《Analytica Chimica Acta》：A Highly Sensitive Detection Platform for Scrub Typhus Using Multi-Fluorescence Nucleic Acid Probes and STORM Imaging
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陈天宇|杨舒|张宇|张晓玲|熊婷|郭梦珠|李慧|郝贤公共卫生学院与江西省疾病预防与公共卫生重点实验室，江西医学院，南昌大学，南昌，江西，330031，中国摘要背景核酸检测（NAT）对于病原体鉴定、疾病诊断和生物医学研究至关重要。传统的基于扩增的方法虽然被广泛使用，但常常面临处理时
陈天宇|杨舒|张宇|张晓玲|熊婷|郭梦珠|李慧|郝贤
公共卫生学院与江西省疾病预防与公共卫生重点实验室，江西医学院，南昌大学，南昌，江西，330031，中国
摘要
背景
核酸检测（NAT）对于病原体鉴定、疾病诊断和生物医学研究至关重要。传统的基于扩增的方法虽然被广泛使用，但常常面临处理时间长和易产生假阳性结果的挑战。此外，单分子检测方法受到信号强度弱和快速光漂白的限制。为了解决这些限制，我们提出了一种无需扩增的生物传感平台，能够高灵敏度和特异性地检测Orientia tsutsugamushi的DNA。
结果
该平台采用通过点击化学合成的多荧光团核酸探针，显著增强了信号强度和光稳定性。具体来说，将5-乙炔基-dUTP（5-EdUTP）引入PCR扩增产物中，使其能够与Cy5荧光团结合。随机光学重建显微镜（STORM）被用作读出方法，实现了对数万个单分子事件的定位和定量，从而实现了显著的信号放大。该检测方法的检测限为2.74 aM（相当于10 μL系统中的27.4 yoctomoles），具有优异的特异性。通过对11个样本的临床验证，显示出100%的灵敏度和特异性。
意义
这种方法提供了一种简单、快速且可靠的单分子检测解决方案，为检测低丰度生物标志物提供了宝贵的工具，并在早期疾病诊断中展现出巨大潜力。
引言
核酸检测（NAT）对于病原体鉴定、疾病诊断和生物医学研究至关重要[1]。准确检测和量化核酸对于临床诊断至关重要，应用范围从传染病检测到癌症生物标志物的识别[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。然而，尽管传统基于扩增的方法被广泛采用，但仍存在固有挑战[7]，包括处理时间长、需要昂贵的仪器以及容易产生扩增错误，这可能导致假阳性或假阴性结果[8]、[9]、[10]、[11]。此外，无扩增检测策略的发展受到信号强度弱和快速光漂白等挑战的阻碍[12]、[13]，影响了单分子检测的灵敏度和可靠性。
最近发展的单分子检测技术通过允许以极高的灵敏度和特异性观察单个分子行为，彻底改变了分析科学[14]。这些进步使得单分子荧光和纳米孔传感等技术受到了关注[15]、[16]、[17]、[18]。其中，单分子荧光因其能够捕获单个光子事件而在单分子水平上展现出巨大潜力[19]。然而，实际应用中存在的快速光漂白和信号强度低等挑战仍然是限制其实时或高通量应用的主要障碍[20]、[21]。此外，如通过平衡泊松采样（SiMREPS）进行单分子识别的方法需要复杂的数据处理，降低了其在快速和广泛诊断应用中的适用性[22]。
为了克服这些限制，我们提出了一种新型的无扩增生物传感平台，旨在实现高灵敏度和特异性的Orientia tsutsugamushi（O. tsutsugamushi）DNA检测。O. tsutsugamushi是恙虫病的致病因子，每年在流行地区报告的病例超过一百万例[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。我们的方法通过使用通过点击化学合成的多荧光团核酸探针，解决了信号弱和光漂白的关键问题[28]、[29]。具体来说，我们将5-乙炔基-dUTP（5-EdUTP）引入PCR扩增产物中，使其能够与Cy5荧光团结合。这种改进显著增强了信号强度并减少了光漂白，提供了一种更可靠和稳健的检测方法。除了信号增强外，我们的平台还使用随机光学重建显微镜（STORM）作为读出方法，实现了对数万个单分子事件的定位和定量。该技术显著放大了信号，并提供了高分辨率的实时检测，无需扩增[30]、[31]、[32]、[33]。该平台的检测限达到了2.74 aM（相当于10 μL系统中的27.4 yoctomoles），具有优异的特异性和灵敏度。通过对11个样本的临床验证，进一步证实了100%的灵敏度和特异性，展示了该平台在临床诊断中的潜力。这种无扩增检测平台提供了一种简单、快速且可靠的单分子检测解决方案。其高灵敏度、特异性和简便性使其成为检测低丰度生物标志物的宝贵工具。由于其在早期疾病诊断中的潜在应用，这种方法代表了克服传统NAT方法局限性的重大进步，并为临床和生物技术应用带来了巨大希望。
部分摘录
多荧光团标记核酸探针的合成
准备了100 μL的PCR混合物，其中包含10 μL的10× PCR缓冲液、0.2 μL的dATP、dGTP和dCTP（各100 mM）、0.2 μL的5-EdUTP（100 mM）、1 μL的正向和反向引物（各200 μM）、0.2 μL的模板DNA（0.1 ng/μL）以及1 μL的Taq DNA聚合酶（5 U/μL）。加入无核酸酶的水将最终体积调整至100 μL。扩增条件如下：初始变性95°C 5分钟；40个循环，每个循环包括95°C 30秒、55°C 30秒和72°C 15秒
单分子传感平台的原理
使用O. tsutsugamushi的47-kDa基因中的一个50 bp保守序列作为检测目标（表S1和S2）。该平台包括三个连续阶段：（i）多荧光团核酸探针的合成，（ii）目标诱导的链置换，以及（iii）STORM成像。在第一阶段，通过在PCR扩增过程中用5-EdUTP替代dTTP来合成探针。所得扩增产物随后用λ外切酶进行消化
结论
在这项研究中，我们开发了一种新型的无扩增DNA检测平台，结合了多荧光团核酸探针和STORM技术，实现了对O. tsutsugamushi DNA的高灵敏度和特异性检测。该平台消除了对目标扩增的需求，而是在输入阶段通过多个荧光团标记的探针实现信号放大，在输出阶段通过STORM实现高灵敏度检测。这种方法克服了
CRediT作者贡献声明
郝贤：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。杨舒：方法学、正式分析。陈天宇：撰写——初稿、方法学、研究、数据管理、概念构思。张晓玲：研究、正式分析、数据管理。张宇：研究、正式分析、数据管理。熊婷：研究、数据管理。李慧：撰写——审稿与编辑、资源获取、概念构思。郭梦珠：
数据可用性
支持本文的数据已作为补充信息（SI）的一部分提供。补充信息包括：本研究中使用的寡核苷酸、O. tsutsugamushi的47-kDa基因、目标的选择与确定、链置换反应温度的优化、特异性评估、本研究中使用的非目标序列以及O. tsutsugamushi检测技术的比较分析。参考文献[32]、[33]、[34]、[35]、[36]在SI中引用。
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：22277047和82160631）和江西省自然科学基金（编号：20252BAC250153）的支持。
