综述：功能性核酸作为下一代LAMP技术的多功能增强剂

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Functional nucleic acids as multifaceted enhancers for next-generation LAMP

　　李新月|林盛浩|王晓宇|刘彦戈|马轩|毛雪飞|徐艳|朱龙娇|徐文涛
中国农业大学营养与健康系精准营养与食品质量重点实验室食品实验室，北京100193

**摘要**
功能性核酸（FNAs）能够增强环介导等温扩增（LAMP）技术，从而用于下一代诊断。本文综述了FNAs在LAMP工作流程中的各个环节：目标富集与特异性锁定、实时监测下的等温扩增、逻辑门控以及催化/电化学信号放大。这些策略依赖于分子识别、催化信号生成、动态切换、结构稳定化和化学修饰。具体而言，适配体介导的磁性捕获和PNA/LNA夹钳技术能够实现目标富集并抑制非特异性扩增。在等温扩增过程中，分子信标通过链置换产生实时荧光信号。对于逻辑门控，基于转录因子的AND门和核糖开关实现了条件信号传导。在催化和电化学放大方面，DNA酶、i-基序和G-四链结构提供了催化转化、pH响应比色法和电化学读数。与功能性材料的结合进一步提升了检测灵敏度和即时检测能力。已验证的应用包括检测食源性病原体、毒素、过敏原和转基因生物（GMOs），以实现快速现场筛查。未来的研究方向将集中在智能化、自动化和便携性上，以适应资源有限和工业环境的需求。

**引言**
近年来，核酸扩增技术取得了显著进展，尤其是环介导等温扩增（LAMP）方法的发展[1]。在现有的等温扩增策略中，如重组酶聚合酶扩增（RPA）、滚环扩增（RCA）、指数等温扩增（EXPAR）、链置换扩增（SDA）、杂交链反应（HCR）和引物交换反应（PER）中，LAMP因其快速扩增动力学和高产物产量而成为最广泛使用的方法之一[1][2][3][4][5][6][7]。与需要温度变化的聚合酶链反应（PCR）不同，LAMP在恒定温度（60-65°C）下通过链置换进行扩增[8]，这使得LAMP在设备要求上更加简化，更适合现场检测[9][10]。LAMP反应包括三个主要阶段：起始、循环扩增和循环利用。在循环扩增阶段，引物与目标序列杂交，DNA聚合酶从3’端延伸，置换现有链并生成新的DNA片段。这一过程不断重复，从而在短时间内实现目标核酸的指数级扩增[9][11]。LAMP反应产物可通过多种方法检测，包括荧光染料、浊度变化或电泳分析[12]。通过实时监测荧光或浊度信号，可以动态观察扩增过程的变化[13]。因此，基于特定设计引物和链置换DNA聚合酶的经典LAMP技术是分子生物学和诊断领域中的基础技术[8]。

**实施挑战**
目前，LAMP技术的应用面临一些关键挑战，涉及从核酸提取和纯化到扩增的关键步骤[14]。尽管LAMP被认为是一种相对简单且低成本的检测方法，但在临床诊断和食品安全应用中仍需特定设备和技术支持[15]。尽管相比PCR具有较高的简单性，LAMP仍需要引物设计和温控设备方面的专业技能，这在资源有限的环境中构成了实施障碍[8]。这些要求应被视为LAMP的基本操作前提，而非可通过后续分子增强策略完全消除的局限。尽管LAMP技术具有优势，但仍需在特异性、低丰度目标检测灵敏度以及多重检测和实时检测方面进行改进[16]。因此，本文重点区分了经典LAMP和下一代LAMP系统的本质技术差异。“下一代”并不指核心扩增原理的变化，而是指通过整合辅助分子组件来提升LAMP平台的功能性能，包括目标识别、反应调控、信号转换和读数输出等方面。

**功能性核酸（FNAs）**
功能性核酸（FNAs）是一类具有特殊结构并执行特定生物功能的核酸分子及其类似物的总称[17]。该领域起源于催化核酸的发现和体外选择技术的发展，逐渐发展为用于生物传感和生物分析的多样化分子工具箱[3][18]。在本综述中，主要FNAs类别包括适配体、DNA酶、结构切换寡核苷酸探针、链置换或基于电路的核酸模块，以及作为多重功能元件的肽核酸（PNA）。FNAs在结构设计上具有优异的灵活性和便利性，使其特别适合用于分子识别和信号报告，可与多种等温扩增技术结合开发先进生物传感器[19]。FNAs与LAMP的结合进一步扩展了LAMP技术的应用范围[20][21]。这些FNAs能够高效选择性地结合特定目标或催化化学反应，从而实现其生物功能[22]。将FNAs引入LAMP检测可提高核酸扩增的灵敏度和特异性，从而更准确地检测低丰度目标。此外，某些FNAs具有类似酶的催化功能，可通过合成技术针对特定目标优化其序列和结构。通过这些改进，LAMP检测的灵敏度和特异性得到提升，为多种疾病诊断和病原体检测开辟了新途径。

**综述结构**
先前的综述文章总结了LAMP方法、基于等温扩增的生物传感器或个别FNAs类别在分析中的应用[1][23][24]，但缺乏系统性的概述，特别是不同FNAs类别如何增强LAMP工作流程各阶段的分析。下表对比分析了FNAs的功能、优势和应用，明确了其在相关领域的操作特性和实际价值[1]。本文首次从功能角度系统总结了FNAs在LAMP中的多种增强机制，不仅阐明了已取得的改进，还指出了LAMP的固有局限及可合理改进的部分。这些策略包括适配体引导的目标富集、DNA酶介导的信号放大以及多重LAMP检测方法的开发。利用FNAs进行多重增强是提升核酸扩增检测性能、拓展其应用范围的有效途径。

**结论**
为了全面理解FNAs-LAMP技术，需探讨其多方面的特性。本文首先分类了关键FNAs（适配体、链置换电路、锁定核酸（LNAs）、肽核酸（PNAs）、DNA酶、G-四链结构、核糖开关和转录因子（TF）编程逻辑门）及其在下一代LAMP中的作用。进一步阐明了FNAs通过哪些机制增强LAMP性能，如图3所示。在下一代LAMP中，FNAs的多维度改进对于快速现场检测至关重要。表2详细分析了工程化FNAs如何提高复杂样本中的灵敏度、特异性和多重检测能力。

**应用展望**
FNAs与功能性材料的结合为信号放大和多重检测提供了新途径。虽然FNAs和功能性材料已广泛用于提升LAMP性能，但它们通常独立集成到系统中。然而，已有研究开始将两者结合在同一检测系统中，显示出协同信号放大的潜力。

**致谢**
本研究得到了国家自然科学基金（32372437）、北京农业科技创新联盟（BAIC01）和中国教育部111项目（编号B18053）的财政支持。