）开发了分析方法。基于DBS的兴奋剂控制方法表明，即使对于解释难度大的化合物，也能实现稳健的定量，有助于扩展检测范围，超出传统的兴奋剂/阿片类药物领域。

此外，配对的DBS和尿液采样在矩阵之间提供了重要的桥梁，展示了如何将DBS与传统的尿液检测相结合，在实际的兴奋剂控制环境中生成互补证据，并与现有的基于尿液的决策框架一起完善解释。在丹麦健身中心的配对样本研究中，DBS结果与多种物质类别的尿液结果模式一致，包括S1类合成代谢物（如博德龙、诺龙、屈螺酮、斯坦诺唑醇和奥斯塔林）、克伦特罗，以及S4类调节剂如阿那雄唑/来曲唑和他莫昔芬/克罗米芬。

兴奋剂仍然是关键的目标类别，其中基于血液的信息可以补充尿液检测结果，特别是对于仅在比赛期间使用的物质。DBS对麻黄碱的可行性已经得到验证，同时考虑了DBS浓度与常规静脉血浆测量之间的关系，支持了比赛期间血液浓度的解释。早期比较尿液分析和DBS分析的研究也有助于定义DBS如何支持或完善阈值或短效兴奋剂的检测策略。

除了传统的兴奋剂外，DBS和其他微量采样技术也被用于分析新兴的特定兴奋剂，如合成卡西酮类。LC–MS/MS方法结合体积吸收微量采样（VAMS）能够在干燥矩阵中定量卡西酮类似物，便于在体育相关背景下监测这些化合物。在不断发展的药物市场中，UHPLC–HRMS–四极杆飞行时间工作流程为基于血液矩阵的新精神活性物质的大规模面板提供了相关的方法论基础，因为类似的HRMS原理和验证方法可以适应以DBS为中心的反兴奋剂筛查。

阿片类药物和镇痛药是另一类DBS具有操作优势的领域，因为它在保持分析可靠性的同时提供了操作上的便利。特拉马多尔已被广泛研究：在自行车比赛中相关的DBS检测展示了实际样本采集和比赛条件下的分析实施。互补的高通量方法实现了DBS中特拉马多尔及其活性代谢物（O-去甲基特拉马多尔）的自动化分析，支持了在检测量增加时可扩展的工作流程。

更广泛地说，完全自动化的LC–MS/MS方法结合在线DBS提取已被用于复杂矩阵中的阿片类药物分析，无需传统的DBS穿孔。对于羟考酮及其代谢物的分析，比较了干燥微矩阵（如DBS和VAMS）与经典兴奋剂样本（如血浆和尿液）。考虑到样本的稳定性和灵敏度，干燥微矩阵也可以用于设计专用的反兴奋剂检测方法。干燥微矩阵也可用于大麻素分析。比较DBS和VAMS时，VAMS受Hct的影响较小；两种微量采样方法的结合应用使它们能够扩展到大麻素和更广泛的药物分析中。基于DBS的方法在平衡操作简便性和严格的定量/识别要求方面发挥了作用。

随着DBS分析在多个分析领域的广泛应用，解释和矩阵可比性的考虑变得至关重要。比较液体和干燥血液矩阵在纵向监测中的研究强调了在将血浆/血清实践应用于DBS时，应理解全血干燥和矩阵复杂性。关于分析物在控制环境中的代谢和分布的研究支持了药物药代动力学可以指导兴奋剂控制解释的观点。

