通过代谢工程改造大肠杆菌以高效生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸

《Biochemical Engineering Journal》：Metabolic Engineering of Escherichia coli for Efficient Production of O-Succinyl-L-Homoserine

　　

刘龙梅|顾洁云|刘晓梅|顾家莉|刘青海|马玉书|陶新怡|刘敏|魏东志

中国华东科技大学新世界生物技术研究所生物反应器工程国家重点实验室，上海，200237

摘要

大肠杆菌（Escherichia coli）的鞭毛系统具有三层转录网络，用于调控鞭毛合成的时间进程。本研究利用鞭毛系统的操纵子元件构建了一个自诱导系统，以平衡细胞生长和O-琥珀酰-L-高丝氨酸（OSH）的产量。最初产生OSH的菌株是通过调节L-苏氨酸代谢途径实现的，使用的是来自大肠杆菌MG1655的自我调控启动子P_fliC，并阻断了下游的降解途径。随后，解除了对关键酶的负反馈抑制，接着修改了葡萄糖摄取系统，增强了前体物质、辅酶和ATP的供应。最后，系统地筛选了鞭毛系统的自我调控启动子，发现P_fliF是最优启动子，它使OSH的产量从85.1 g/L提高到了138.1 g/L，在5 L的发酵罐中，产率和生产力分别为0.54 g/g和1.44 g/L/h，这是迄今为止报道的最高产量。这项工作为工业生产OSH提供了宝贵的见解。

引言

近年来，由于石化工业造成的严重环境问题，利用可再生资源可持续生产有价值化学品的生物制造技术受到了越来越多的关注[1]。基于生物的O-琥珀酰-L-高丝氨酸（OSH）可以通过化学转化生成C4化学品，如琥珀酸、异丁醇和1,4-丁二醇，这些化学品在塑料、纤维和制药领域具有广泛的应用[2]。在大多数生物系统中，O-乙酰-L-高丝氨酸（OAH）是含硫化合物（例如L-甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸）生物合成的关键前体。然而，在大肠杆菌及其密切相关的肠杆菌中，OSH扮演了这一角色，而不是OAH。此外，OSH还可以通过高产的酶促转化与甲硫醇（methanethiol）结合，用于工业生产L-甲硫氨酸[3]。L-甲硫氨酸是一种必需氨基酸，在食品、饲料添加剂和制药行业中应用广泛，全球年市场规模超过160万吨。因此，由于市场需求的增长和应用领域的拓展，OSH作为一种有前景的平台化学品而备受关注。

大肠杆菌（Escherichia coli）是一种重要的工业微生物，已被用于生产L-天冬氨酸家族的氨基酸，如L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸[4]，这凸显了OSH生产的潜力。在OSH的生物合成途径中，L-天冬氨酸首先被天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）磷酸化，然后被天冬氨酸半醛脱氢酶（aspartate semialdehyde dehydrogenase，ASD）脱氧形成L-天冬氨酸半醛。随后，L-天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶（homoserine dehydrogenase，HD）的作用下生成L-高丝氨酸。最后，高丝氨酸琥珀酰转移酶（homoserine succinyltransferase，MetA）催化L-高丝氨酸和琥珀酰辅酶A（succinyl-CoA）合成OSH。然而，MetA作为微生物中OSH和L-甲硫氨酸生物合成的关键酶，受到多层次的严格调控。例如，在大肠杆菌中，MetA的表达受到转录调节因子MetJ的强烈抑制[5]，同时SAM和L-甲硫氨酸也会抑制MetA的活性，这显著限制了OSH的合成。因此，开发高效的MetA对于大肠杆菌中的OSH生产至关重要。

鉴于OSH在工业上的重要应用，人们投入了大量努力来改造微生物以高效合成OSH。郑等人通过删除负调控因子和下游产物转运蛋白，激活半胱硫氨酸γ-合成酶（cystathionine γ-synthase），过表达双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶II和L-甲硫氨酸输出蛋白，并通过关键酶工程减弱反馈抑制，构建了一个工程化的大肠杆菌MG1655菌株[6]。最终，在5 L的生物反应器中进行批次发酵，通过优化培养基策略，实现了121.7 g/L的OSH产量[7]。然而，这些代谢工程策略仍存在局限性。例如，由于营养缺陷（auxotrophy），发酵过程中需要外源补充L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-甲硫氨酸，这可能会增加生产成本和工艺复杂性。此外，构建用于目标产物合成的微生物细胞工厂的一个关键挑战是平衡细胞生长和由产物过度积累引起的代谢负担。因此，通过调节细胞生长与产物生产之间的平衡来设计高效的微生物细胞工厂对于OSH生产具有重要意义。

