从虾壳中提取和表征壳聚糖的优化方法：脱蛋白处理及基于机器学习的相似性模型探索 Ahmed Hosney, Marius Urbonavi?ius, ?arūnas Varnagiris, Ilja Ignatjev, Johanna Bola?os-Zu?iga, Donata Drapanauskait?, Sana Ullah 以及 Karolina Bar?auskait?

《ChemEngineering》：Optimizing Chitosan Extraction and Characterization from Shrimp Shells: Deproteinization and Exploratory Machine Learning-Based Similarity Model Ahmed Hosney, Marius Urbonavi?ius, ?arūnas Varnagiris, Ilja Ignatjev, Johanna Bola?os-Zu?iga, Donata Drapanauskait?, Sana Ullah and Karolina Bar?auskait?

　　摘要
优化从虾壳中回收壳聚糖是处理虾废料最有效的方法之一。引入基于机器学习的模型将显著影响优化过程。本研究旨在评估使用脱蛋白和基于探索性机器学习的相似性模型方法从Litopenaeus vannamei虾壳中提取壳聚糖的优化效果。在室温（RT）和50 ± 2 °C下，通过不同的NaOH浓度（1%、2%、3%、4%、5%和10%）对虾壳进行壳聚糖提取，并控制脱矿和脱乙酰化条件。壳聚糖产品通过灰分含量、水分、产率百分比、脱蛋白效率、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、脱乙酰化程度（DD）、X射线衍射（XRD）、结晶度指数（CI%）和扫描电子显微镜（SEM）进行了表征。开发了一种基于机器学习的随机森林回归模型，以评估实验室合成壳聚糖与商业壳聚糖（CC）样品之间的相似性。结果显示，获得了半完全脱乙酰化的壳聚糖（脱乙酰化程度为98.84 ± 0.1%至99.27 ± 0.004%）。脱蛋白效果在93.39 ± 0.083%至97.0 ± 0.31%之间。XRD和SEM分析表明，商业壳聚糖（CC）主要具有无定形结构，而分离出的壳聚糖样品在较高NaOH浓度和温度下表现出较低的结晶度。基于机器学习的相似性模型显示，Ch3和Ch4样品与商业壳聚糖的相似度最高，而S1样品的相似度最低。然而，大多数回收的壳聚糖样品与商业壳聚糖的相似度较低；它们保持了较高的脱乙酰化程度（DD%）、结构完整性和质量参数，表明脱蛋白方法在提高壳聚糖产量方面是成功的。

1. 引言
壳聚糖是自然界中第二丰富的生物聚合物——几丁质的衍生物，存在于虾壳中。由于其在各个行业的广泛应用，几丁质和壳聚糖受到了广泛关注。从虾废料中分离壳聚糖涉及对几丁质的部分或完全脱乙酰化[1]。FTIR光谱分析可以根据乙酰葡萄糖胺链转化为葡萄糖胺的转化率来确定几丁质或壳聚糖中官能团的存在。壳聚糖可用于生物医学应用，如药物输送系统、组织工程和疫苗载体[2]。此外，壳聚糖因其带正电的氨基团与带负电的微生物细胞表面相互作用而具有广泛的抗菌活性，这使其在农业中作为基于生物的植物保护解决方案发挥作用，以抵御病原微生物[2,3,4,5]。壳聚糖还可作为食品工业中的天然防腐剂[6]。从虾壳中回收的壳聚糖还被发现能有效吸附重金属和染料，显示出其在废水处理中的环境修复潜力[7]。此外，壳聚糖在农业中也受到关注，因为它能够促进植物生长、提高种子发芽率、增强对干旱等非生物胁迫的耐受性，并抑制某些植物病原微生物[8]。利用虾壳废料生产壳聚糖不仅通过成功的废物管理解决了环境问题，还通过获得经济价值高的产品带来了经济效益[9]。将虾废料转化为壳聚糖为虾养殖业的废物管理提供了一种可持续、环保的解决方案，同时生产出具有多种生物医学、环境、工业和农业应用的材料[10]。从虾壳、蜗牛壳、蟹壳和鱼鳞等不同来源中回收壳聚糖通常包括三个主要提取阶段：脱矿、脱蛋白和脱乙酰化[11,12,13]。在这些步骤中，脱蛋白在决定最终壳聚糖的纯度和结构特性方面起着特别重要的作用，因为它去除了与几丁质基质结合的残留蛋白质。结合脱矿和脱乙酰化，这些过程分别去除了蛋白质、矿物质和乙酰基，从而获得高纯度的壳聚糖[7,14,15]。先前的研究表明，脱蛋白和脱矿强烈影响壳聚糖的产量、灰分含量和脱乙酰化程度，因为蛋白质和矿物质的去除减少了非壳聚糖部分的残留量并影响了回收材料的最终质量[16,17,18]。为了最大化壳聚糖的产量和质量，需要优化脱蛋白和脱矿条件，如酸和碱的浓度、温度和持续时间[9,17,19,20]。壳聚糖的脱乙酰化程度（DD）取决于脱蛋白过程，对壳聚糖的物理化学性质有重要影响[21,22,23]。高脱乙酰化程度与更好的溶解度和较低的生物降解敏感性相关[20,24,25,26,27,28]。优化壳聚糖的回收和质量需要仔细控制脱矿、脱蛋白和脱乙酰化这三个主要加工阶段的提取条件。先前的研究报告称，这些阶段的效率受脱蛋白过程中的碱浓度和温度以及脱矿过程中的酸浓度和处理频率等提取参数的显著影响[16,29,30,31]。尽管在壳聚糖提取的脱蛋白阶段碱浓度和温度的重要性已被广泛报道，但这一阶段对壳聚糖物理化学和结构特性的影响尚未得到充分讨论[20,32]。