通过蜡软光刻技术制备纸基微流控芯片 陈新怡（Xinyi Chen）、 周杰（Jie Zhou）、 钟嘉华（Jiahua Zhong）、 叶子通（Zitong Ye）、 何庆浩（Qinghao He）、 陈浩（Hao Chen） 郭伟进（Weijin Guo）

《Micromachines》：Fabrication of Paper Microfluidic Chips via Wax Soft Lithography Xinyi Chen, Jie Zhou, Jiahua Zhong, Zitong Ye, Qinghao He, Hao Chen and Weijin Guo

　　摘要
基于纸张的微流控装置（μPADs）因其低成本、易用性和对仪器的依赖性最小而受到了在即时检测（POCT）、环境监测和食品安全领域的广泛关注。然而，在纸上制造高分辨率和可重复的微通道仍然具有挑战性。传统的制造方法，如蜡印、光刻和喷墨打印，受到分辨率或设备成本的限制。在这里，我们提出了一种低成本、高分辨率的μPADs制造方法，称为蜡软光刻，该方法结合了蜡印和软光刻技术。通过这种方法，我们能够一致地制造出最小宽度为234 ± 62 μm的微通道，并成功制造出复杂的图案，展示了高精度和可重复性。作为设备功能的概念验证，所制造的μPADs被用于检测加葡萄糖的尿液样本，显示出浓度依赖性的比色响应。这种方法为资源有限的环境中快速生产高分辨率μPADs提供了有效的途径。在实际应用之前进一步验证后，该方法在POCT领域的未来发展显示出潜力。

1. 引言
微流控技术由于其高操作精度、最小样本消耗量和高度集成性，已被广泛应用于即时检测[1,2]、药物开发[3,4,5]和环境监测[6]等领域。在各种微流控平台中，基于纸张的微流控装置（μPADs）因其超低成本、简单的制造工艺以及依靠毛细作用实现无泵流体传输的能力而特别受到关注[7,8]。近年来，已经开发了许多用于即时检测（POCT）的μPADs应用。纸张通常由天然纤维素或硝化纤维素纤维交织而成，含有丰富的微米级孔隙[9]。当纸张与水接触时，液体会在表面张力和固液界面相互作用的作用下自发地通过孔隙结构渗透[10]。疏水剂——如蜡[9]或聚二甲基硅氧烷（PDMS）[11]——被用来形成明确的疏水屏障，以限制液体的渗透。通过精确设计这些疏水图案的几何形状和空间排列，可以有效地调节水在μPADs上的流动路径和渗透速度[12]。
在纸张基底上实现精确且可重复的微流控通道制造仍然是一个重大挑战[13]。传统的μPADs制造方法，如蜡印，是通过将蜡沉积在纸上并使其熔化以渗透到多孔基质中来形成疏水图案的[14,15]。Tenda等人展示了蜡印可以达到相当高的分辨率，他们在纸上制造出了228 ± 30 μm的微流控通道[16]。然而，蜡印设备的逐渐停产对许多研究人员来说是一个问题[16,17]。光刻技术可以通过在紫外（UV）光照射下诱导光敏材料的交联反应，在滤纸上制造最小宽度为90 μm的高分辨率图案化微流控通道[18]。然而，这种方法需要昂贵的设备、专用光刻胶和复杂的处理程序，使其不适合低成本和大规模生产[19,20,21]。喷墨打印则通过喷墨打印机将功能液体（如疏水剂或溶剂）精确地沉积在纸上，以创建亲水或疏水图案。尽管如此，这个过程通常需要多次打印，这可能导致分辨率降低[22,23]。