大肠杆菌是一种典型的周生鞭毛细菌，其鞭毛由三个结构保守的亚结构组成，即基体（basal body）、鞭毛丝（filament）和连接它们的钩状结构（hook）。整个鞭毛系统包含多达25种结构蛋白。在大肠杆菌基因组中，与鞭毛结构蛋白相关的数十个调控基因形成了一个三层转录调控网络[8]。鞭毛的级联调控确保了对鞭毛组分合成和组装的严格时间控制。根据表达时机，控制鞭毛合成的操纵子被分为I类、II类和III类操纵子[9]。群体感应系统和其他调控因素的研究表明，大肠杆菌中的鞭毛生物合成遵循细胞密度依赖的模式[10]、[11]。鞭毛系统中的启动子随着细胞密度的增加而依次上调，在指数生长阶段保持活性，在稳定生长阶段被抑制。因此，利用大肠杆菌的三层调控网络并抑制竞争性途径，有可能实现细胞生长与产物生产之间的动态平衡。

在本研究中，首先通过删除降解途径，使用自我调控启动子fliC调节L-苏氨酸代谢途径，并过表达metA（编码高丝氨酸琥珀酰转移酶）和不受反馈抑制的thrA，生成了最初的OSH菌株。随后，通过改造甘油酸旁路和葡萄糖摄取系统，促进前体物质的生物合成，并提供辅因子和ATP，修改了OSH的合成途径。最后，筛选了多个鞭毛系统的自我调控启动子，以优化thrABC在竞争性L-苏氨酸途径中的表达，从而平衡细胞生长和OSH的生产，减轻了产物过度积累带来的代谢负担。结合蛋白质工程和代谢工程策略，构建了一个自调控系统，用于动态调节竞争性途径，获得了高产OSH的菌株。

章节片段

细菌菌株、质粒和试剂

本研究中使用的所有细菌菌株和质粒及其相关特性列于表1和表S1中。使用E. coli DH5α进行质粒构建，而使用E. coli MG1655构建用于OSH生产的工程菌株。使用KOD One PCR Master Mix（上海，TOYOBO）扩增供体DNA片段。使用Zymoclean（ZYMO RESEARCH，加利福尼亚）的DNA纯化试剂盒和Mini Plasmid Kit进行DNA制备。所有引物均由

通常，破坏降解途径、消除竞争性途径和增强代谢通量是生产目标氨基酸的有效策略。为了构建基本的OSH生产菌株，阻断了下游降解基因metB（编码O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶）。metB和metL（编码天冬氨酸激酶II）基因位于同一个操纵子上。使用CRISPR-Cas9技术在的起始密码子前插入了P_trc启动子和RBS序列

结论

总之，通过阻断降解途径、增强甘油酸旁路、修改PTS系统、增加前体物质、辅酶和能量供应，并优化鞭毛系统的自我调控启动子来动态调节竞争性途径，构建了一个高效的大肠杆菌底盘，用于从葡萄糖生产OSH。该集成策略实现了细胞生长与产物合成之间的动态平衡。工程菌株LLM22-a在

本研究不涉及任何人类参与者或动物的实验。

顾家莉：资源提供。马玉书：概念设计。魏东志：资金获取。刘青海：概念设计。顾洁云：实验研究。陶新怡：实验研究、资金获取、概念设计。刘敏：资金获取、概念设计。刘龙梅：写作——审稿与编辑、原始稿撰写、方法学设计、实验研究。刘晓梅：资源提供。

我们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究

本研究得到了上海市科技发展基金（编号24HC2810400）、上海市自然科学基金（编号21ZR1417200）以及生物反应器工程国家重点实验室开放资助项目的支持。

未声明其他利益冲突。