我们之前发表的论文已经探讨了从虾壳中提取壳聚糖的不同方面。在之前的研究中，通过文献研究和人工神经网络建模结合的方式评估了壳聚糖的产量，以确定关键的提取参数[33]。随后进行了实验可行性研究，通过不同的HCl浓度优化酸性脱矿阶段，同时保持脱蛋白和脱乙酰化条件不变[34]。基于这些发现，本研究重点优化脱蛋白阶段，以找到去除残留蛋白质的最佳条件，并确定从Litopenaeus vannamei虾壳中分离出的壳聚糖的结构特性和纯度。此外，本研究提供了一个确定性的相似性评分框架和一个基于纯度和结构特性的探索性机器学习框架，以评估提取的壳聚糖样品与商业壳聚糖之间的相似性。相似性框架引入了多种物理化学和结构描述符，包括水分含量、灰分含量、FTIR光谱和结晶度指数，以创建一个统一的评分系统。研究使用探索性机器学习来确定测量描述符是否保持相同的相似性分组模式。因此，本研究的目标包括：（i）在室温和50 ± 2 °C下调整不同的脱蛋白碱浓度，在稳定的脱矿和脱乙酰化条件下优化壳聚糖提取；（ii）研究脱蛋白步骤对所得壳聚糖的物理化学和结构特性的影响；（iii）结合先进的可视化技术，利用确定性的相似性评分和探索性机器学习模型来评估提取的壳聚糖样品与商业壳聚糖的相似性。

2. 材料与方法
2.1. 材料
使用的材料包括Merk（德累斯顿，德国）生产的440级无灰滤纸、98%氢氧化钠颗粒和37%盐酸；PanReac AppliChem（巴塞罗那，西班牙）和Frisenette（克内贝尔，丹麦）的产品。所有用于去除矿物质、蛋白质和乙酰基的溶液均使用高纯度双蒸水制备。商业壳聚糖（脱乙酰化程度为91.6%）由位于美国德克萨斯州的Santa Cruz Biotechnology公司提供。本研究中使用的Litopenaeus vannamei虾从立陶宛当地市场购买。

2.2. 方法
2.2.1. 虾壳预处理
从立陶宛当地市场收集Litopenaeus vannamei虾，然后仔细包装并送往立陶宛农业和林业研究所的农业生物学实验室（LAMMC）。虾被剥壳，收集外骨骼，用蒸馏水多次清洗以去除杂质，然后在105 °C的烤箱中干燥。收集的虾壳经过清洁去除残留组织，干燥后使用实验室研磨机机械研磨。将研磨后的材料筛分，得到约0.25毫米大小的颗粒。将虾壳粉末在双蒸水中煮沸1小时，然后过滤，滤液在75 °C下烘箱干燥24小时。根据AOAC（2005）[35]分析虾壳的组成。使用元素分析仪（ECS 4010，COSTECH，美国圣克拉丽塔）[33]测定蛋白质含量。使用电感耦合等离子体-光学发射光谱仪（ICP-OES，PerkinElmer，美国沃尔瑟姆）[36]测定原始壳的矿物质含量。使用扫描电子显微镜（SEM Hitachi S-3400N，Hitachi High-Technologies Corporation，东京，日本）[37]检查壳表面的地形。

2.2.2. 提取过程优化设计
本研究的实验设计采用了6 × 2因子结构，测试了脱蛋白阶段中的六种NaOH浓度（1%、2%、3%、4%、5%和10%），并在两个温度（23 ± 2 °C和50 ± 2 °C）下进行评估。这两个因素作为主要变量。其他所有提取参数保持不变，以减少混杂影响，包括脱矿和脱乙酰化试剂的浓度（分别为2% HCl和50% NaOH）、反应时间（每个阶段2小时）以及固液比（1:10，w/v）。本研究采用12种处理组合，生成了24个实验单元。图1的图形方案展示了通过脱蛋白和相似性建模方法改进提取过程。环境温度（23 ± 2 °C）作为基线测试条件，以评估不添加热能输入时的提取过程效率。相比之下，选择50 ± 2 °C作为中等升高的温度，以提高蛋白质、矿物质和乙酰基的去除效率，同时避免温度过高导致聚合物降解。先前的研究表明，在40至60 °C之间的提取温度下，在受控条件下，提取效率和壳聚糖纯度可以提高[21,33,38,39]。
图1. 使用脱蛋白和基于（MLSM）机器学习的相似性模型方法的壳聚糖提取图形方案。根据实验设计矩阵对十二个样品进行了分类，如表1所示。在所有提取阶段应用恒定的固液比1:10（w/v），以确保足够的溶剂完全浸没壳材料，并使固液两相充分接触。研究将此特定比例作为所有处理组合的固定操作条件，以确保所有提取阶段的条件可比[33,34]。

2.2.3. 壳聚糖回收
2.2.3.1. 脱蛋白
六份干燥的壳粉末样品分别用1%、2%、3%、4%、5%和10%的氢氧化钠溶液处理以去除蛋白质。所有处理的固液比保持为1:10（w/v）。脱蛋白阶段在室温（23 ± 2 °C）和50 ± 2 °C下进行，同时以150 rpm的速度连续搅拌2小时；之后将样品在室温下静置24小时。处理后的壳用双蒸水反复冲洗至中性，然后在室温下空气干燥24小时。使用元素分析仪（ECS 4010，COSTECH，美国）测定回收样品中的氮含量，并使用Díaz-Rojas等人推荐的化学计量法[40]估算蛋白质含量。所有样品的蛋白质去除百分比按以下公式计算[33]：
蛋白质去除百分比 (%) = ((Psh × Bsh) ? (Pdp × Bdp))/(Psh × Bsh) × 100
其中Psh和Pdp分别是原始壳和脱蛋白壳中的蛋白质浓度（百分比），Bsh和Bdp分别是原始壳和脱蛋白壳的生物量（克）。

2.2.3.2. 脱矿
