利用计算机辅助工程技术改造反式茴香脑氧化酶，以提升从异丁香酚催化合成香兰素的效率 侯福康、 吴丹、 陈鹏成、 郑普

《Catalysts》：Computer-Aided Engineering of Trans-Anethole Oxygenase for Enhanced Catalytic Synthesis of Vanillin from Isoeugenol Fukang Hou, Dan Wu, Pengcheng Chen and Pu Zheng

　　摘要：反式茴香脑氧化酶（TAO）具有广泛的芳基丙烯底物特异性，但在将异丁子香酚转化为高价值香兰素的转化过程中活性较低。在本研究中，我们利用计算机辅助理性设计对来自假单胞菌（Pseudomonas putida）的TAO进行了改造，以提高其对异丁子香酚的催化效率。结构建模和AlphaFold 3对接分析确定了两个关键的催化残基：Arg86和His118。通过底物通道工程和计算引导的突变，构建了一系列目标变体。三个变体H93A、Q207R/G249C和I59T/F62T在全细胞水平上的活性分别提高了1.8倍、2.13倍和4.83倍。纯化酶的动力学实验结果也证实了这些发现，其kcat/Km值分别达到了野生型的1.6倍、2.1倍和4.7倍。分子动力学模拟表明，H93A通过扩大底物通道提高了活性，而Q207R/G249C则通过其他方式产生了有益的效果。值得注意的是，I59T/F62T变体通过优化结合口袋内的疏水相互作用显著增强了底物亲和力。这些结果验证了计算建模在酶重组中的有效性，并为香兰素的可持续生物合成提供了一种可靠的生物催化剂。

1. 引言
香兰素是一种芳香醛，广泛应用于食品、制药和化学工业中，具有巨大的全球市场需求。从异丁子香酚合成香兰素的化学方法已经非常成熟[1,2,3,4,5,6,7]，通常涉及在催化剂（如甲基三氧铼（CH3ReO3）或钴/镍盐）存在下使用氧气或过氧化氢进行氧化[8]。然而，这种方法存在三个主要缺点：选择性控制差、环境污染严重以及反应条件苛刻。这些限制推动了向更环保的生物合成方法的发展[9,10,11,12,13,14,15,16]。尽管这些生物合成方法具有潜力，但其工业应用仍面临关键瓶颈，包括天然酶的催化效率低以及香兰素对宿主细胞的毒性。因此，通过理性工程提高酶的催化效率仍然是克服这些工业障碍的核心科学挑战[17]。
已经发现了一些对异丁子香酚具有活性的氧化酶。例如，从大豆中提取的含铁双加氧酶被用于生物催化异丁子香酚生成香兰素[12]。最初报道的抗坏血酸裂解双加氧酶NOV1对异丁子香酚的氧化效率较低[18]；然而，通过理性引导的工程改造（如S283F变体）显著提高了其催化转化率和动力学稳定性[19]。此外，基于NOV1的优化全细胞系统最近在工业相关条件下表现出从木质素衍生的异丁子香酚生产香兰素的高效率[20]。另一方面，从假单胞菌IE27中分离出的异丁子香酚单加氧酶（PpIEM）已被纯化、克隆并在大肠杆菌BL21（DE3）中过表达，另一种IEM（PnIEM）也从假单胞菌Nitroreducens中鉴定出来，这两种酶都能催化异丁子香酚氧化为香兰素[21,22]。反式茴香脑氧化酶（PpTAO）最初由Han及其同事从假单胞菌JYR-1中发现，是一种新型黄素单加氧酶[23]。这种酶使该菌株能够以反式茴香脑为主要碳源进行生长，并且对异丁子香酚、O-甲基异丁子香酚和异莎弗醇也具有催化活性。早期使用重组TAO的表征表明，Trp38、Thr43和Tyr55残基对于黄素还原至关重要，这是基于黄素依赖性机制的假设[24]。然而，对来自Stenotrophomonas maltophilia的反式茴香脑氧化酶（TAOSm）晶体结构的解析显示，它属于一类新的含血红素氧化酶[25]。研究团队截断了无序的末端区域并引入了SUMO溶解标签，成功实现了TAOSm的可溶性表达，其晶体结构显示TAO含有紧密结合的血红素b，并且仅利用分子氧（O2）进行催化。这一发现推翻了之前关于黄素和烟酰胺依赖性的假设，重新定义了TAO为一种独特的含血红素氧化酶。
除了探索TAO的催化机制外，还通过易错PCR构建了TAO突变库来提高其对异莎弗醇的催化效率[26]。鉴定出四个活性显著提高的变体，其转化率比野生型菌株提高了1.45倍。具体来说，变体4C7对p-茴香醛和香豆醛的转化率分别提高了2.05倍和2.38倍。另一个变体5F4也显示出广泛的改进，对p-茴香醛、香豆醛、哌酮醛和香兰素的转化率分别提高了1.91倍、2.08倍、1.33倍和1.92倍。Qi Ye等人采用多平台计算设计策略（PROSS、FireProt、Rosetta和FoldX）对突变体进行了改造，以提高TAO在香兰素生物合成中的活性，结果显示突变体F34Y在异丁子香酚浓度为10 mM时产率达到了88.7%，而G117I和T138L变体的产率提高了40%以上[27]。这些进展突显了计算引导策略在酶工程中的整合作用，有助于识别关键功能残基并缩小实验验证的候选范围。

