通过HDR/NHEJ-CRISPR/Cas9系统生成的两种重组火鸡疱疹病毒在免疫效力方面的研究：这些病毒表达了新城疫病毒VII基因型的融合蛋白以及H9N2禽流感病毒的血凝素蛋白

《Veterinary Microbiology》：Immune efficacy of two recombinant Turkey herpesviruses expressing the fusion protein of Newcastle disease virus genotype VII and hemagglutinin protein of H9N2 avian influenza virus generated by HDR/NHEJ-CRISPR/Cas9 systems

　　

王浩然|杨慧明|钟康宇|王荣|赵静|赵晔|张国忠

中国农业大学兽医学院兽医公共卫生与安全国家重点实验室，北京，中国

摘要

新城疫病毒（NDV）和H9N2禽流感病毒（AIV）是对家禽养殖业的两大威胁。目前针对这两种疾病的疫苗接种计划较为复杂，需要大量的劳动力和资源，而且重复接种可能会给动物带来压力。因此，开发一种能够同时提供针对这两种感染保护的简化单剂量疫苗策略是非常必要的。基于重组火鸡疱疹病毒（rHVT）的活疫苗为控制禽类病毒性疾病提供了一个有吸引力且有效的平台。本研究利用同源定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）依赖的CRISPR/Cas9基因编辑技术，生成了两种rHVT，即rHVT-OHA-OF(U)和rHVT-OHA-OF(H)，这两种病毒分别共表达了NDV aSG10株的F蛋白和H9N2 G株的HA蛋白。体外实验表明，这两种rHVT能够正确表达F蛋白和HA蛋白。在初级鸡胚成纤维细胞（CEF）中传代10次后，外源蛋白仍能稳定表达。体内实验中，虽然rHVT-OHA-OF(H)在感染H9N2 G株后3天和5天时能够有效阻止病毒排毒，但在感染NDV aSG10株后未能显著降低死亡率；相比之下，rHVT-OHA-OF(U)在感染NDV aSG10株后能够100%防止死亡，并显著抑制病毒排毒，在感染H9N2 G株后3天也显著减少了病毒排毒，显示出作为针对这两种病毒疾病的候选疫苗的潜力，但还需要进一步优化。本研究为开发针对NDV和/或H9N2的基于rHVT的活疫苗提供了参考，从而为设计双插入或多插入的rHVT奠定了基础。

引言

家禽养殖是畜牧业中的一个关键领域，预防和控制病毒性疾病一直是家禽生产中的主要问题。其中，NDV和H9N2是威胁生产的主要病原体。NDV会导致家禽出现呼吸系统、消化系统和神经系统疾病，导致高死亡率（Hu等人，2022年）。虽然H9N2本身不会直接导致高死亡率，但它会向其他流感亚型传递基因片段，促进如H5Nx、H7Nx和H10N8等大流行株的出现，这些病毒对家禽和人类都构成重大威胁（Gu等人，2014年；Guan等人，1999年；Liu等人，2014年；Pu等人，2015年）。

目前，NDV主要通过弱毒活疫苗及其灭活疫苗进行控制，其中LaSota和B1株使用最为广泛（Hu等人，2022年）。而H9N2的预防和控制主要依赖于灭活疫苗（Sun和Liu，2015年）。传统疫苗需要频繁接种，导致相对较高的劳动力和耗材成本，而且重复接种可能会给家禽带来压力。因此，迫切需要能够通过单剂量提供多重疾病保护的疫苗。基于HVT载体的疫苗表达多种抗原，是一种理想的解决方案。此外，这种疫苗可以克服母源抗体的干扰（Pan等人，2022a），诱导长期免疫力，并确保安全性（Shi等人，2024年；Wu等人，2026年）。根据最新的ICTV分类，HVT属于Orthoherpesviridae科、Alphaherpesvirinae亚科和Mardivirus属（https://ictv.global/taxonomy）。HVT的基因组是一种线性双链DNA，长度约为160 kbp（Afonso等人，2001年）。其众多的非必需区域允许插入外源基因，这为开发表达多种抗原的疫苗提供了显著优势（Gao等人，2011年；Jia等人，2022年；Tang等人，2020年；Zai等人，2022a年）。目前，已有几种表达多种抗原的rHVT上市，包括Ultifend? IBD ND、Innovax? ND-ILT和Vaxxitek? HVT+IBD+ND等。

近年来，CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术发展迅速，并被广泛用于插入外源基因。与同源重组和BAC突变相比，这种方法更为方便和高效（Tang等人，2018年）。在这种方法中，Cas9蛋白在单导向RNA（sgRNA）的引导下定位到特定位点，诱导DNA双链断裂，然后通过HDR或NHEJ将外源基因整合到目标位点（Jia等人，2022年；Tang等人，2020年）。

本研究利用基于HDR/NHEJ-CRISPR/Cas9的基因编辑技术，生成了两种共表达NDV F蛋白和H9N2 HA蛋白的rHVT，即rHVT-OHA-OF(H)和rHVT-OHA-OF(U)，为将外源基因整合到HVT基因组中提供了高效平台，促进了rHVT的快速开发。后续评估表明，rHVT-OHA-OF(U)在感染同源NDV后能100%防止死亡，并显著抑制病毒排毒；在感染同源H9N2后3天也能有效抑制病毒排毒，显示出作为候选疫苗的潜力，但需要进一步优化。这些发现为开发针对NDV和H9N2禽流感的有效疫苗提供了基础。

章节片段

细胞与病毒

我们的实验室保存了HVT FC126株（NCBI登录号：AF291866.1）。HVT FC126或rHVT在从9至11天大的SPF胚胎中分离出的CEF细胞中培养，这些细胞使用Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，纽约州格兰德岛）进行培养，培养基中添加了5%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素、0.1 mg/ml的链霉素和0.25 μg/ml的两性霉素B。H9N2 A/chicken/Hebei/G/2012（G）株（BJ/94亚型III）是从接种过的种禽中分离得到的。

两种rHVT的成功生成

为了生成rHVT-OHA-OF(H)和rHVT-OHA-OF(U)，使用EGFP基因作为报告基因，并将OHA和OF基因表达盒依次插入HVT基因组中。经过纯化后，获得了两种rHVT，即rHVT-OHA-OF(H)和rHVT-OHA-OF(U)。通过使用插入位点两侧的引物进行PCR验证，确认了正确的插入和病毒纯度。HVT FC126作为对照。参与这两种rHVT的三个插入位点——SORF3/US2、HVT065/066和UL45/46——均成功实现了基因插入。

讨论

家禽生产中的病毒疾病控制主要依靠疫苗接种。然而，一些灭活疫苗和减毒活疫苗需要多次接种才能诱导和维持保护性免疫，从而增加了劳动力和生产成本。此外，某些疫苗的保护效果可能会受到母源抗体的干扰（Abdelwhab等人，2012年；Pan等人，2022b年；Richard-Mazet等人，2014年）。基于rHVT的活疫苗

CRediT作者贡献声明

赵晔：软件、资源管理、项目统筹、数据分析。张国忠：撰写——审稿与编辑、验证、监督、软件管理、资源协调、项目统筹、数据分析、概念构思。王浩然：撰写——初稿撰写、数据可视化、验证、软件应用、方法设计、实验研究、数据分析、数据整理。杨慧明：方法设计、实验研究、数据分析、数据整理。赵静：软件应用、项目统筹、数据分析。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。