为了便于比较本节引用的44项研究，我们在表1中总结了目标分析物、采样方法和报告的分析灵敏度。使用了基于纤维素的DBS卡片（包括DMPK-C卡片和Whatman 903蛋白质保存卡片）作为样本采集设备，以及较少受Hct效应影响的体积微量采样设备（如TASSO?和VAMS）。不同样本类型（38, 41, 63）之间的灵敏度没有显著差异。根据WADA TD2026DBS，类固醇酯被赋予了较低的最低要求性能水平1 ng/mL，因此针对这一类别的方法往往能够实现较低的LOD。相比之下，如GH释放肽这样的小肽的MRPL较高，为20 ng/mL，这反映在S2组分析物通常报告的较高LOD中。虽然也使用了GC、免疫测定和ELISA，但DBS分析采用了基于LC–MS的方法。此概述有助于快速评估某一物质类别的分析方法和性能。表1总结了分析特性，包括仪器方法、采集设备和检测限。

| 物质 | 方法 | 样本类型 | LOD (ng/mL) | 参考文献 |
|-----------------|------------------------|--------------|-------------|-------------------|
| S0：未经批准的物质 | AdipoR-激动剂 | LC–HRMS | DBS | 5–10 | 74 |
| | SIRT1激活化合物 | LC–HRMS, LC–MS/MS | DBS | 10–50 | 73 |
| | 合成代谢类固醇（AASs） | AAS | GC–MS | VAMS | 0.1–0.78 | 36 |
| | 合成代谢类固醇（AASs） | LC–MS/MS | VAMS | 0.02–20 | 48 |
| | 合成代谢类固醇（AASs） | AAS | LC–MS/MS | DBS | — | 34 |
| | 合成代谢类固醇（AASs） | AAS | LC–MS/MS | DBS | 0.02–50 (LLOQ) | 47 |
| | 合成代谢类固醇（AASs） | AAS | LC–HRMS | DBS | — | 49 |
| | 合成代谢类固醇（AASs） | AAS | LC–HRMS | DBS, TASSO? | 0.03–2.25 | 65 |
| | 合成代谢类固醇（AASs） | AAS | LC–HRMS | DBS | 0.05–0.5 | 54 |
| | 克伦特罗 | LC–MS/MS | DBS | 0.03 | 75 |
| | 甲基睾酮 | LC–MS/MS | DBS | — | 42 |
| | 斯坦诺唑醇 | LC–MS/MS | DBS | 0.02–0.8 | 50 |
| | 类固醇酯（睾酮、诺龙、博德诺酮） | LC–HRMS | DBS | 0.2–0.5 | 39 |
| | 类固醇酯（睾酮、诺龙、博德诺酮） | LC–MS/MS | DBS | 0.05–1.0 | 45 |
| | 类固醇酯（睾酮、诺龙、雄甾烷醇、博德诺酮） | LC–HRMS | DBS | 0.03–125 | 37 |
| | 类固醇酯（睾酮、诺龙、博德诺酮） | LC–MS/MS | DBS, TASSO? | 0.05–0.25 | 38 |
| | 类固醇酯（睾酮、诺龙、博德诺酮） | LC–MS/MS | DBS, TASSO? | <0.1–0.9 | 41 |
| | 睾酮 | LC–HRMS | DBS | 0.05–0.2 | 43 |
| | 睾酮 | LC–MS/MS | DBS | 0.1 | 40 |
| | 睾酮 | LC–MS/MS | DBS | 0.06–0.08 | 46 |
| | 肽类激素、生长因子及相关物质 | GHRP | LC–MS/MS | DBS | 0.05 | 63 |
| | hGH | 免疫测定 | DBS | 24–228 | 56 |
| | 伊布塔莫伦 | LC–HRMS | DBS, TASSO? | 0.25–0.5 | 65 |
| | IGF-1 | LC–MS/MS | DBS | 25–47 | 46 |
| | IGF-1 | LC–MS/MS | DBS | 50 (LLOQ) | 59 |
| | IGF-1 | LC–HRMS | VAMS | 50 (LLOQ) | 60 |
| | 佩吉纳赛肽 | LC–MS/MS | DBS | 10 | 58 |
| | 重组及垂体生长激素 | 免疫测定 | TASSO? | 0.041 | 62 |
| | 血清抗体（SERA） | ELISA | DBS, VAMS | 0.01462 | 76 |
| | 小肽 | LC–MS/MS | DBS | 0.5–20 | 51 |
| | 小肽 | LC–HRMS | DBS, TASSO? | 1–10 | 55 |
| | 四十四肽 | LC–HRMS | DBS | 0.05 | 64 |
| | β2-激动剂 | LC–HRMS | DBS | 0.5 | 54 |
| | 特布他林 | LC–HRMS | DBS, TASSO? | 0.75–0.93 | 47 |
| | 激素及代谢调节剂 | 香草酸酶抑制剂 | LC–HRMS | DBS | 0.05–0.125 | 54 |
| | 胰岛素 | LC–MS/MS | DBS | 30 | 61 |
| | 曲美他嗪 | LC–HRMS | DBS | 0.05 | 64 |
| | 利尿剂及掩蔽剂 | 利尿剂 | LC–MS/MS | 0.2 | 65 |
| | 氢氯噻嗪 | LC–HRMS | DBS | 0.25 | 54 |
| | 兴奋剂 | 卡西酮类似物 | LC–MS/MS | VAMS | 10 | 67 |
| | 可卡因及其代谢物 | LC–MS/MS | VAMS | 0.3–0.8 | 77 |
| | 麻黄碱 | LC–MS/MS | DBS, TASSO? | 1 | 78 |
| | 麻黄碱及甲基麻黄碱 | LC–MS/MS | DBS | 5 | 79 |
| | 伪麻黄碱 | LC–MS/MS | DBS | 0.8 | 50 |
| | 兴奋剂 | LC–MS/MS | DBS | 0.05–0.5 | 54 |
| | 鸦片类药物 | LC–HRMS | DBS | 1.3–6.3 | 68 |
| | 鸦片类药物 | LC–MS/MS | DBS, VAMS | 0.1–1 (LLOQ) | 70 |
| | 奥施康定及其代谢物 | LC–MS/MS | DBS | 0.15 | 71 |
| | 曲马多 | LC–MS/MS | DBS | 2 | 31 |
| | 曲马多 | LC–MS/MS | DBS | 5 | 69 |
| | 大麻素类 | 合成大麻素 | LC–MS/MS | DBS, VAMS | 0.03–0.1 | 72 |
| | THC | LC–HRMS | DBS | 0.25 | 54 |
| | 糖皮质激素 | LC–HRMS | DBS | 0.125–0.25 | 54 |
| | β-阻滞剂 | LC–HRMS | DBS | 0.05–0.125 | 54 |
| | 普萘洛尔 | LC–MS/MS | DBS | 0.5 | 80 |
| | β-阻滞剂 | LC–MS/MS | DBS | 0.5 | 80 |