为了解决这些问题，本研究提出了一种创新且低成本的μPADs制造方法，即蜡软光刻，它结合了蜡印和软光刻技术。软光刻已成为最广泛使用的微流控芯片制造技术之一，因为它具有高图案保真度和操作简便性，依赖于弹性材料来复制和转移微尺度结构[24]。其中，PDMS因其优异的生物相容性、气体渗透性和光学透明度而成为软光刻过程的主要材料[25]。Su等人使用激光切割制备PDMS的模板，并将PDMS芯片与玻璃基底密封，在冷却后蜡会附着在玻璃表面，然后转移到纸上[26]。他们的方法实现了最小约654 μm的通道宽度。在本研究中，首先使用光刻技术制造了母模，然后通过PDMS复制成型来制造芯片，并用PDMS薄膜密封，以在冷却后保持熔融蜡在微通道内。通过使用蜡软光刻在纸上制造不同宽度的通道，系统地评估了可实现的最小微通道宽度。此外，还在纸上制造了多种图案形状。所得的微通道成功用于检测尿液样本中不同浓度的葡萄糖，证明了蜡软光刻方法的可靠性和应用潜力。

2. 材料与方法
从抚顺晨月昌新材料产品（中国抚顺）购买了石蜡（半精炼级58号，熔点58°C，油含量<2%，符合GB/T 254-2022标准[27]）。纤维素纸（Whatman 1，厚度：180 μm）由Cytiva（瑞典乌普萨拉）提供。聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184）从Dow Corning（美国密歇根州米德兰）购买。紫色食用染料来自Fleur Couleur（中国连云港）。硅片来自顺生电子科技有限公司（中国杭州）。光刻胶（SU-8 2100）购自苏州伊兰微电子有限公司（中国苏州）。金属块从东莞常平宏新五金制品有限公司（中国东莞）购买。葡萄糖从希龙科学（中国汕头）购买。葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。3,3’-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒来自Biosharp（中国合肥）。尿液样本来自健康志愿者，并添加了不同浓度的葡萄糖用于实验。
为了使用软光刻制造嵌入蜡的PDMS芯片，首先使用CAD软件（AutoCAD 2025）设计微流控通道的图案。然后打印光掩模，并通过光刻技术制造相应的模具。在这些过程中，设计的图案直接转移到光掩模上，再转移到SU-8母模上。因此，PDMS模具的尺寸与设计尺寸基本相同，因为使用PDMS的软光刻复制能够高保真地再现母模的特征，且收缩几乎可以忽略不计。如图1所示，PDMS（基础聚合物与固化剂的比例为14:1）通过软光刻浇铸到模具上，以复制微通道结构。较高的基础聚合物含量提供了更柔性的质地，从而生产的PDMS更适合蜡的图案转移[28,29]。14:1的比例（基础聚合物与固化剂）比传统的10:1配方生产的PDMS更具柔韧性。在热转移步骤中，这种增加的柔韧性使PDMS芯片能够更好地适应Whatman No. 1纸张表面的微观粗糙度和纤维纹理。改进的贴合接触确保了蜡在熔化后能够沿着预定的图案边界均匀地从PDMS微通道中排出到纸张上，最小化了侧向泄漏并保持了分辨率。相反，较硬的PDMS（例如10:1）会在表面不规则处形成桥接，导致熔融蜡在设计的通道边缘之外不可预测地扩散。较软的PDMS（例如20:1）可能在蜡填充和热转移步骤中损害微通道结构的完整性。因此，14:1的比例在保持与纸张表面的充分贴合的同时，保持了结构完整性，防止了引入和固化蜡时的通道塌陷。在PDMS芯片的两侧预先打孔以形成入口和出口孔。在粘合之前，使用Harrick等离子清洗器（PDC-002，Harrick Plasma，美国伊萨卡）以30 W的射频功率对PDMS芯片进行60秒的亲水处理。亲水处理后，在微通道一侧放置PDMS薄膜以形成封闭的通道。然后将熔融石蜡通过其中一个预打的孔引入封闭的通道中，使熔融蜡在压力驱动和毛细流动下在整个微通道中传播。一旦通道完全填满，让设备冷却，使蜡在封闭结构内固化。最后，轻轻剥离PDMS薄膜，得到嵌入微流控通道中的PDMS芯片。