2. 结果与讨论
2.1. 血红素辅因子的结构建模与验证
鉴于最近报道的Stenotrophomonas maltophilia的TAOSm晶体结构（PDB条目：8S1J）表明它是一种依赖血红素的氧化酶，使用血红素b作为其必需辅因子[25]，我们推测来自假单胞菌JYR-1的PpTAO（与TAOSm同源物具有62.7%的序列一致性）也可能属于依赖血红素的氧化酶。与其他四种已表征的氧化酶（TAOPs，NCBI GenBank条目：BCZ08069.1；TAOSm，RCSB PDB条目：8S1J；mpaB，UniProt条目：W6R4H8.1；LCP，RCSB PDB条目：5O1L）的多序列比对进一步显示了这些物种间高度保守的催化基序（图1A），表明它们具有共同的芳基烯烃氧化进化机制。因此，为了便于理性工程，我们使用AlphaFold 3预测了假单胞菌TAO的三维结构。我们将新模型与Stenotrophomonas maltophilia的晶体结构（PDB 8S1J）进行结构叠加，发现两者在核心催化域具有显著的架构保守性（图1B）。除了N端和C端的无序区域外，两种结构在核心催化域几乎完全相同（图1B）。总体架构高度保守，血红素结合口袋的几何形状和体积几乎相同。两种结构都包含一个保守的近端配体His（His121和His118）和一个远端轴向残基Arg（Arg89和Arg86）。此外，模型之间的均方根偏差（RMSD）表明血红素结合环境和底物通道高度保守（图1B）。

2.2. 异丁子香酚在PpTAO活性位点的结合模式
为了确定异丁子香酚在PpTAO活性位点的结合构象，我们使用AutoDock Vina进行了进一步的异丁子香酚分子对接。图3A展示了血红素结合口袋的代表性视图，说明了异丁子香酚相对于辅基的对接位置。异丁子香酚位于远端血红素结合口袋内，靠近远端轴向残基Arg86（图3B）。围绕血红素的催化腔由一系列残基组成，包括Phe94、Thr90、Val114、Phe176、Gly117、Phe139、Leu121、Phe62、Met72、Ile59、Lys78和Thr56（图3C）。这些残基构成了血红素结合口袋的结构框架，在同源氧化酶中高度保守，强调了它们的功能重要性。对接姿态的详细分析揭示了一个复杂的氢键网络，稳定了底物（图3D）。异丁子香酚与远端精氨酸形成直接氢键，距离为2.8 ?。此外，底物还通过四个氢键与血红素辅基结合，键长分别为3.0 ?、2.8 ?、3.4 ?和3.3 ?。底物通过氢键和范德华力的组合得到稳定，主要与催化残基Arg86和血红素辅因子相互作用。这种紧密的相互作用网络使异丁子香酚的丙烯侧链处于后续氧化反应的最佳位置。

