基于传感器智慧农业技术的硬直黑麦草（Lolium rigidum）除草剂抗性早期演化检测及其在可持续杂草管理中的应用

《Agronomy》：Early Detection of Herbicide Resistance Evolution in Rigid Ryegrass (Lolium rigidum) Using Sensor-Based Smart Farming for Sustainable Weed Management Aikaterini Kasimati, Ioannis Gazoulis, Dimitra Petraki, Panagiotis Kanatas, Metaxia Kokkini, Aggeliki Petraki, Kyriaki Maria Papapostolou, John Vontas and Ilias Travlos

针对硬直黑麦草对ACCase、ALS及EPSPS抑制剂的抗性问题，研究者结合NDVI传感器筛查与剂量响应实验、TaqMan qPCR技术，证实传感器可实现抗性早期快速检测，并发现非靶标位点抗性（NTSR）机制，为田间精准除草提供了新策略。

　　

在广袤的农田里，有一种令全球农户和农学家都头疼不已的“超级杂草”——硬直黑麦草（Lolium rigidum）。作为地中海气候区的原生禾本科杂草，它凭借极高的种子活力、庞大的种子产量、高效的花粉传播能力以及巨大的遗传和表型变异性，成为了谷类作物、果园和葡萄园中最具破坏力的有害生物之一。在高密度下，它甚至能导致大麦减产高达85%，小麦减产超过30%。

长期以来，为了遏制这种杂草的蔓延，农业生产高度依赖芽前（PRE）和芽后（POST）除草剂，特别是针对5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）、乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）和乙酰乳酸合酶（ALS）的抑制剂。然而，这种长期的过度依赖和强烈的筛选压力，使得硬直黑麦草在全球范围内演化出了对13种不同除草剂作用位点的抗性，成为最容易发生除草剂抗性的杂草物种之一。更棘手的是，作为二倍体植物，它能通过杂交产生携带多种抗性等位基因的个体，使得除草剂抗性管理难上加难。

传统的除草剂抗性检测方法，如温室全株生物测定、生化分析和特定的分子技术，虽然结果可靠，但往往耗时费力，需要数周才能得出结论，且难以适应田间大规模种群的快速筛查。在需要快速决策的农业生产现场，农民往往等不及漫长的诊断结果。因此，开发一种快速、无损、能在生长季内早期识别潜在抗性杂草生物型的技术，成为了可持续杂草管理追在眉睫的需求。

为此，来自希腊的研究人员（Aikaterini Kasimati, Ioannis Gazoulis, Dimitra Petraki等）开展了一项结合智慧农业传感器技术与经典植物科学实验的研究，旨在利用传感器技术进行初步筛查，随后通过剂量响应实验和分子检测来验证硬直黑麦草对草甘膦（glyphosate）、炔草酯（clodinafop-propargyl）以及甲基二磺隆+碘甲磺隆（mesosulfuron-methyl + iodosulfuron-methyl）的抗性演化情况，并探究其背后的遗传机制。该论文发表在《Agronomy》期刊上。

为了开展此项研究，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先，在希腊多个产区的果园和葡萄园（如Etoloakarnania、Viotia等地）基于农民反馈选取了20个田间地块，使用Trimble GreenSeeker手持传感器测量归一化植被指数（NDVI）进行田间初步筛查；其次，采集疑似抗性区域的种子，在雅典农业大学实验场进行盆栽试验，包括单次最大推荐剂量下的初步筛查和设置0、1/4X、X、2X、4X的五梯度剂量响应实验，以计算导致50%生物量削减的除草剂剂量（GR₅₀）和抗性指数（RI）；第三，使用CTAB法提取杂草基因组DNA，并设计并优化了8种TaqMan qPCR检测探针，用于筛查EPSPS、ACCase和ALS基因上的已知靶标位点突变（如P106S/T/A、I1781L、P197G/S等）。