虾壳含有多种矿物质成分，其中钙主要以碳酸钙的形式存在。在脱矿阶段，脱蛋白后的壳粉末用2% HCl处理，固液比为1:10（w/v）。脱矿反应在室温（23 ± 2 °C）和50 ± 2 °C下进行，同时以150 rpm的速度连续搅拌2小时。二氧化碳的释放是有效脱矿的指标。反应完成后，材料经过过滤，并用双重蒸馏水彻底洗涤直至达到中性，然后在75°C下烘烤12小时以获得壳聚糖[34]。脱乙酰化：通过用50% NaOH在固液比（w/v）为1:10的条件处理，将脱矿后的壳聚糖转化为壳聚糖。反应在室温（23 ± 2 °C）和50 ± 2 °C下进行，同时以150 rpm的速度连续搅拌2小时。之后，反应混合物在室温下再放置24小时，无需搅拌。所得壳聚糖随后用双重蒸馏水反复洗涤直至pH值中性，以去除多余的碱。最后，洗涤后的样品在105°C下烘烤12小时。干燥后的壳聚糖样品进行了表征[34]。2.2.4. 壳聚糖表征 灰分和水分含量的测定在本研究中，使用AOAC [35]和重量法标准方法[41]分别对回收的壳聚糖样品的灰分和水分含量进行了重复测定，具体公式如下： 灰分含量（%）=（灰分重量）/（初始样品重量）× 100 (2) 水分含量（%）=（初始壳聚糖重量 - 干燥后壳聚糖重量）/（初始壳聚糖重量）× 100 (3) 壳聚糖产率的测定所有提取样品的壳聚糖产率通过将回收的壳聚糖质量与原始虾壳的初始质量之比乘以100来计算[35]。FTIR（傅里叶变换红外）分析使用Alpha光谱仪（BRUKER，德国埃特林根）和RT-DLATGS检测器，进行64次扫描，分辨率6 cm?1，通过分析商业壳聚糖和分离壳聚糖样品中存在的官能团来确认壳聚糖的形成。为了制备颗粒，将3 mg的干燥壳聚糖样品与200 mg的KBr混合，而纯KBr颗粒作为空白对照。光谱采集范围为4000–400 cm?1。FTIR光谱提供了关于商业壳聚糖和分离壳聚糖样品振动模式和官能团的详细信息。根据[42]提出的方程式，从FTIR光谱中重复估计回收壳聚糖产品的脱乙酰化程度： DD（%）=（100 ? {(A1650/A3450) × 100/1.33} % (4) 其中A1655对应酰胺I带的吸光度，A3450对应羟基（-OH）带的吸光度，因子1.33表示完全脱乙酰化壳聚糖的A1655与A3450的比率。SEM（扫描电子显微镜）分析使用Hitachi S-3400N（Hitachi High-Technologies Corporation，日本东京）来检查商业壳聚糖和回收壳聚糖样品的表面形貌。在加速电压为3 kV的条件下，采用×50、×100、×500和×1000的放大模式获取图像，以获得高分辨率的表面形貌图像[43]。XRD（X射线衍射）分析使用X射线衍射仪（XRD，Bruker D8，Bruker AXS GmbH，德国卡尔斯鲁厄）分析了商业壳聚糖和提取壳聚糖样品的晶体结构，采用Cu Kα辐射，在10–70°的2θ范围内进行，步长为0.01°。在结晶度分析之前，对衍射图进行了基线校正和完全峰解卷积，以便分离结晶和非结晶成分。然后根据[44]描述的公式，通过解卷积后的结晶峰面积计算每个样品的相对结晶度（CI%）： CI（%）= 100 × CrA/TDA (5) 2.2.5. 统计分析所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics for Windows 25.0版本（美国纽约阿蒙克）进行。数据通过方差分析（ANOVA）进行分析，均值之间的差异使用95%置信区间进行评估。统计显著性水平为p ≤ 0.05。2.2.6. 相似性建模方法设计了相似性框架，用于将提取的壳聚糖样品（S1、S2、S3、S4、S5、S10、Ch1、Ch2、Ch3、Ch4、Ch5和Ch10）与商业壳聚糖（CC）作为参考材料进行比较。相似性比较基于选定的特征，包括水分含量、灰分含量、羟基（-OH）带的波数、羟基（-OH）带的透射率、酰胺I带的波数、酰胺I带的透射率以及每个样品的结晶度指数（CI）。所选参数描述了分离壳聚糖的结构特性、纯度及其相对于商业壳聚糖的主要化学特征。该设计包括数据预处理、相似性百分比计算、探索性机器学习建模以及多种图形可视化，涉及接收者操作特征（ROC）曲线、残差图和热图。每个组件的设计和功能如下[45]。数据集预处理：提供数值数据，展示参考商业壳聚糖（CC）和分离壳聚糖样品的各种特性，确保它们格式正确且适合进行相似性分析和回归建模。数据结构：每一行对应一个壳聚糖样品，第一行代表作为参考的商业壳聚糖（CC），数据集包括以下内容：水分含量（%），表示每个样品中的水分含量；灰分含量（%），表示每个壳聚糖样品中的无机物含量；(FTIR)羟基（-OH）和酰胺I带的波数及透射率，反映了壳聚糖材料的化学特性和脱乙酰化程度；每个样品的结晶度指数（CI），表示每个壳聚糖材料的结构有序程度。相似性计算：使用基于选定测量特征的确定性评分函数，计算每个提取的壳聚糖样品与商业壳聚糖作为参考之间的特征相似性和总体相似性百分比，具体步骤如下： 样品特征相似性 = 1 ? |样本特征 ? CC特征|/(CC特征) (6) 总体相似性百分比 = 1 ? |样本特征相似性总和|/(特征数量) × 100 (7) 尽管所应用的确定性相似性评分公式在理论上对于较大偏差可能会产生负值，但当前数据集中的所有特征相似性均保持在合理范围内。因此，该指标作为特定数据集的相对比较工具使用，而不是通用指标。所有选定的特征都被赋予相同的权重，以便在壳聚糖样品之间进行透明的一阶比较。