2.3. 基于结构的PpTAO底物通道工程
在模拟PpTAO结构后，我们研究了结构修饰以扩大底物结合口袋和通道。结构分析显示，血红素辅基占据了结合腔的较大部分，留给底物的空间有限。在His118相邻的一侧，我们发现了一个狭窄的入口点，推测这是底物到达催化中心的关键途径（图4A）。根据诱导契合机制，我们假设PpTAO蛋白骨架在初次接触底物时，尤其是通道两侧的残基会发生构象重排。这种结构灵活性有助于异丁子香酚进入核心催化区域。通过使用CAVER，我们识别出一个狭窄的通道（通道1），该通道由Pro65、Ala67、Gly127、Thr128、Arg132和Asp133这些残基组成（图4B）。这个通道的瓶颈半径似乎是限制底物扩散的因素。因此，我们针对这些残基以及位于血红素口袋前部的非保守残基His93进行了“空间扩展”突变（图4B,C）。作为初步的保守策略，我们采用了丙氨酸扫描来最小化空间阻碍。用丙氨酸的甲基替换大体积侧链可以在保持最小疏水骨架的同时去除空间阻碍，从而精确扩大通道体积而不破坏局部结构。对单点突变体的实验验证显示，H93A的催化效率提高了1.8倍。其他变体，包括I141A和T128A，分别提高了30%和50%（图4E）。接下来，我们尝试大幅拓宽整个通道入口。构建了两个多点突变体，其中瓶颈残基被丙氨酸或甘氨酸替换（图S1A,B），即T1（P65A/T128A/P130A/R132A/D133A）和T2（P65G/T128G/P130G/R132G/D131G），但这种“全局拓宽”策略并不成功。T1变体的活性与野生型（WT）相当，而T2变体的活性显著下降。此外，有益单点的组合突变（H93A/T128A、H93A/I141A、T128A/I141A以及三重突变H93A/I141A/T128A）并没有产生协同效应（图4E），这表明His93周围的局部微环境是观察到的活性增强的主要决定因素。

这种结构灵活性有助于异丁子香酚进入核心催化区域。通过使用CAVER，我们发现了一个由Pro65、Ala67、Gly127、Thr128、Arg132和Asp133残基组成的狭窄通道（通道1）（图4B）。该通道的瓶颈半径似乎是底物扩散的限制因素。因此，我们对这些残基以及位于血红素口袋前部的非保守残基His93进行了“空间扩展”突变（图4B,C）。作为初步的保守策略，我们采用了丙氨酸扫描来减少空间阻碍。用丙氨酸的甲基替换大体积侧链可以在保持最小疏水骨架的同时去除空间阻碍，从而精确扩大通道体积而不破坏局部结构。实验验证显示，H93A的催化效率提高了1.8倍。其他变体，包括I141A和T128A，分别提高了30%和50%（图4E）。接下来，我们尝试大幅拓宽整个通道入口。然而，这种“全局拓宽”策略并不成功。T1变体的活性与野生型相当，而T2变体的活性显著下降。此外，有益单点的组合突变并没有产生协同效应，这表明His93周围的局部微环境是活性增强的主要决定因素。

基于亲和力的合理设计以增强底物结合
为了进一步提高催化效率，我们使用了Schr?dinger的FEP+（自由能扰动）方法来预测有益的突变。同时，使用Discovery Studio中的虚拟氨基酸突变模块评估了替换对结合自由能（ΔΔGbind）和蛋白质热稳定性（ΔΔGstability）的影响。通过跨平台筛选，我们对构成血红素结合口袋和底物腔的所有残基进行了详尽的计算机模拟丙氨酸扫描。采用严格的阈值ΔAffinity < ?3 kcal/mol，我们确定了四个高频目标残基：Val54、Thr56、Thr63和His113。随后，使用Schr?dinger的残基扫描计算模块对这些位置进行了计算机模拟饱和突变（图S2）。如图5A所示，我们根据两个标准优先选择变体：ΔAffinity < ?25 kcal/mol以确保强底物结合，以及ΔStability < ?10 kcal/mol以保持结构完整性。这种双参数筛选产生了七个有希望的候选者。然而，随后的全细胞生物催化实验验证显示，这些变体与野生型或H93A突变体相比没有显著提高活性（图5B）。这种差异表明，虽然这些突变可能增强结合或稳定性，但它们可能会同时影响催化几何结构或血红素-铁中间体的活化。