**注：**每个目标或组别均根据相应的参考文献进行分类。合成代谢类固醇（AASs）包括雄甾酮、表睾酮、乙氧基胆甾醇酮、睾酮、5α-雄甾烷二醇和5β-雄甾烷二醇。除了世界反兴奋剂机构（WADA）的检测方法外，数据库扫描（DBS）技术还应用于新的反兴奋剂分析中。

数据库扫描（DBS）的应用范围正在不断扩大，不仅限于小分子的液相色谱-质谱（LC–MS/MS）流程，还显示其在生物制剂、生物标志物驱动的研究以及新兴的基因兴奋剂监测中具有实用价值。一个明显的例子是将促红细胞生成素（EPO）受体激动剂（ERA）检测适应于低体积DBS技术，通过单次DBS点检测实现了血清/血浆的最小性能要求，并在实际储存条件下保持了分析稳定性。后续的现场和应用导向研究进一步证明了这一点，包括使用不同的微采样格式分析内源性EPO，并评估了可能干扰解释的复杂生物模式。此外，对重组EPO和睾酮的受控微剂量分析展示了DBS如何与基于尿液的常规方法和确认工具（如离子阱质谱IRMS）相结合，强调了采样体积和格式对实际灵敏度的影响。

对EPO c.577del变异体的基因表征解决了电泳检测中的潜在不确定性问题，因为这种变异会导致非特异性结合。基于DBS的DNA分析实现了基于测序的分辨率，包括对尿液和DBS中DNA产量的系统评估。这些方法将DBS从替代性基质转变为解决问题的工具，当分析中出现非典型模式时可以加速决策过程。类似地，DBS还用于高通量样本鉴定，通过单核苷酸多态性面板和基质辅助激光解吸飞行时间质谱技术进行了评估，确定了替代或交换的风险，并建立了常规类固醇分析的指导原则。这些身份和解释工具对于DBS扩展到远程监督或分散式采集模式至关重要。