等权重假设简化了问题，因为它假设所有参数具有相同的权重，尽管不同的物理化学和结构参数可能会根据各种应用对壳聚糖质量产生不同影响。此方法允许使用主要测量特征对获得的样品和商业壳聚糖进行实际的综合比较。相似性阈值：使用85%的相似性阈值将样品分为两组，分别标记为“相似”和“不相似”，这基于它们与商业壳聚糖的相对相似性。该阈值作为经验标准，用于识别提取样品的物理化学和结构特性与现有数据集中商业壳聚糖参考样品的相似性。探索性机器学习随机森林回归：由于样本总数有限，仅在相似性确定性计算之后作为探索性步骤采用了随机森林回归模型[38,39,40,41,42]，以验证选定的描述符是否再现了相似性框架中获得的相同模式。数据被分为80%的训练集和20%的测试集。使用训练数据训练模型，并预测整个数据集的总体相似性得分。可视化：使用接收者操作特征曲线（ROC）表示模型和相似性计算的结果，以评估壳聚糖样品的二元分类为相似或不相似，并计算曲线下的面积（AUC）以估计模型的分类性能，同时应用残差图来识别预测相似性和实际相似性之间的差异，以确定探索性模型是否存在潜在偏差或不准确性[46,47,48]。此外，热图的颜色范围为蓝色和红色，用于显示提取的壳聚糖样品与商业壳聚糖参考之间的总体相似性百分比，以便轻松识别低相似性和高相似性样品[49,50]。另外，使用混淆矩阵总结了探索性模型的性能，以区分相似和不相似的样品，显示真正例、假正例、真负例和假负例的计数[51,52,53,54]。3. 结果与讨论 3.1. 原始壳分析在本研究中，使用不同浓度的NaOH（1、2、3、4、5和10%）作为初始步骤进行碱性脱蛋白，从而从虾壳中回收壳聚糖。脱蛋白反应在室温（23 ± 2 °C）和50 ± 2 °C下进行，而脱矿和脱乙酰化步骤在固定条件下进行。原始壳成分的分析显示，基于湿基的含水量为47.485 ± 0.835%，而基于干重的蛋白质含量为30.48 ± 0.29%，灰分为57.45 ± 0.12%。本研究中观察到的虾壳蛋白质含量低于[21]报告的值（38.49%），尽管该研究报道的含水量和灰分含量（11.39%和35.02%）低于本研究的结果。ICP-OES的矿物分析表明，钙是原始壳中的主要矿物质（14.83 ± 0.22%），其次是磷（2.58 ± 0.04%）和镁（1.35 ± 0.01%）。本研究中发现的钙含量低于[55]报告的虾材料中的钙含量（41.21%）。3.2. 灰分和水分含量低灰分含量是酸性脱矿成功的主要指标之一，因为它反映了有效的矿物质去除和壳聚糖纯度的提高。商业壳聚糖的灰分为1.2 ± 0.05%，而本研究中获得的壳聚糖灰分含量在室温（23 ± 2 °C）下为2.43 ± 0.042%至1.18 ± 0.07%，在50 ± 2 °C下提取的壳聚糖灰分含量为1.44 ± 0.16至0.74 ± 0.05%（见图2A和图2B），表明在较高温度（50 ± 2 °C）下去除矿物质的效果显著。统计分析（ANOVA）表明，NaOH浓度（p < 0.001）、温度（p < 0.001）及其交互作用（p < 0.001）对灰分含量有显著影响。在室温下，1% NaOH时的灰分含量为2.43%，而在10% NaOH时降至1.18%；在50 °C时，灰分含量从1% NaOH时的1.45%显著降低到10% NaOH时的0.74%。这一趋势表明，在脱蛋白阶段，随着NaOH浓度和温度的增加，脱矿效果有所提高。图2. 在不同脱蛋白条件下回收的壳聚糖样品的灰分含量（%）：(A) 在室温（RT）下；(B) 在50 ± 2 °C下。数据显示为平均值 ± 标准差（n = 2）。本研究的结果与Sagheer等人[56]的研究一致，他们指出碱浓度的增加和提取温度的提高导致灰分显著下降，并有利于从甲壳类壳中去除碳酸钙。因此，50 °C下10% NaOH似乎是去除灰分的最佳组合，提供了适用于高价值应用的材料。相比之下，其他先前的研究报告称多阶段脱矿比单阶段方法更有效地去除矿物质[57]。然而，多次浸泡脱矿可能会导致通过增加酸性废物的处置而加剧环境退化[58]。当前结果表明，即使在脱蛋白阶段之后，使用单阶段HCl处理仍可以实现有效的酸性脱矿。相比之下，商业壳聚糖的灰分为0.25 ± 0.02%，而提取样品的灰分含量范围为0.1 ± 0.02%至0.44 ± 0.01%（见图3）。具体而言，随着NaOH浓度从1%增加到10%，在室温和高温下分离的两种壳聚糖样品的灰分含量分别从0.44%降低到0.1%。这一模式与高NaOH浓度可以增强脱蛋白过程并减少壳聚糖基质中的保水基团，从而导致较低水分含量的观点一致[57,58]。此外，当比较在室温和50 °C下使用相同NaOH浓度分离的壳聚糖样品的灰分含量时，后者的灰分含量较低。这可能是因为升高的温度可以有效地促进蛋白质和亲水基团的分解，从而降低整体含水量[56,59]。本研究中获得的含水量值（7.24–7.85%）明显低于[60]报告的值，并与[61]的陈述一致，即高纯度的壳聚糖具有低于10%的含水量。图3显示了在不同脱蛋白条件下，室温（RT）和50 ± 2 °C下提取的壳聚糖样品的含水量（%）。3.3. 脱蛋白条件对壳聚糖产率的影响。图4显示了从Litopenaeus vannamei虾壳中获得的壳聚糖产率，这取决于所使用的脱蛋白条件。随着NaOH浓度的增加，产率在两种温度组中都下降了。在较高温度下，这种下降更为明显。