基于分子力学的Poisson Boltzmann表面面积（MM-PBSA）计算指导的TAO变体合理设计
为了更深入地了解底物识别的能量基础，我们基于PpTAO的分子动力学轨迹进行了MM-PBSA（分子力学–Poisson Boltzmann表面面积）计算。该方法结合了分子力学（MM）和Poisson–Boltzmann（PB）方程来考虑溶剂化效应。如图6A,B所示，总结合自由能被分解为各个残基级别的贡献，以识别稳定异丁子香酚的关键残基（图6A）。能量分解显示，催化残基Arg86主要通过强静电相互作用稳定底物。同时，一组疏水和极性残基，包括Phe62、Met72、Val114、Val134、Thr138、Phe176和Ile141，提供了显著的范德华相互作用。这些残基创建了一个有利于底物脱溶和在催化口袋内定向的疏水微环境（图6B）。

基于分子动力学的MD模拟和MM-PBSA分析，我们对所有变体进行了全面研究。MM-PBSA分析显示，H93A的替换主要增加了非极性溶剂化能量，而范德华力、静电能量和极性溶剂化能量基本保持不变。相比之下，Q207R/G249C变体的总结合自由能变化不大。Q207R/G249C催化效率的提高可能归因于远端效应，即远离活性位的突变引起了微妙的构象变化。这些变化通过蛋白质的二级结构传播，调节活性位的几何结构、静电环境或动态特性，从而有利于催化。SASA分析表明，与野生型相比，Arg86–底物距离分布显著缩小，采用了一个以约2.8–3.0 ?为中心的单峰分布（图S6）。这种关键催化接触的稳定与溶剂暴露减少一致，并支持了所提出的构象传播机制。

为了进一步优化H93位点，我们在H93位置进行了饱和突变（图S1C）。然而，没有变体的性能超过H93A，这表明H93A为异丁子香酚转化提供了近乎最优的空间和稳定性平衡。

2.4 基于亲和力的合理设计以增强底物结合
为了进一步提高催化效率，我们使用了Schr?dinger的FEP+（自由能扰动）方法来预测有益的突变。同时，使用Discovery Studio中的虚拟氨基酸突变模块评估了替换对结合自由能（ΔΔGbind）和蛋白质热稳定性（ΔΔGstability）的影响。通过整合跨平台筛选，我们对构成血红素结合口袋和底物腔的所有残基进行了详尽的计算机模拟丙氨酸扫描。采用严格的阈值ΔAffinity < ?3 kcal/mol，我们确定了四个高频目标残基：Val54、Thr56、Thr63和His113。随后，使用Schr?dinger的残基扫描计算模块对这些位置进行了计算机模拟饱和突变（图S2）。如图5A所示，我们根据两个标准优先选择变体：ΔAffinity < ?25 kcal/mol以确保强底物结合，以及ΔStability < ?10 kcal/mol以保持结构完整性。这种双参数筛选产生了七个有希望的候选者。然而，随后的全细胞生物催化实验验证显示，这些变体与野生型或H93A突变体相比没有显著提高活性（图5B）。这种差异表明，虽然这些突变可能增强结合或稳定性，但它们可能会同时影响催化几何结构或血红素-铁中间体的活化。

2.5 TAO变体的MM-PBSA计算指导的合理设计
为了更深入地了解底物识别的能量基础，我们基于PpTAO的分子动力学轨迹进行了MM-PBSA（分子力学–Poisson Boltzmann表面面积）计算。该方法结合了分子力学（MM）和Poisson–Boltzmann（PB）方程来考虑溶剂化效应。如图6A,B所示，总结合自由能被分解为各个残基级别的贡献，以识别稳定异丁子香酚的关键残基（图6A）。能量分解显示，催化残基Arg86主要通过强静电相互作用稳定底物。同时，一组疏水和极性残基，包括Phe62、Met72、Val114、Val134、Thr138、Phe176和Ile141，提供了显著的范德华相互作用。这些残基创建了一个有利于底物脱溶和在催化口袋内定向的疏水微环境（图6B）。