**图4** 使用钠月桂酰肉碱聚丙烯酰胺凝胶电泳（SAR-PAGE）和免疫检测方法检测促红细胞生成素受体激动剂（ERAs）和内源性促红细胞生成素（hEPO）。（a）ERAs和hEPO信号与60 μL全血中的DBS点数量的关系。（b）ERAs和hEPO信号与单个干燥血液点（DBS）中的全血体积（20 μL至75 μL）的关系（转载自参考文献87，版权2022，经Wiley-VCH许可）。DBS还为基因兴奋剂检测提供了有意义的见解，因为分析目标是核酸而非传统的小分子。先前的研究表明，可以使用实时聚合酶链反应（PCR）从DBS中检测到EPO转基因目标，从而简化样本处理。最近的方法开发专注于提高灵敏度，强调了聚合物体积设备在转基因回收和检测稳健性方面的优势，即使在低浓度下也是如此。因此，DBS已被认为是一种替代新鲜血液的候选基质，用于非法基因目标的检测。相关研究将基因兴奋剂概念应用于动物和模型系统，例如使用定量PCR和数字PCR进行马DBS测试，以及与下一代测序工作流程结合的小鼠模型。

在蛋白质和肽类的分析中，DBS也被用于检测重组人生长激素暴露的生物标志物以及如人绒毛膜促性腺激素等蛋白质目标，通过智能采样将样本制备集成到采样器本身中，简化了工作流程。同时，引入了针对复杂生物目标的质量谱工作流程，包括使用亲和纯化和场不对称离子迁移谱技术来减轻干扰，扩展了目标分析物的分子量范围。此外，DBS还用于高通量样本鉴定，通过时间依赖性的靶向肽比率估计采样后的时间。

**图4** 使用钠月桂酰肉碱聚丙烯酰胺凝胶电泳（SAR-PAGE）和免疫检测方法检测促红细胞生成素受体激动剂（ERAs）和内源性促红细胞生成素（hEPO）。（a）ERAs和hEPO信号与60 μL全血中的DBS点数量的关系。（b）ERAs和hEPO信号与单个干燥血液点（DBS）中的全血体积（20 μL至75 μL）的关系（转载自参考文献87，版权2022，经Wiley-VCH许可）。DBS还为基因兴奋剂检测提供了有意义的见解，因为分析目标是核酸而非传统的小分子。先前的研究表明，可以使用实时聚合酶链反应（PCR）从DBS中检测到EPO转基因目标，从而简化样本处理。最近的方法开发专注于提高灵敏度，强调了聚合物体积设备在转基因回收和检测稳健性方面的优势，即使在低浓度下也是如此。因此，DBS已被认为是一种替代新鲜血液的候选基质，用于非法基因目标的检测。

**DBS在奥运会中的实施演变：从试点验证到操作整合**
2020年东京奥运会标志着DBS分析在奥运会反兴奋剂环境中的首次结构化应用。尽管当时尚未在现场进行毛细管DBS采样，但实验室使用EDTA全血通过DBS卡片进行了69种类固醇酯的分析。这种方法作为过渡验证阶段，评估了主要赛事条件下的分析灵敏度和特异性。DBS不是独立的基质，而是作为传统血液检测工作的补充工具，为未来的实施奠定了技术基础。2022年北京冬奥会时，DBS正式作为独立的分析基质引入反兴奋剂程序。与自动血液采样（ABP）不同，共分析了105个DBS样本，重点检测六种睾酮酯。使用了高分辨率质谱（HRMS，LC–HRMS，Q Exactive HF），并在24–48小时的报告框架内提供了结果。这一实施证明了毛细管干燥血液采样不仅在分析上可靠，而且在大型体育赛事中也是操作上可行的。到2024年巴黎奥运会时，DBS已从创新阶段发展到成熟应用，共分析了196个DBS样本，重点检测类固醇酯，包括睾酮、博德诺酮和诺龙酯。随着从东京的实验室验证到北京的正式现场应用，再到巴黎的全面操作整合，DBS作为奥运会反兴奋剂框架中的可持续基质得到了验证。

