技术与生物学噪声源干扰多路增强子AAV筛选

《Nature Communications》：Technical and biological sources of noise confound multiplexed enhancer AAV screening

　　

摘要 顺式作用调控增强子（Enhancer）元件是实现在腺相关病毒（AAV）递送平台中细胞类型特异性遗传访问的有力工具。然而，在增强子发现中，一个显著瓶颈仍是其在体表达模式的准确表征，这目前依赖于费时费力的、金标准的一对一验证。在此，研究人员评估了多种条形编码的、多路策略，以加速在细胞类型分辨率下对增强子驱动表达的分析。作为概念验证，研究人员在多种细胞类型中测试了在小鼠大脑中具有已知活性、经过充分验证的增强子AAV小库。尽管经过了大量的优化和测试，研究人员仍遇到了显著的技术和生物噪声，包括嵌合AAV包装产物，这些噪声掩盖了真实的增强子表达模式。这些效应在较弱的增强子以及在丰度较低的细胞亚群中具有活性的增强子中尤为突出。这些发现凸显了多路增强子AAV筛选固有的挑战、精心设计增强子库的重要性以及增强子AAV在体生物学的复杂性。

研究背景与问题

增强子是顺式作用的DNA元件，通过与转录因子相互作用增加内源基因表达的概率。在体内，增强子驱动的基因表达具有高度的细胞类型和区域依赖性。基于单细胞测序技术和大规模基因组数据集训练机器学习算法，极大地促进了跨细胞类、亚类和类型的增强子鉴定与活性预测。这些推测的增强子序列可被移植到合成环境中，并与最小启动子一起包装成能够驱动细胞类型特异性基因表达的增强子AAV。这些努力已产生了一个包含数千个增强子AAV的工具箱，用于靶向整个大脑的多种细胞类型。然而，验证增强子AAV作为大脑中功能性工具的金标准方法是耗时费力的一对一测试。这种方法涉及将新型增强子序列与荧光报告基因配对、单独的AAV包装和体内注射，并独立检查每个增强子的靶向细胞类型特异性和表达模式。此筛选方法需要大量时间、精力和动物，使得在增强子AAV表现出非预期表达模式时难以进行重复或故障排除。平行化或多路化增强子AAV验证不仅可加速筛选过程，还可能为重新测试或优化具有意外表达的增强子提供途径。然而，目前缺乏对其在体内、在细胞类型分辨率下进行高效、准确多路评估的验证。

研究目的与意义

本研究旨在通过结合条形编码的增强子AAV载体和单细胞RNA测序，建立一种可扩展的工作流程，用于增强子驱动转录本的高效回收和准确细胞类型识别，从而增加筛选通量，加速增强子AAV的表征。该研究系统评估了多路增强子AAV筛选中的噪声源，揭示了其固有挑战，并对未来方法优化和实验设计提供了关键见解。相关成果已发表在《Nature Communications》期刊。

主要关键技术方法

研究人员设计并克隆了含有特定mRNA条形码（mBC）的核报告载体（SYFP2-H2B）。选取了18个先前已验证的、具有高靶向特异性的增强子，分别包装到能够穿过血脑屏障的AAV PHP.eB衣壳中。通过小鼠（C57BL/6J和SCID品系）体内注射（retro-orbital），在表达荧光报告蛋白的细胞中分离出前外侧运动皮层和纹状体脑区的全细胞。随后，利用10x Genomics 3’基因表达平台进行单细胞RNA测序，并构建了AAV特异性的扩增子文库以增强mBC检测。此外，还采用了双重条形码（mBC和oBC）策略进行错误校正。为研究生物噪声，使用了缺乏DNA-PKcs的SCID小鼠来减少AAV串联化，并测试了绝缘子元件对减少增强子串扰的效果。AAV载体嵌合现象通过牛津纳米孔技术长读长测序直接对病毒制剂进行分析。

研究结果

1. 用于小鼠大脑多路增强子AAV验证的管道设计

研究人员建立了一个多路测试策略，其中每只小鼠注射一个增强子AAV库。为了测试该策略，他们选择了18个先前已发表并验证的Allen研究所增强子，每个增强子与一个独特的8碱基对mRNA条形码配对，亚克隆到核报告载体中，并单独包装到PHP.eB衣壳中。免疫组织化学和单核RNA测序证实，驱动新核mBC构建体的增强子与原始已发表构建体的特异性高度匹配。所有增强子都对其预期细胞类型靶标保持了高特异性。

2. 核脑组织制备不足以在10x Genomics RNA测序中捕获增强子驱动的AAV mBC转录本

研究人员评估了全细胞和细胞核分离方法对AAV mBC转录本回收的影响。他们使用泛神经元启动子hSyn1驱动核SYFP2，在小鼠中进行了retro-orbital注射，并从前外侧运动皮层和纹状体生成全细胞和细胞核悬浮液。结果显示，与细胞核相比，全细胞中AAV mBC转录本的回收率显著更高。尽管生成了高质量的核文库，但SYFP2阳性细胞核中可检测到的转录本很少。通过半巢式PCR生成AAV特异性扩增子文库，可可靠地从全细胞cDNA中回收AAV转录本，但对核cDNA则需要更多扩增，并导致在SYFP2阳性和阴性核cDNA中非特异性检测到mBC转录本，这与核中hSyn1驱动的mBC转录本的脱靶扩增一致。研究人员尝试了多种策略以增强mBC AAV转录本的核保留，包括去除WPRE3元件、测试多种核保留motif，但均未能将AAV转录本检测提高到超过约50%的SYFP2阳性细胞核。因此，后续实验仅使用全细胞制备。