在室温下，产率从1% NaOH时的24.1 ± 0.03%降至10% NaOH时的10.7 ± 0.08%。图4. 在不同NaOH浓度下，室温（RT）和50 ± 2 °C下进行碱性脱蛋白时提取的壳聚糖样品的产率百分比。数据以平均值±标准差（n = 2）表示，星号（*）表示p值<0.05的显著性水平。在50 ± 2 °C下，产率从1% NaOH时的11.2 ± 1.13%降至10% NaOH时的7.8 ± 0.85%。双因素方差分析表明，NaOH浓度、温度及其交互作用对产率有统计学上的显著影响（p < 0.05）。这些发现表明，更极端的碱浓度和更高的温度有助于蛋白质的去除，同时促进部分聚合物的降解和降解产物的溶解，最终降低了壳聚糖的回收率。这些发现超过了[28,62,63]报告的结果，但低于[64]报告的产率范围（50.39–88.25%）。壳聚糖产率的变化可能是由于物种来源、提取条件（特别是浓度、时间和温度）的不同[65]。从过程优化的角度来看，这些结果揭示了产率与质量之间的权衡。在1% NaOH和室温下获得了最高的产率，但这些条件与较高的灰分含量和较低的与商业壳聚糖的相似性相关。相比之下，在50 ± 2 °C和中等NaOH浓度下获得的Ch3和Ch4样品与商业壳聚糖的相似性最高，并且结构质量良好，但它们的产率明显较低。因此，当优先考虑纯度、高脱乙酰度（DD%）和与商业壳聚糖的结构相似性时，S3–S5等中间条件可能是一个更现实的折中方案，因为它们在保持较高壳聚糖产率的同时仍能达到可接受的物理化学性质。3.4. NaOH浓度和温度对脱蛋白效率的影响。脱蛋白效率是优化从虾壳中回收壳聚糖的关键因素。从虾壳中去除蛋白质取决于虾的品种、虾壳中的初始蛋白质含量、碱浓度以及脱蛋白条件。我们目前的研究表明，脱蛋白效率显著受到NaOH浓度和温度的影响，从而提高了从虾壳中去除蛋白质的效果。图5显示了在不同NaOH浓度下，然后用2%盐酸在室温（RT）和50 °C下进行恒定酸性脱矿处理，去除虾壳中的蛋白质以获得几丁质的效果。方差分析（ANOVA）的结果表明，无论是室温（RT）还是50 °C，将温度和NaOH浓度从1%增加到10%都能显著提高脱蛋白效率（p值<0.05），并且这两种因素之间存在明显的交互作用；然而，趋势并不完全线性。在室温（RT）下脱蛋白的样品的脱蛋白率为（93.39 ± 0.083–96.41 ± 1.07%），而在50 °C下脱蛋白的样品的脱蛋白率为（95.22 ± 0.38%–97.0 ± 0.31%）。本研究使用室温（RT）和50 °C下的脱蛋白方法获得的较高脱蛋白率（>93.0%）高于先前研究[11,16,17]报告的脱蛋白率（38?85%），但低于[21,26]获得的结果。当前结果表明，在脱矿之前先进行脱蛋白阶段，使用室温（RT）或50 °C下的1%至10% NaOH浓度可以达到超过90%的有效脱蛋白效果。图5. 在不同NaOH浓度下，室温（RT）和50 ± 2 °C下的脱蛋白率。数据以平均值±标准差（n = 2）表示，星号（*）表示p值<0.05的显著性水平。3.5. 傅里叶变换红外光谱分析（FTIR）。图6展示了商业壳聚糖样品和提取壳聚糖样品的功能基团的振动模式特性。图6的(A)部分表示在室温（23 ± 2 °C）下，使用不同NaOH浓度在稳定的脱矿和脱乙酰化条件下分离的商业壳聚糖（CC）和壳聚糖样品的分析，而(B)部分则展示了在50 ± 2 °C下使用不同NaOH浓度提取的壳聚糖样品的FTIR光谱。光谱数据显示，在约3450 cm?1至约1068 cm?1之间观察到壳聚糖多糖主链的显著吸收带，这表明由于几丁质中乙酰基的部分或完全去除，葡萄糖胺链上的-C2位置存在自由氨基（-NH2）[66]。图6. 在不同脱蛋白条件下，室温（RT）（A）和50 ± 2 °C（B）下提取的商业壳聚糖样品的FTIR振动模式。图6A中所有提取壳聚糖样品在RT下的光谱和图6B中50 ± 2 °C下的光谱在3450 cm?1附近显示出一个宽吸收带，这归因于多糖主链和氢键网络中的O-H伸缩振动与N-H伸缩的叠加。在壳聚糖样品（Ch1–Ch10）的光谱中，这个宽吸收带更为明显，表明在50 °C提取后存在更多的自由氨基，而在2890 cm?1观察到的带则归因于-CH2类型的C-H伸缩振动[10]。这两个系列的强度在该区域相似，表明温度没有改变多糖的碳氢骨架。有趣的是，在样品（S3–S5）中观察到一个位于2200至2250 cm?1之间的弱带。这个带对应于C≡N伸缩振动，可能是由于在强碱条件下产生的杂质或腈基团或CO2的倍频[8,67]。商业壳聚糖中这个带的强度较弱或缺失可能表明这是由于在碱提取过程中结构发生了轻微的修改。即使在提取的壳聚糖的功能性能上并不重要，这样的特征偶尔也会在碱性处理的生物聚合物中被报告[31,68,69]。在酰胺区域，1654–1659 cm?1（酰胺I，C=O伸缩）和1590–1560 cm?1（酰胺II，N-H弯曲与C-N伸缩）的带与CC相比显著减弱。这种减少表明脱乙酰化效果良好，因为剩余的酰胺基团较少[30]。在50 °C下提取的样品显示出减弱的酰胺II吸收，对应于高程度的脱乙酰化。在约1267 cm?1处出现了一个弱的酰胺III振动（C-N伸缩和N-H变形），进一步支持了剩余乙酰基的丢失。在约1370–1378 cm?1处的振动模式对应于CH3基团中C-H的对称变形。