3.1. 硬直黑麦草抗性的初步筛查

通过传感器NDVI值筛查及随后的单剂量试验，研究人员发现不同 accession（EM1、EM2、EM3）对除草剂的响应存在显著差异。结果表明，EM3对炔草酯具有抗性，EM1和EM3对草甘膦具有抗性，而EM2对甲基二磺隆+碘甲磺隆具有抗性。其中，EM3似乎表现出对炔草酯和草甘膦的多重抗性。初步筛查证实了希腊存在对这三类除草剂具有不同抗性模式的硬直黑麦草。

3.2. 剂量响应实验

3.2.1. 炔草酯（Clodinafop-Propargyl）剂量响应实验

实验显示，即便在四倍推荐剂量下，EM3的生物量削减仍低于65%。剂量响应曲线表明，最敏感的材料EM2的GR₅₀为60.28 g a.i. ha^?1，而抗性最强的EM3则需要147.97 g a.i. ha^?1，EM3的抗性指数（RI）达到3.93。

3.2.2. 草甘膦（Glyphosate）剂量响应实验

即使在1/4推荐剂量下，敏感材料EM2的生物量就大幅减少，而EM1和EM3几乎不受影响。EM2的GR₅₀为120.56 g a.e. ha^?1，而EM1高达1547.73 g a.e. ha^?1，EM1的RI达到13.91，EM3为9.19。抗性种群需要约四倍的草甘膦剂量才能达到类似的防控效果。

3.2.3. 甲基二磺隆+碘甲磺隆（Mesosulfuron-Methyl + Iodosulfuron-Methyl）剂量响应实验

1/4推荐剂量就能使敏感材料EM1生物量减半，但EM2几乎无影响。EM2的GR₅₀为32.03 + 6.40 g a.i. ha^?1，远高于EM1的6.03 + 1.20 g a.i. ha^?1，EM2的RI约为5.31，表明其对这类ALS抑制剂具有显著抗性。

3.3. 用于检测硬直黑麦草靶标位点突变的TaqMan qPCR分析开发

研究人员开发并优化了针对EPSPS（P106S/T/A）、ACCase（I1781L, T2027C, I2041A, A2078G, C2088A）和ALS（P197G/S, T574L）基因位点的TaqMan qPCR检测探针。结果显示，所有accession在ALS和EPSPS基因上均为野生型；EM1和EM2在ACCase基因上也为野生型，但EM3在1781位点存在Isoleucine突变为Leucine的杂合突变（Ile1781Leu）。某些accession在缺乏可检测靶标位点突变（TSR）的情况下仍存活，暗示了非靶标位点抗性（NTSR）机制（如代谢增强、吸收减少）的存在。

该研究成功论证了基于传感器的智慧农业方法（如NDVI测量）可以作为快速、可靠的工具，用于在生长季早期筛查硬直黑麦草的除草剂抗性。这一方法能帮助农学家和农民在短时间内识别潜在的抗性热点，从而及时调整作物保护策略，避免无效用药。

研究不仅验证了希腊部分地区硬直黑麦草对ACCase、ALS和EPSPS抑制剂的抗性，还揭示了复杂的抗性模式，包括EM3的多重抗性及EM1、EM2中存在的非靶标位点抗性（NTSR）。特别是TaqMan qPCR技术的应用，为理解抗性背后的遗传基础（靶标位点突变TSR与非靶标位点抗性NTSR）提供了分子层面的证据。例如，EM3携带的ACCase Ile1781Leu突变与其对炔草酯的抗性相符，而EM1对草甘膦以及EM2对ALS抑制剂的抗性在没有相应靶标突变的情况下，指向了NTSR机制。

综上所述，将传感器技术、剂量响应生物测定和分子诊断相结合，为除草剂抗性的早期检测和表征提供了一个强有力的框架。这对于推动可持续杂草管理、延缓抗性演化、保障农业经济可持续性具有极其重要的现实意义。当然，未来的研究还需在不同的土壤类型和气候条件下进一步验证这些方法的普适性。