2.6 TAO变体的分子动力学分析和动力学表征
我们对所有变体进行了全面的MD模拟（图7A,B）和MM-PBSA计算（图S2）。MM-PBSA分析显示，H93A的替换主要增加了非极性溶剂化能量，而范德华力、静电能量和极性溶剂化能量基本保持不变。相比之下，Q207R/G249C变体的总结合自由能变化不大。Q207R/G249C催化效率的提高可能归因于远端效应，即远离活性位的突变引起了微妙的构象变化。这些变化通过蛋白质的二级结构传播，调节活性位的几何结构、静电环境或动态特性，从而有利于催化。SASA分析表明，与野生型相比，Arg86–底物距离分布显著缩小，采用了一个以约2.8–3.0 ?为中心的单峰分布（图S6）。这种关键催化接触的稳定与溶剂暴露减少一致，并支持了所提出的构象传播机制。

2.7 TAO变体的MM-PBSA计算指导的合理设计
为了更深入地了解底物识别的能量基础，我们基于PpTAO的分子动力学轨迹进行了MM-PBSA（分子力学–Poisson Boltzmann表面面积）计算。该方法结合了分子力学（MM）和Poisson–Boltzmann（PB）方程来考虑溶剂化效应。如图6A,B所示，总结合自由能被分解为各个残基级别的贡献，以识别稳定异丁子香酚的关键残基（图6A）。能量分解显示，催化残基Arg86主要通过强静电相互作用稳定底物。同时，一组疏水和极性残基，包括Phe62、Met72、Val114、Val134、Thr138、Phe176和Ile141，提供了显著的范德华相互作用。这些残基创建了一个有利于底物脱溶和在催化口袋内定向的疏水微环境（图6B）。

2.8 TAO变体的分子动力学分析和动力学表征
我们对所有变体进行了全面的MD模拟（图7A,B）和MM-PBSA计算（图S2）。MM-PBSA分析显示，H93A的替换主要增加了非极性溶剂化能量，而范德华力、静电能量和极性溶剂化能量基本保持不变。相比之下，Q207R/G249C变体的总结合自由能变化不大。Q207R/G249C催化效率的提高可能归因于远端效应，即远离活性位的突变引起了微妙的构象变化。这些变化通过蛋白质的二级结构传播，调节活性位的几何结构、静电环境或动态特性，从而有利于催化。SASA分析表明，与野生型相比，Arg86–底物距离分布显著缩小。这种关键催化接触的稳定与溶剂暴露减少一致，并支持了所提出的构象传播机制。

2.9 TAO变体的稳态动力学参数
对于H93A、Q207R/G249C和I59T/F62T变体，我们确定了稳态动力学参数（图7E），并绘制了野生型及其变体的酶动力学曲线（图S4）。最初，重组TAO的纯化是一个重大挑战。我们假设N端和C端的高度无序、非催化序列阻碍了His标签的可达性。这些无序区域可能通过瞬时的分子内相互作用产生空间阻碍或“屏蔽”效应，有效地埋藏了His标签，阻止其与Ni-NTA树脂的结合。通过截断这些无结构的末端片段，我们成功获得了高纯度的蛋白质，便于后续的生化表征。野生型TAO表现出相对较高的Km（0.110 ± 0.09 mM）和较低的周转频率（kcat = 0.11 ± 0.02 s?1），导致基础催化效率为0.1 s?1 mM?1。H93A变体主要影响了底物亲和力；其Km降低到0.073 ± 0.05 mM，导致效率提高了1.6倍（0.16 s?1 mM?1）。这表明拓宽通道入口有助于底物进入，而不显著改变催化循环的限速步骤。远端突变体Q207R/G249C在结合亲和力和催化效率方面都表现出提升，其kcat值为0.16 s?1，Km值为0.075 mM。催化效率提高了2.1倍（达到0.21 s?1 mM?1），这支持了远端构象变化能够有效微调活性位点环境的假设。其中，I59T/F62T突变体的改进最为显著，该突变体通过增强疏水相互作用实现了协同优化：kcat值翻倍至0.22 s?1，Km值显著降低至0.046 ± 0.04 mM（相比野生型降低了58%）。因此，整体催化效率提高了4.7倍。这些动力学数据与我们的MM-PBSA和SASA计算结果高度一致，证实了加强结合口袋内的疏水驱动力是提高TAO活性的最有效策略。在全细胞生物催化实验中，工程突变体的表现明显优于野生型：野生型TAO的转化率仅为6.36%。经过优化的H93A突变体将转化率提升至11%，而远端突变体Q207R/G249C的转化率达到了13.89%。特别值得注意的是，经过结合亲和力优化的I59T/F62T突变体的转化率达到了55.3%。这些结果验证了我们多层次理性设计方法的有效性，其中结合口袋残基的优化对整体催化效率的提升贡献最大。