FTIR结果中恢复的壳聚糖样品（S1–S10）和（Ch1–Ch10）的一级和二级酰胺的峰值与最近研究[21,33]获得的相似范围一致。这些观察结果与化学测得的脱乙酰度（DD%）值相符，证实了两系列样品的脱乙酰化几乎是完全的。此外，在约1157 cm?1（β-(1 → 4)-糖苷键的C-O-C不对称伸缩）和约1068 cm?1（仲醇的C-O伸缩）处的强烈吸收是壳聚糖多糖结构的标志。此外，在约890 cm?1处观察到的峰对应于β-吡喃糖环的骨架振动，从而确认了处理后多糖主链的完整性。这两系列获得的壳聚糖产物在这些带上的变化很小，与CC相比，表明碳水化合物框架保持了其结构完整性。3.6. 脱乙酰度（DD）。脱乙酰度（DD）是一个关键参数，反映了在后续处理过程中从壳聚糖多糖结构中去除的乙酰基的数量，这影响了其功能、溶解性、化学和生物反应性[70]。结果显示，不同提取的壳聚糖样品之间的脱乙酰度有轻微的变化，这可能是由于在脱蛋白阶段使用了不同的NaOH浓度，然后在室温（50 ± 2 °C）下进行恒定的脱矿和脱乙酰化步骤。根据文献，通过比较酰胺I带的吸收带与-OH带，使用FTIR光谱确定了商业壳聚糖和从虾壳中分离的壳聚糖样品的脱乙酰度[71]。根据产品分析证书，商业壳聚糖的脱乙酰度为91.6% ± 0.71%。本研究中分离的壳聚糖样品的脱乙酰度值总结在表2中。脱乙酰度值显示，在室温下分离的壳聚糖样品的脱乙酰度在98.84%至99.05%之间。商业壳聚糖的参考值仅为91.6%，表明在室温下碱处理有效地去除了乙酰基，这可能是因为将样品在碱性溶液中过夜而不搅拌以增强脱乙酰化动力学。在RT下回收的样品组之间的变化很小，浓度之间的差异小于0.25%。RT下分离的壳聚糖的脱乙酰度略低于50 ± 2 °C下分离的壳聚糖，这反映了室温处理下的有效脱乙酰化，可能留下了一些乙酰基的痕迹。如此高的脱乙酰度表明其具有显著的反应性和溶解性改善，这与先前的研究结果一致，即DD > 95%是生物医学级壳聚糖的阈值[38,57,61]。表2. 商业壳聚糖和分离壳聚糖样品的脱乙酰度（DD%）。另一方面，在50 ± 2 °C下获得的壳聚糖产品的脱乙酰度范围为99.24–99.27%，略高于S系列的相应值。因此，将提取温度从室温提高到50 °C，略微提高了脱乙酰效率。在较高温度下，NaOH在聚合物基质中的溶解度和扩散率增加，导致脱乙酰度值接近完全脱乙酰，从而增加了酰胺基团的断裂。这些结果与Nguyen等人报告的在优化碱性条件下从虾壳壳聚糖中获得的99% DD相当[20]。在50 °C下获得的样品重复实验之间的低变异性（SD< 0.01%）表明了该过程的高再现性和稳定性。本研究中提取的壳聚糖样品的脱乙酰度高于[27,31,62]报告的脱乙酰度（39.1–72.92%），并低于[72]报告的脱乙酰度（100%）。3.7. X射线衍射（XRD）图案。X射线衍射技术广泛用于确定晶体平面，并提供了令人信服的证据，以识别聚合物是无定形还是结晶结构[37]。此外，它还可以精确测量结晶度，这是显著影响壳聚糖聚合物的形态、物理和生物性质的关键因素[10]。使用X射线衍射确定了商业壳聚糖样品和分离壳聚糖样品的结晶结构，如图7所示。使用1, 2, 3, 4, 5, 和10% NaOH在室温（RT）和50 ± 2 °C下获得的提取壳聚糖样品S1–S10（图7A）和Ch1–Ch10（图7B）的XRD衍射图显示，在20°（2theta）附近有一个宽的衍射峰，对应于低结晶壳聚糖的（110）反射[73,74]。这种反射常用于计算结晶度指数（CI），它衡量分子有序性，受脱乙酰化、杂质和处理条件的强烈影响。除了大约20°的主峰之外，一些样本中还观察到一个位于2θ ≈ 10°之间的较小肩峰。这个峰表明了壳聚糖存在的水合晶体形式；随着脱乙酰化程度（DD）的增加，这一峰会减弱，因为结构的含水量降低[75]，这表明较高的DD%（>98%）会破坏水合晶体域。这支持了傅里叶变换红外光谱（FTIR）证据中显示的酰胺带减弱的现象。大多数样本在2θ为26°到28°之间显示出额外的低强度峰，这些峰是由晶体矿物杂质而非壳聚糖引起的。在灰分含量超过2%的室温（RT）样本中存在这些反射峰，表明这些结晶粒子中残留有矿物质。这与灰分含量数据一致，因为室温处理的样本比在50 ± 2°C处理的样本保留了更多的矿物质。图7显示了商业壳聚糖（CC）和提取的壳聚糖样品在室温（RT）和50 ± 2°C下的XRD结果。通过改变NaOH浓度和提取温度分析回收壳聚糖样品的结晶度指数，如表3所示。室温样本的CI (%)值范围从4.84%（S5）到10.50%（S1），表明结晶度较低，而商业壳聚糖则呈现完全无定形状态。S1（10.50%）和S2（7.54%）具有最高的CI值，表明在室温下使用较低的NaOH浓度可以保留更多的晶体域。一些室温样本中观察到的明显CI值增加可能反映了额外晶体成分的存在或壳聚糖结构有序性的差异；然而，要确定确切的相态需要进一步的专门验证。相反，在50 ± 2°C下回收的壳聚糖样品（Ch1–Ch10）显示出较低的结晶度，范围从0.37%（Ch1）到5.27%（Ch3）。尽管如此，这些样本的脱乙酰化程度接近完全（~99.2%），并且灰分含量较低（<1.45%）。高温导致链断裂并重新排列成更无定形的结构，从而降低了结晶度。这一组中最高的CI值（Ch3，5.27%）仍然低于室温提取的样本，表明热脱乙酰化增加了脱乙酰化程度，但损害了晶体有序性[76]。这种降低的结晶度指数可能是由于脱蛋白过程中NaOH浓度和温度的升高，这有助于蛋白质的去除并促进乙酰基的消除，从而改变了有序的晶体结构。在本研究中，从虾壳中提取的壳聚糖的结晶度指数低于先前研究报道的值[60,77,78]。表3显示了提取壳聚糖样品的结晶度指数（CI）。