3. 大脑中的多路筛选需要单独的AAV包装

研究人员使用六个高度特异性的增强子/启动子AAV（四个增强子，两个对照启动子）设计了一个小型多路筛选。他们进行了两种独立的AAV包装程序：一种是生成六个单独的病毒制剂，另一种是生成包含所有六个增强子mBC质粒的单一混合制剂。长读长测序直接对AAV制剂的分析显示，混合包装的AAV制剂中，有约37%的读数包含不一致的增强子-mBC配对，而混合的单独制剂中只有2%。这表明在混合AAV包装过程中发生了广泛的增强子-mBC重组，是mBC增强子AAV筛选中噪声的主要来源。在体内实验中，混合包装文库的脱靶细胞中显示出显著升高的mBC UMI水平，尽管靶向UMI水平相当，表明混合AAV文库的背景噪声增加。

4. 双重条形码错误校正策略以最小化技术噪声

研究人员评估了单细胞定量表达报告子策略，该策略包含一个组成性表达的小环状RNA“tornado条形码”和增强子驱动的mBC。他们评估了两种文库设计：“Single scQers”，包含十八个单独包装的增强子AAV和两个阳性对照启动子AAV，每个包含一个独特的oBC-增强子-mBC对；“Multi scQers”，是一个中等复杂度的文库，包含相同的20个增强子AAV，但每个增强子与约181个mBC-oBC对组合。在体内应用后，保留mBC-oBC一致配对显著增加了Multi scQer文库中的增强子特异性，但在Single scQer文库中没有。然而，即使应用了基于双重条形码的错误校正，表观增强子特异性仍然显著低于通过单核RNA测序和免疫组织化学测量的单试剂验证结果。靶细胞类型丰度和SYFP2报告蛋白表达水平与多路筛选中的特异性损失呈负相关，表明驱动更强、更广泛可检测表达的增强子对多路相关噪声更具弹性。

5. AAV转录串扰是潜在的生物噪声源

研究人员通过共注射两种在不同细胞群中单独表达的增强子AAV，验证了AAV串联化导致的增强子串扰现象。在C57BL/6J小鼠中观察到广泛的共标记，但在缺乏DNA-PKcs的SCID小鼠中，共标记细胞显著减少，证实了DNA串联化依赖的增强子串扰会扭曲增强子AAV表达模式。在包含所有20个先前验证的、单独包装的增强子AAV的二十重多路筛选中，SCID小鼠并未导致所有增强子的表观特异性整体改善，而是呈现双峰效应。此外，研究人员测试了绝缘子元件以减少意外的增强子激活，发现包含5' hsA2绝缘子显著减少了纹状体中的串扰，但在前外侧运动皮层中没有。这些发现表明，绝缘子可以在情境依赖的方式下减少增强子串扰，突显了当前缓解多路增强子AAV筛选中生物噪声策略的潜力和局限性。

6. 生物和技术噪声强烈影响多路增强子筛选中观察到的表达

生物噪声，源自AAV包装过程中产生的嵌合体、体内增强子间的转录串扰，以及技术噪声，如环境RNA、PCR嵌合体或测序错误，共同掩盖了真实的增强子表达模式。这些噪声源在筛选的多个步骤中出现，包括混合包装期间的AAV嵌合、体内增强子的转录串扰、样品制备期间的环境RNA、文库生成期间的PCR嵌合，以及特定于多路库/设计的其他因素。

讨论与结论总结

研究人员通过结合条形编码的增强子AAV载体和单细胞RNA测序，旨在通过采用多路方法来增加筛选通量。然而，研究人员发现了多个注意事项，包括低AAV转录本捕获和高技术及生物噪声，这些阻碍了对所有增强子AAV的准确表征。这些结果证明了在设计增强子AAV多路筛选时需要考虑的重要注意事项。

低AAV转录本回收在细胞核制备中尤为明显，尽管进行了许多优化尝试，研究人员未能实质性地改善核保留。技术噪声，源自虚假的环境RNA、PCR嵌合体或测序错误，已被广泛记录在基于液滴的RNA测序中，并且很可能是低UMI/读数计数的原因。相比之下，生物噪声更难与真实的增强子活性区分开来，因为它反映了由增强子或AAV相互作用驱动的真实转录，这解释了为什么计算去噪方法在此情境下无效。这些生物噪声源在多路增强子筛选中掩盖了增强子表达，因为它们表现为真实信号。这也解释了为什么多路mBC UMI计数与来自单独注射的增强子驱动蛋白表达相关性不佳。

除了增强子转录串扰，研究人员还确定了在混合包装过程中发生的AAV嵌合现象是生物噪声的一个来源。观察到的交换率与Lalanne等人共同提交的论文中描述的该大小同源区域的预期率一致。这种嵌合现象很可能导致了许多已发表的多路AAV筛选文献中的高背景噪声。由于这个原因，研究人员建议不要使用混合AAV包装，这进一步限制了多路增强子筛选的使用。如果必须进行混合包装，条码交换缓解策略包括错误校正scQer双重条码、最小化载体同源性以及稀疏转染包装（以滴度为代价）。

尽管有这些限制，增强子AAV多路筛选对于明确定义的筛选应用可能仍然有用，因为最小化噪声需要仔细考虑增强子库组成、大小和增强子强度。例如，相对较小的库可用于对靶向相似细胞类型的增强子进行排名，或比较密切相关的增强子优化设计，以确定预定义群体的最强候选者。此外，多路筛选后进行单试剂验证可以在一对一测试不切实际的场景中提供成本节约，例如全器官灵长类动物研究。然而，将这种方法扩展到无偏的新增强子发现将需要实质性进展，以减轻技术和生物噪声源。