《Cytotherapy》：Transient HA-100 exposure improves aggregate uniformity and cell-cell contact stability in suspension human pluripotent stem cell cultures
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为解决hPSC悬浮培养中聚集体形成不均一、批次差异影响下游分化等问题，本研究评估了短时暴露于PKA/PKC抑制剂HA-100对hPSC多株系的影响。结果发现，HA-100可促进hPSC形成更致密、尺寸分布更窄的聚集体，增强细胞间连接韧性，且不影响多能性标志物表达与三胚层分化能力。这为面向生产流程的hPSC悬浮培养提供了实用、可重复的上游干预策略。
在再生医学、疾病模型构建和细胞治疗等前沿领域，人类多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSC）因其可分化形成三个胚层所有类型细胞的潜力，已成为一个重要的基础平台。然而，其实用化部署却常常受到细胞系间、传代间和分化批次间显著变异性的限制。尤其在面向规模化生产的流程中，这种变异性尤为棘手，因为上游工序的微小不一致会沿着下游的谱系定向、扩增和产品表征等环节不断放大。其中，hPSC培养流程中广泛采用的悬浮聚集体形成（悬浮培养）步骤，是早期过程变异性的一个重要来源。聚集体的大小和形态影响着营养扩散、细胞间信号传导和谱系分化偏好。尽管已有微流控系统、分隔化装置和微孔板平台等工程解决方案来改善聚集体均一性，但在这些系统中，聚集体大小仍对细胞系特异性行为和培养条件敏感，这在生产环境中持续挑战着工艺的可重复性。
一种改进悬浮培养性能的实用方法，可能是在聚集体形成的最初阶段短暂地稳定细胞间粘附。紧密连接（tight junction）和粘附连接（adherens junction）是hPSC克隆和聚集体完整性的核心，而连接蛋白1（tight junction protein 1, TJP1，也常称为ZO-1）是其中的关键支架分子。HA-100是一种可作用于蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）和蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）信号通路的小分子抑制剂，这两种通路已知可影响连接组织与细胞间接触的稳态。为了验证这一思路，Preeti Khurana及其同事在《Cytotherapy》上发表研究，评估了短时暴露于HA-100是否能改善多株hPSC的聚集体均一性，同时保持其多能性和发育能力，并深入探究了其细胞学基础。
为开展研究，研究人员采用了9株hPSC（包括人胚胎干细胞和诱导多能干细胞）进行悬浮培养测试。他们构建了一个mCherry-TJP1报告hESC细胞系，用于在活细胞中实时观察连接动态。通过使用钙螯合剂EDTA制造功能挑战，并结合跨上皮电阻（trans-epithelial electrical resistance, TEER）测量，来评估HA-100对细胞连接韧性的影响。最后，研究人员检测了经HA-100处理后的细胞是否仍保留多能性标志物表达和三胚层分化能力。
研究结果揭示了以下几个关键发现：
1. 瞬态HA-100暴露改善hPSC聚集体形态并缩小不同细胞系间的变异性
研究发现，在悬浮培养的最初24小时暴露于HA-100，能使hPSC聚集体变得更致密、更接近球形，并增加了聚集体的大小。重要的是，相较于仅用培养基的对照组，HA-100处理显著降低了9个不同hPSC细胞系间的聚集体尺寸变异性。经过HA-100处理的聚集体在24小时悬浮培养后，其体积落在25.37–33.95 × 10-4mm3这一经验性定义的范围内，这为工艺监控提供了一个实用的基准。
2. 经验性的尺寸基准可为HA-100处理后的聚集体定义
通过对多个细胞系的数据分析，研究团队提出了一个针对HA-100处理聚集体、跨多细胞系适用的尺寸参考范围，旨在帮助标准化上游工艺。
3. 构建并验证mCherry-TJP1报告hESC细胞系
研究人员通过CRISPR/Cas9介导的同源定向修复，在内源性TJP1基因位点敲入了mCherry报告基因，成功构建了能实时显示TJP1连接蛋白动态的hESC报告细胞系。该细胞系保持多能性，并具备分化为三个胚层的能力，验证了其作为连接动态实时分析工具的有效性。
4. HA-100在钙耗竭期间稳定细胞间连接并加速其恢复
利用钙螯合剂EDTA耗竭钙离子以挑战细胞连接稳定性的实验表明，HA-100的处理能够延缓细胞间连接因EDTA引起的破坏。TEER测量结果支持了这一发现：在EDTA处理后，添加HA-100的单层细胞其TEER值下降幅度更小，并且恢复到基线水平所需的时间（12小时）也比未加HA-100的对照组（24小时）更短。这表明HA-100增强了细胞间连接的韧性和恢复能力。
5. 短暂的HA-100暴露不会消除三胚层分化能力
研究人员将两组iPSC细胞系在有无HA-100的条件下形成的聚集体，分别向三个胚层（内胚层、中胚层、外胚层）进行定向分化。结果显示，短时暴露于HA-100并未影响细胞分化为三个胚层的能力，表明该处理是兼容下游分化应用的，不会引入谱系偏好性或损害细胞的发育潜力。
研究结论与讨论部分对以上发现进行了整合与升华。本研究发现，短时暴露于HA-100是一种实用的上游干预手段，能够改善悬浮hPSC培养中聚集体形成的均一性。其意义不仅在于聚集体绝对尺寸的增加，更在于降低了早期工艺的异质性，这对于对聚集体大小敏感的hPSC工作流程至关重要。该效应具有跨细胞系的适用性，并通过mCherry-TJP1报告系统和TEER实验证明，其宏观改善伴随着细胞间连接韧性的增强。这支持了HA-100是通过稳定聚集体形成初期所需的细胞间粘附相互作用来发挥作用的机制。从生产角度来看，经验定义的24小时聚集体尺寸范围可作为一个实用的过程内监控基准，帮助采用相同干预措施的工作流程标准化聚集体形成的初始阶段。mCherry-TJP1报告系统的应用，使研究人员能够直接观察活细胞条件下的连接动态，证实了HA-100在减轻连接破坏和加速其恢复方面的作用。至关重要的是，这种干预并未影响hPSC的多能性标志物表达和三胚层分化能力，使其成为一种不引入额外谱系偏差的上游工艺辅助手段。尽管研究存在未在封闭系统生物反应器或GMP条件下测试、以及经验尺寸范围在不同平台间的可移植性待验证等局限性，但它提供了一个稳健的原理性证明和一个实用的工艺开发框架。总之，在hPSC早期悬浮培养中，短时暴露于HA-100为提高聚集体均一性和保护连接完整性提供了一种简单、可扩展的方法，对于早期聚集体可重复性至关重要的生产导向型协议，HA-100是一个值得考虑的候选方案。