3.8 扫描电子显微镜（SEM）分析
SEM分析用于提供形态学的概述，包括表面结构、孔隙率和宏观结构特征[78]。应用了五种不同的放大倍数：×50、×100、×500、×1000和×3000。×50放大倍数的形态图像（图8）显示，原始虾壳具有致密、分层和紧凑的结构，且没有孔隙率，代表了由壳聚糖链与碳酸钙和蛋白质连接组成的完整壳基质。相比之下，商业壳聚糖（CC）呈现出高度碎片化、多孔且不稳定的表面，有微小颗粒，表明通过工业处理后壳聚糖发生了显著的结构改变，这与Ibitoye等人的研究结果一致[16]。同时，室温下提取的壳聚糖样品（S1–S10）随着NaOH浓度的增加，表面破坏、碎片化、孔隙率和不规则层状结构逐渐增加。S1和S2样品表现出紧凑和坚硬的碎片，孔隙率较低，反映了它们较高的灰分含量（2.43%和2.30%）和水分水平。相比之下，S3–S5样品表现出更加破碎和多孔的表面形态以及更大的粗糙度和不规则的边缘，这与它们更高的脱蛋白程度和较低的灰分含量（~1.26–1.77%）一致。这与它们逐渐的结构变化和中等程度的定量相似性（72–82%）相符。最后，S10比S1–S5更加碎片化且更薄，这与它较低的灰分含量（1.18%）和极高的脱乙酰化程度（>99.0%）相关。图8显示了原始壳、商业壳聚糖（CC）以及在室温（RT）和50 ± 2°C下回收的壳聚糖样品在×100放大倍数下的SEM图像。另一方面，在50 ± 2°C下回收的壳聚糖样品（Ch1–Ch10）表现出显著不同的形态，孔隙率、表面粗糙度和片状结构增加，表明在较高温度下蛋白质和矿物质被优先去除。Ch1和Ch2虽然多孔但结构紧凑，这与稍高的灰分残留量（1.35–1.44%）一致。有趣的是，Ch3和Ch4样品显示出更明显的层状形态和更细的片状结构，这与它们较低的灰分含量（约0.92–1.12%）和低结晶度（3.4–5.3%）相对应，与商业壳聚糖高度相似。因此，这些结果表明，在50°C下使用3–4%的NaOH进行可控的碱脱蛋白处理可以产生接近商业壳聚糖的形态，这将从FTIR带的结构秩序和较低的杂质中得到体现。相反，Ch5和Ch10显示出更紧凑的结构，孔隙率适中，反映了结构纯度与商业壳聚糖形态相似性之间的权衡。在更高放大倍数×3000和10 μm尺度下的SEM分析（图9）显示，原始虾壳具有密集的纤维网络、矿物夹杂物、蛋白质空腔和紧凑的层状结构。这种形态解释了处理前可见的高初始灰分含量和蛋白质残留。文献证实，未经处理的甲壳类动物壳由嵌入CaCO3和蛋白质基质中的壳聚糖纤维组成[38,78]。相比之下，商业壳聚糖表现出碎片化且无序的多孔表面，具有不规则的棱纹和凹槽，缺乏明显的层次。而在室温下分离的壳聚糖样品的×1000和50 μm尺度SEM图像显示，随着NaOH浓度的增加，表面碎片化、粗糙度和无序性逐渐增加。S1和S2样品显示出致密的层状结构，具有排列整齐的层状纤维和少量孔洞，而S3和S4样品显示出更高的粗糙度和多孔表面，具有纤维丝状结构，这是早期孔洞形成的特征。一些裂纹和开口表明碱渗透和脱蛋白效果更好。此外，S5–S10的表面更加多孔和紊乱，具有明显的微孔和裂纹。纤维失去排列，表明原始结构完全破坏。特别是S10显示平坦、塌陷的碎片，而不是纤维，表明在室温下碱处理导致了显著的结构破坏。图9显示了原始壳、商业壳聚糖（CC）以及在室温（RT）和50 ± 2°C下回收的壳聚糖样品在×1000放大倍数下的SEM图像。相比之下，在50 ± 2°C下回收的壳聚糖样品（Ch1–Ch10）表现出更高的孔隙率和粗糙度。Ch1–Ch2的表面看起来片状、更光滑，但相对紧凑。可以看到一些小孔和纤维分离，证实它们的灰分值略有增加（~1.3 ± 0.1–1.4 ± 0.1%）。Ch3和Ch4显示出最破碎和多孔的微观结构，表明层状分离良好，纤维碎片化和微孔形成，而Ch5和Ch10则表示更密集和聚集的微观结构，孔洞较少。这可能是由于在较高温度下进行了更强的碱处理。这一结果与[25,79]之前的研究结果一致。SEM只能提供关于表面形态的定性数据，因此不能直接量化结晶度。因此，SEM与XRD结果一起用于解释观察结果，而不是分别证明晶体或无定形结构。此外，未来可以采用差示扫描量热法（DSC）和固态核磁共振（NMR）等互补方法，以提供对提取壳聚糖样品结构组织的深入解释。

3.9 相似性评分和探索性机器学习建模结果