**材料与方法**
3.1. 实验部分
3.1.1. 材料与菌株
蛋白质表达和全细胞生物催化实验使用大肠杆菌BL21(DE3)进行。pETDuet-1载体用于基因克隆和异源表达。本研究中使用的所有化学试剂均为分析级或色谱级。
3.1.2. 重组表达载体与菌株的构建
本研究中构建的质粒和菌株详见表S2。TAO的参考氨基酸序列来源于NCBI数据库（访问编号：HQ889281.1）。TAO基因和pETDuet-1载体通过设计特定的引物扩增，以引入18 bp的同源臂。重组表达载体pETDuet-1-TAO通过同源重组构建。随后使用基于PCR的策略进行了定点突变。引物由Azenta（中国苏州）合成。
3.1.3. PCR和分子克隆实验
PCR反应混合物（50 μL）包含1 μL模板DNA（质粒或TAO基因）、1 μL正向引物和反向引物（10 μM）、25 μL 2× PrimeSTAR Max DNA聚合酶（购自中国北京Takara）以及无核酸酶的水。热循环条件如下：初始变性94°C 5分钟；随后进行30个循环：94°C 20秒（变性）、55°C 20秒（退火）和72°C 1分钟（延伸）；最后在72°C下延伸10分钟。为了去除母本模板，向PCR产物中加入1 μL DpnI（购自中国北京Takara）限制性内切酶，并在37°C下孵育1小时。扩增片段通过1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化。同源重组反应（10 μL）包含3 μL线性化载体、1 μL基因插入片段、5 μL 2 × CE Mix V3（购自中国南京Vazyme）以及蒸馏水。重组质粒通过转化引入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以生成突变表达菌株。本研究中使用的所有引物和菌株详见表S2和S3。
3.1.4. 全细胞生物催化
含有pETDuet-1-TAO的大肠杆菌BL21(DE3)单克隆菌落接种到添加了氨苄西林（Amp）的LB培养基中，37°C下220 rpm培养过夜。种子培养物以1%（v/v）的比例接种到含有Amp的100 mL LB培养基中。发酵过程在37°C下进行，直到OD600达到0.6–0.8。通过添加IPTG（最终浓度0.4 mM）诱导蛋白质表达，然后在25°C下220 rpm孵育10小时。细胞通过8000 rpm离心10分钟后收集上清液并丢弃。湿细胞沉淀物重新悬浮在PBS缓冲液（pH 7.4）中，调整至细胞密度为16.6%（w/v）。异丁子香酚以1:1（v/v）的比例溶解在二甲基亚砜（DMSO）中制备成储备溶液。底物缓慢加入细胞悬浮液中，最终使异丁子香酚浓度达到3.05 mM，DMSO占反应体积的0.6%。生物转化在30°C和220 rpm下进行5小时。反应结束后，混合物在12,000 rpm下离心5分钟，收集上清液进行进一步分析。氨苄西林购自中国上海Sangon Biotech；异丁子香酚购自中国上海Adamas（Titan Scientific）；DMSO购自中国上海Sinopharm。
3.1.5. 蛋白质纯化
蛋白质纯化使用1 mL HisTrap HP亲和柱（购自美国伊利诺伊州芝加哥GE Healthcare）进行。含有可溶性蛋白质的上清液通过0.22 μm无机膜过滤后置于冰上。加载前，用10倍柱体积（CVs）的结合缓冲液（20 mmol·L?1磷酸盐、20 mmol·L?1咪唑、500 mmol·L?1 NaCl，pH 7.4）平衡柱子。随后将10 mL粗酶提取物以0.5 mL·min?1的流速加载到柱子上。为了去除未结合的杂质蛋白，用10倍柱体积的结合缓冲液以1 mL·min?1的流速冲洗柱子。目标蛋白通过梯度洗脱缓冲液（20 mmol·L?1磷酸盐、500 mmol·L?1咪唑、500 mmol·L?1 NaCl，pH 7.4）洗脱20次，根据UV吸收峰收集组分。最后用10倍柱体积的结合缓冲液重新平衡柱子以备后续使用（图S5）。
3.1.6. 酶动力学分析
动力学参数测定时，酶浓度为20 μM，异丁子香酚浓度范围为0.1至20 mM（溶解在DMSO中）。反应在500 μL Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中进行，温度为30°C。芳香醛的形成通过微孔板读数仪（The Epoch2?，BioTek，美国Vinooski，VT）在340 nm波长下监测。动力学数据使用Origin 2026（v10.3）软件拟合Michaelis–Menten方程。
3.1.7. HPLC分析
异丁子香酚和香草醛的浓度通过高效液相色谱（HPLC）测定，使用Se-Fen Amethyst C18-H柱（购自中国苏州Sepax Technologies）。流动相由65%（v/v）甲醇（含0.01%冰醋酸，购自中国上海Sinopharm）组成。色谱条件如下：柱温30°C，流速1 mL/min，紫外检测波长270 nm，进样体积10 μL。样品用甲醇稀释以沉淀蛋白质并确保底物和产物的完全溶解。离心5分钟后通过注射滤膜过滤样品。