3. 结果与讨论
我们使用CAD设计了一个径向多通道微流控结构，以研究可实现的最小通道宽度。该结构由七个从中心圆向外辐射的矩形微通道组成，设计宽度分别为1200 μm、1300 μm、1400 μm、1500 μm、1600 μm、1700 μm和1800 μm。该结构通过光刻技术转移到硅片上，随后将PDMS浇铸到硅模具上，制造出通道宽度为200 μm、高度为84 μm的PDMS芯片。然后向PDMS芯片的通道中填充蜡，得到嵌入蜡的PDMS芯片。最后，通过热转移将图案转移到厚度为180 μm的纸上，从而在纸上制造出通道。接着向通道中引入水，以评估亲水区和疏水区之间的界面特性。使用相机（Canon EOS RP，日本东京）捕捉图像，并使用ImageJ Version 1.54s（https://imagej.net/ij/）测量亲水通道的实际宽度。图3显示了与设计通道宽度相对应的打印通道宽度。如条形图所示，随着设计宽度的从1800微米减小到1400微米，印刷通道的宽度呈现出明显的下降趋势。对于1400微米的设计宽度，可实现的亲水通道最小宽度为234 ± 62微米，这表明其分辨率和图案精度高于Su等人[26]的工作（详细比较见补充信息中的表S1）。在所有测量条件中，1400微米的设计产生了最小的平均印刷通道宽度（234微米），但相对变异性最大（26%的CV）。这种变异性水平高于几种代表性的μPAD制造方法所报告的。例如，Dungchai等人使用蜡丝网印刷技术实现了最小650 ± 71微米的亲水通道宽度（11%的CV）[30]，而Su等人报告的宽度为654 ± 75微米（12%的CV）[26]。Carrilho等人使用商用打印机进一步实现了561 ± 45微米（8%的CV）[15]。这种增加的变异性归因于该设计接近Whatman No. 1纸上蜡软光刻方法的实际分辨率极限。在如此狭窄的通道宽度下，纸张纤维方向的微小变化、局部孔隙率、蜡渗透均匀性的差异以及热转移过程中PDMS-纸张接触压力的轻微不一致性都可能导致最终亲水通道宽度的比例更大波动。相比之下，较宽的通道（≥1500微米的设计宽度）对这些因素的容忍度更高，从而产生较小的相对误差。这一观察结果强调了在制造极限附近分辨率与重复性之间的权衡。然而，当尝试制造设计宽度为1300微米和1200微米的通道时，所得结构过于狭窄，无法支持水流通过，因此无法量化印刷通道的宽度。可实现的最小通道宽度可能受到热转移过程中蜡扩散与纤维素纸（Whatman No. 1）固有孔径和纤维分布之间平衡的限制。在设计宽度低于某个值时，相邻疏水区域的蜡可能会合并，或者亲水通道可能变得过于狭窄，无法保持连续的吸水路径。与Su等人和Tenda等人（通过蜡印刷得到228 ± 30微米的通道）[16,26]相比，我们的方法实现了与高端蜡印刷相当的分辨率，但所需的设备更简单，且不需要专用的蜡打印机。234微米的分辨率对于许多即时检测应用来说是足够的，正如我们后续的葡萄糖检测实验所证明的。与基于激光切割的方法（Su等人[26]）相比，分辨率的提高主要源于使用了光刻定义的SU-8母模。光刻技术能够产生垂直的侧壁、低表面粗糙度和精确的关键尺寸，这些特征能够忠实地复制到PDMS模具中。在热转移过程中，这些锋利的模具特征限制了熔融蜡的横向扩散。相比之下，激光切割的母模具有由切割边缘引起的粗糙度和锥形侧壁，导致蜡分布不均匀和分辨率降低。图3显示了设计宽度分别为1800微米、1700微米、1600微米、1500微米和1400微米的印刷通道宽度。左侧插图展示了径向多通道结构的CAD布局，右侧插图显示了使用蜡软光刻技术在纸上印刷的图案。每个实验重复三次。我们还使用CAD设计了各种图案，并通过蜡软光刻技术在纸上制造了相应的蜡图案。