在不同脱蛋白条件下制备的壳聚糖样品通过与商业壳聚糖（CC）的相似性进行评估，采用的是基于多种物理化学和结构特征的确定性相似性评分框架，如水分含量、灰分含量、脱乙酰化程度（DD%）、官能团振动（FTIR）和X射线衍射结晶度指数（CI）。总体相似性百分比的结果总结在表4中。在室温下回收的壳聚糖样品（S1–S2）与CC的相似性最低（34.6–59.1%）。因此，这些样品被归类为不相似，显示出关键性质的显著偏差，如高残留水分和灰分含量，以及与CC相比的结晶度差异。然而，它们在某些质量参数上表现优于参考壳聚糖，特别是较高的DD%，表明它们的纯度可能较低，但其结构更加纯净。样品S3、S4、S5、Ch1、Ch2、Ch5和Ch10与商业壳聚糖的相似性适中（72.3–82.1%），反映了部分特征一致性。相反，Ch3和Ch4显示出最高的相似性百分比（87.3%和89.7%），超过了相似性阈值，表明与CC最为接近，其中Ch4的相似性达到最大值89.7%。这些结果表明，使用4%的NaOH进行脱蛋白处理，并结合一致的脱矿（2% HCl）和脱乙酰化（50% NaOH）在50 ± 2°C条件下，可以生产出物理化学和结构性质与CC相当或更优的壳聚糖。尽管大多数样品与商业壳聚糖不相似，但它们的脱乙酰化程度都高于CC，并且在官能团完整性、水分和灰分含量方面保持在可接受范围内。这表明提取的壳聚糖在各种工业应用中具有很大的潜力，并且可以通过改进来生产更高等级的壳聚糖产品，即使它们不完全类似于商业级别的壳聚糖。表4显示了在室温（RT）和50 ± 2°C下提取的壳聚糖样品与商业壳聚糖的相似性（%）。

3.9 类似性评分和探索性机器学习建模结果
使用基于多种物理化学和结构特征的确定性相似性评分框架，评估了在不同脱蛋白条件下制备的壳聚糖样品与商业壳聚糖（CC）的相似性，如水分含量、灰分含量、脱乙酰化程度（DD%）、官能团振动（FTIR）和X射线衍射结晶度指数（CI）。总体相似性百分比的结果总结在表4中。在室温下回收的壳聚糖样品（S1–S2）与CC的相似性最低（34.6–59.1%），因此被归类为不相似，显示出高残留水分和灰分含量等关键性质的显著差异，以及与CC相比的结晶度差异。然而，它们在某些质量参数上的表现优于参考壳聚糖，特别是较高的DD%，表明它们的纯度可能较低，但结构更为纯净。样品S3、S4、S5、Ch1、Ch2、Ch5和Ch10与商业壳聚糖的相似性适中（72.3–82.1%），反映了部分特征的一致性。相反，Ch3和Ch4显示出最高的相似性百分比（87.3%和89.7%），超过了相似性阈值，表明与CC最为接近，其中Ch4的相似性达最大值89.7%。这些结果表明，在50 ± 2°C下使用4%的NaOH进行脱蛋白处理，结合一致的脱矿（2% HCl）和脱乙酰化（50% NaOH）条件，可以生产出物理化学和结构性质与CC相当或更优的壳聚糖。虽然大多数样品与商业壳聚糖不相似，但它们的脱乙酰化程度都高于CC，并且在官能团完整性、水分和灰分含量方面保持在可接受范围内。这表明提取的壳聚糖在工业应用中具有很大的潜力，并且可以通过改进来生产更高等级的壳聚糖产品。总体而言，研究结果表明提取的壳聚糖在各种工业应用中具有显著潜力，并且可以通过改进来生产更高等级的壳聚糖产品，即使它们不完全类似于商业级别的壳聚糖。

4. 结论
我们之前的工作通过结合文献分析和神经网络建模研究了提取阶段对壳聚糖产量的影响，以及脱矿阶段的实验优化，而当前研究评估了脱蛋白阶段对壳聚糖结构性质的影响，并使用机器学习比较了提取的壳聚糖样品与商业壳聚糖的相似性。从Litopenaeus vannamei虾壳中提取的壳聚糖通过一种依赖于在RT和50 ± 2°C下调整NaOH碱浓度（1、2、3、4、5和10%）的脱蛋白方法进行了优化，同时保持脱矿和脱乙酰化过程在稳定条件下进行。所得到的壳聚糖产品通过灰分含量（%）、水分含量（%）、产量（%）、脱蛋白率（%）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、差示扫描量热（DD%）、X射线衍射（XRD，CI%）和扫描电子显微镜（SEM）等指标进行了表征。此外，研究采用了一种创新的方法，即结合机器学习中的随机森林回归模型以及残差图、ROC曲线、热图和混淆矩阵等高级可视化技术，来评估通过脱蛋白方法获得的壳聚糖样品与商用壳聚糖（作为参考材料）之间的物理化学和结构特性相似性。本研究的结果证实，这些壳聚糖样品经历了部分到完全的脱乙酰化过程，其差示扫描量热（DD）值范围为98.84 ± 0.1%至99.27 ± 0.004%。提取的壳聚糖样品灰分含量范围为2.43 ± 0.042%至0.74 ± 0.05%，表明脱矿步骤非常有效；水分含量范围为0.1 ± 0.02%至0.44 ± 0.01%。壳聚糖的产量和脱蛋白率分别为7.8 ± 0.85%至24.1 ± 0.03%和93.39 ± 0.083%至97.0 ± 0.31%。虽然在脱蛋白过程中增加NaOH浓度和温度可以提高脱蛋白效率，但会降低壳聚糖的产率。进一步的多态性和形态学分析（XRD和SEM）显示，商用壳聚糖主要为非晶结构，而室温下提取的壳聚糖样品（S1–S10）的结晶度指数（4.48–10.5%）高于50 ± 2 °C下提取的样品（0.37–5.27%），后者的非晶结构更明显且结晶度较低。研究人员还利用确定性相似性框架和基于探索性机器学习的相似性模型，根据灰分含量、水分含量、官能团振动和结晶度指数等多个特征来评估分离得到的壳聚糖样品与商用壳聚糖的相似性。研究结果明确了这些壳聚糖样品的特性及其与参考商用壳聚糖之间的差异。其中，Ch3和Ch4样品的相似性得分较高，表明它们在物理化学和结构性质上与商用壳聚糖相似，甚至可能更优。研究表明，脱蛋白方法能够有效分离出具有良好化学性质的壳聚糖产品，特别适用于需要高度脱乙酰化的应用场景。这类壳聚糖样品可用于抗菌剂、农业生物刺激剂和吸附剂等领域，因为其较高的差示扫描量热值可以提高其在生物物质和离子物质中的溶解度和反应性。然而，由于大多数样品与商用壳聚糖的相似性有限，因此在确定其工业应用价值之前，仍需进一步评估其分子量、分子量分布、溶解度和功能性能。