**计算部分**
3.2.1. 结构建模与质量评估
TAO的氨基酸序列来源于NCBI数据库（访问编号：HQ889281.1）。通过序列比对识别具有同源催化结构域的结构模板。使用AlphaFold 3 [28]预测TAO的三维结构，包括血红素辅基。模型质量通过Predicted Local Distance Difference Test (pLDDT)和Predicted Aligned Error (PAE)严格评估。pLDDT得分低于50的区域被视为无结构的。PAE值用于评估残基间的相对位置信心，从而了解域间稳定性。
3.2.2. 分子对接
分子对接使用AutoDock Vina 1.5.7进行。AlphaFold 3生成的TAO模型和配体结构使用AutoDock Tools [29]预处理，包括去除水分子和添加极性氢原子。搜索空间（网格盒）以血红素结合口袋为中心，坐标为x = ?6.192, y = 0.383, z = 8.479。立方体盒边长设为24.1 ?（网格间距1 ?）。每次模拟生成50个构象，对接过程重复三次。根据几何方向、空间契合度和最低结合亲和力（kcal/mol）选择最佳结合构象。
3.2.3. 分子动力学（MD）模拟
MD模拟使用GROMACS 2023软件包 [30] 进行，基于对接得到的蛋白-配体复合物。为处理血红素b辅基的电子复杂性，我们采用了活性位点的键合模型。血红素铁被模拟为其催化活性状态Compound I（Cpd I），其特征为氧合铁(IV)物种（Fe4+=O）和卟啉π-阳离子自由基 [31,32]。该中间体被指定为基态双峰自旋状态。Cpd I基团和轴向半胱氨酸残基的原子部分电荷通过基于密度泛函理论（DFT）计算的Restricted Electrostatic Potential (RESP)程序获得 [31,32]。Cpd I基团和轴向半胱氨酸残基的坐标球以及Fe=O双键和Fe-N、Fe-S键的力常数通过MCPB.py工作流中的Seminario方法明确定义 [31]。这些参数被整合到Amber99SB力场中，以确保分子动力学（MD）模拟和MM-PBSA计算期间的结构和电子稳定性。所有参数使用acpype工具 [33] 转换为GROMACS格式。拓扑文件使用GAFF [34,35] 力场生成（配体）和AMBER99SB [36] 力场（蛋白质）。系统在周期性边界盒中用SPC水模型溶剂化，并用Na+和Cl?离子中和。能量最小化采用最速下降（SD）方法和共轭梯度（CG）方法各进行10,000步。随后系统进行NVT（正则）和NPT（等温-等压）平衡。生产运行在100 ns轨迹上分析，结合自由能计算使用MM-PBSA方法，基于最后30 ns（70–100 ns间隔）的快照。可视化使用DuIvyTools（版本v0.6.0） [37]。
3.2.4. 理性突变设计与筛选
预测性突变和亲和力筛选使用两个互补平台进行：Discovery Studio [38] 的“Prepare Protein”和“Simulation”工具将CHARMM力场应用于复合物。使用“Design Protein”模块模拟目标氨基酸替换。Schr?dinger Maestro 13.5 [39]：通过“Protein Preparation Wizard”完善结构后，使用Residue Scanning模块计算突变后的结合亲和力变化（ΔΔGbind），指导高优先级突变体的实验验证。