图4展示了不同设计得到的图案结构。图4a显示了汕头大学标志性的“大人物-小人物”雕塑的轮廓。图4b显示了基于汕头大学标志中的火焰树设计的图案。将紫色染料溶液引入图案区域后，形状清晰可见，没有染料泄漏，表明蜡边界有效地限制了液体并起到了可靠的疏水屏障作用。图4. 使用蜡软光刻技术在纸上制造图案。(a) 复制汕头大学“大人物-小人物”雕塑的蜡图案。(b) 基于汕头大学标志中火焰树设计的蜡图案。标志中的两个汉字是汕头大学的中文缩写。作为在即时检测中使用此类μPADs的概念验证，我们利用制造的火焰树图案来检测加标尿样中的葡萄糖。如图5a所示，我们首先向中心添加了20微升含有辣根过氧化物酶（HRP）、葡萄糖氧化酶（GOx）和3,3’-二氨基联苯胺（DAB）的混合溶液，使其填充微通道并干燥。然后向指定的检测区域加入不同葡萄糖浓度的尿样，并让它们反应10分钟后再拍照。我们使用ImageJ中的RGB到CMYK转换功能提取了M通道的值进行定量分析。如图5b所示，M通道的颜色强度随葡萄糖浓度的增加而增加。μPADs的初步结果显示出一致的趋势和可接受的重复性，表明其具有进一步开发成定量生物传感器的潜力。正常尿液的葡萄糖浓度通常低于1.8 mM，而糖尿病患者的尿糖浓度常常超过2.8 mM。我们测试的范围（0–32 mM）涵盖了这一临床相关区间，并且在这个范围内M通道强度呈单调增加，表明其在糖尿病筛查和监测方面的潜在应用价值。需要注意的是，这项葡萄糖实验仅作为制造μPADs功能性的概念验证，并非完全经过验证的分析方法。全面的性能指标（例如，具有R2的校准曲线、LOD、LOQ、对常见干扰物的选择性以及加标回收率）对于临床转化非常重要，需要在未来实际应用前进行进一步验证。图5. 使用蜡软光刻技术制造的μPADs在尿液中检测葡萄糖。(a) 检测程序示意图：向中心添加20微升免疫试剂（GOx、HRP和DAB混合物）干燥后，向指定区域加入不同葡萄糖浓度的加标尿样。(b) 不同葡萄糖浓度尿样的检测结果，包括原始图像、从CMYK颜色空间提取的M通道图像以及基于M通道强度的条形图。每个实验重复三次。尽管制造母模需要光刻设备和材料（例如SU-8、硅片），这会产生一定的前期成本，但随后的蜡软光刻工艺允许低成本、高分辨率地生产每个μPAD，尤其是在从单个PDMS模具复制时。没有光刻设备的研究人员也可以通过合作或商业服务获得现成的母模。4. 结论总之，我们开发了一种将蜡印刷与软光刻结合的新型μPADs制造方法，称为蜡软光刻。我们系统地评估了可实现的最小通道宽度，证明该方法可以生产出分辨率高达234 ± 62微米的微通道。我们还成功展示了该方法快速构建复杂形状图案的能力。作为概念验证，我们使用μPADs检测了不同浓度尿样中的葡萄糖，确认了它们的稳定性和可靠性。这种方法大大降低了在资源有限条件下生产高精度μPADs的障碍，并显示出在未来发展为POCT应用的强大潜力，有待进行全面分析验证。补充材料以下支持信息可在以下网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/mi17050512/s1，表S1：我们与Su等人工作的区别；表S2：不同蜡图案化方法在纸质设备上的比较；图S1：微通道宽度的测量；图S2：7个通道中水毛细流动的时间-距离曲线；图S3：不同葡萄糖浓度（0, 8, 16, 24, 32 mM）下M强度的统计分析。T检验用于评估相邻浓度组之间的统计显著性。星号表示显著性水平：***p < 0.001。每个实验重复三次；图S4：蜡浸渍的Whatman No. 1滤纸的横截面SEM表征：(a) 纸张横截面的概览。(b) 未浸蜡区域显示原始多孔结构。(c) 完全浸蜡区域。