**基于WADA年度报告（2022–2024）的DBS测试全球实施**
根据WADA的测试数据，过去三年中DBS分析的实施显著增加。2022年全球共分析了2748个DBS样本，2023年和2024年分别增加到4242个和5214个。2022年至2023年间增长了54%，2024年又增加了23%，三年间实现了两倍的增长。这些数据表明DBS测试正在逐步整合到全球反兴奋剂测试框架中。尽管DBS的负面分析发现（AAF）数量从2022年的4例增加到2024年的11例，但总体AAF率相对较低。这应考虑到DBS测试当前的分析范围有限，目前DBS覆盖的禁用物质范围有限，从而减少了可能的AAF总数。尽管如此，AAF率从2022年的0.15%逐渐增加到2024年的0.21%。这一增长趋势表明实验室正在逐步扩大DBS工作流程中的目标分析物范围，以提高分析覆盖率和实际相关性。在此期间，进行DBS分析的WADA认证实验室数量也有所增加。2022年，仅有5个实验室报告了DBS（干燥血液取样）检测，但这一数字在2023年翻了一番，达到10个。到2024年，有9个实验室进行了DBS分析。值得注意的是，除了奥运主办国的实验室参与外，2024年并未观察到额外的实验室数量扩张，这表明在更广泛的实验室中推广DBS技术仍然存在技术挑战。方法开发、遵守世界反兴奋剂机构（WADA）的技术要求以及ISO/IEC 17025认证要求仍是实现广泛应用的主要障碍。总体而言，DBS检测已从一项探索性举措发展成为反兴奋剂检测中的一个补充手段，进一步的标准化和基础设施建设对其持续发展至关重要。

DBS分析已从一种临床微量采样工具发展成为越来越实用的反兴奋剂检测方法。尽管DBS能够实现最小侵入性的样本采集和简化运输，并提供大规模的血液相关数据，但它并不能简单地替代液态血液或尿液样本。必须管理其中固有的变异性因素，包括血红蛋白浓度（Hct）的影响、样本体积的不确定性、底物效应以及全血基质效应。最新研究指出，通过采样策略、自动化提取技术、内部标准化以及针对小样本量设计的灵敏LC–MS分析流程，可以缓解这些限制。改进的基于DBS的分析方法不仅适用于反兴奋剂检测，还可应用于多种生物医学和分析领域。在法医毒理学中，DBS采样在死后样本分析中显示出其优势，因为干燥基质中的分析物稳定性优于传统液态样本。此外，DBS还可用于环境污染物监测；DBS平台结合LC–MS/MS方法已被验证可用于大鼠和人体血液样本中农药的检测。在治疗药物监测方面，基于LC–MS/MS的技术已成功实现对DBS和干燥血浆样本中七种抗癫痫药物的同步定量分析，表明在家中采样在分析上是可行的。

值得注意的是，随着监管框架的明确化，分析技术也取得了进展。WADA的TDDBS框架增强了数据解释的一致性，方法开发也日益符合这些要求，通过可重复的标准化工作流程来实现。对于类固醇酯等复杂目标物，分析技术也有了显著提升。此外，DBS的应用范围正在扩展，不仅限于当前的技术领域，还包括与兴奋剂检测相关的应用和生物标志物研究，这进一步凸显了其未来的广阔前景。DBS被视为下一代反兴奋剂检测的补充手段，其发展依赖于设备、自动化工作流程以及实验室间标准化的持续协调。

本研究得到了韩国科学技术院（KIST）内部资助（项目编号2V10481）的支持。

**数据可用性声明**
由于本研究过程中未生成或分析任何数据集，因此不适用数据共享的规定。