**结论**
在本研究中，我们使用AlphaFold 3预测PpTAO的结构，并将其与TAOSm的晶体结构（PDB ID：8S1J）进行比较，推测存在一个血红素结合口袋。实验结果（包括特征性Soret带吸收、吡啶抑制作用以及关键催化残基突变后活性完全丧失）初步证实该酶是一种依赖血红素的氧化酶。通过理性工程，我们成功提升了PpTAO对异丁子香酚的催化性能：H93A、Q207R/G249C和I59T/F62T三个突变体的活性分别提高了1.8倍、2.13倍和4.83倍。分子动力学模拟显示，H93A突变通过拓宽通道路径并提供必要的空间支持来维持隧道的几何完整性，进一步优化了催化环境。Q207R/G249C突变体的活性提升归因于远端结构的稳定化，这引发了酶结构的整体紧凑化，减少了结合过程中的熵 penalty。位于结合口袋的I59T/F62T突变体的催化效率提高了4.7倍（kcat/Km）。MM-PBSA计算显示，59位和62位的苏氨酸替换共同贡献了?6.71 kcal/mol的结合自由能，相比野生型F62残基（?2.37 kcal/mol）提高了2.8倍。这种能量提升是由于范德华相互作用（ΔEVDW）增加了1.6倍和非极性溶剂化自由能（ΔGSA）增加了6.2倍。这些改进共同反映了底物非极性部分的脱溶剂过程更加高效，以及与血红素相邻的疏水区域之间的范德华相互作用得到了加强。总之，基于计算建模的上述酶重设计策略从多个角度促进了TAO的改良：提高了产率并增强了酶活性，为香兰素的可持续生物合成提供了强大的生物催化剂。

补充材料：
以下支持信息可在此下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/catal16050374/s1
- 表S1：Discovery Studio中的突变能量、薛定谔亲和力及稳定性分析；
- 表S2：本研究使用的菌株和质粒；
- 表S3：用于制备TAO突变体的引物；
- 表S4：野生型（WT）与H93A之间底物通道特性的定量比较；
- 图S1：(A) T1突变体中通道口扩大的示意图；(B) T2突变体中通道口扩大的示意图；(C) H93中单点饱和突变的整体细胞催化结果；
- 图S2：TAO及其突变体中氨基酸残基的能量分解；
- 图S3：野生型与突变体的溶剂可及表面积曲线；
- 图S4：野生型与突变体的动力学分析；
- 图S5：野生型与突变体蛋白的SDS-PAGE图（预测质量为36 kDa，经过13个N端和18个C端残基的截断）。
- 条带1–4：分别为WT、H93A、Q207R/G249C和I59T/F62T的上清液；
- 条带5–8：分别为WT、H93A、Q207R/G249C和I59T/F62T的纯化酶；
- 图S6：(A) I59T/F62T–异丁子香酚复合物的分子动力学（MD）快照；(B) Q207R/G249C–异丁子香酚复合物的MD快照；(C) WT与Q207R/G249C中Arg86–底物距离的分布。