基于免疫印迹技术的含血红素组氨酸激酶活性测定方法

《JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry》：Immunoblot-based activity assay for heme-containing histidine kinases

　　摘要
组氨酸激酶（HKs）是细菌中不可或缺的信号转导蛋白，由于其关键的细胞功能而成为有吸引力的药物靶点。直接测量它们的自磷酸化活性对于开发抑制剂和推进疾病治疗至关重要。虽然[γ-32P]-ATP放射性标记长期以来一直是测量激酶活性的传统方法，但其对32P的依赖性带来了固有的局限性。这种同位素的半衰期较短，对实验的时间敏感性要求较高，而且严格的辐射安全和合规性要求显著增加了运营成本。为了克服这些挑战，已经开发了几种替代方法，包括荧光磷酸结合探针以及基于荧光或发光的抗体。然而，对于含有血红素的HKs来说，这些替代方法容易受到血红素自身发光或凝胶电泳后仍残留在蛋白质上的少量错误金属化的ZnII结合的原卟啉IX的荧光干扰。在这项工作中，我们通过使用近红外（NIR）荧光团标记的二次抗体，并结合基于ATPγS的免疫印迹方法，来检测两种含有血红素的HKs（DosS和GcHK）的配体依赖性硫磷酸化活性。与先前的研究一致，我们的NIR荧光免疫印迹方法显示，GcHK在配体（O2/CO）结合时被激活，而O2传感器DosS在结合O2时被抑制。总体而言，这种易于实施的方法简化并普及了含有血红素的HKs的活性测量。

引言
组氨酸激酶（HKs）是细菌、真菌和植物中普遍存在的信号转导蛋白。它们通过感知和响应微环境的变化，在细胞适应中发挥关键作用[1,2,3]。这些蛋白通常由一个传感器结构域、一个连接结构域、一个二聚化和组氨酸磷酸转移（DHp）结构域以及一个催化/ATP结合（CA）结构域组成。当检测到刺激时，传感器结构域会触发构象变化，这些变化通过连接结构域和DHp结构域传递，进而促进DHp结构域内保守的组氨酸残基的自磷酸化[4]。随后，磷酸基团被转移到响应调节因子上，后者通过直接结合生物体的DNA来调节基因转录（图S1）[5]。鉴于HKs在细菌信号传导和适应中的重要作用，它们成为抗生素发现的有希望的治疗靶点[6]。开发HK抑制剂需要可靠、可获取且可扩展的自磷酸化检测方法。长期以来，使用[γ-32P]-ATP的放射性测量方法一直被认为是自磷酸化检测的金标准（图S2）[7, 8]。然而，32P的半衰期较短，加上辐射安全和合规性挑战以及高昂的试剂和运营成本，促使人们开发了替代方法。因此，包括基于荧光或发光的磷酸组氨酸抗体[9]，以及基于荧光[10]或电泳迁移率变化[11,12,13]的磷酸结合探针等方法应运而生。尽管这些替代方法已经出现，但对于含有血红素的HKs，它们仍然容易受到血红素自身发光或凝胶电泳后残留在蛋白质上的少量错误金属化的ZnII结合的原卟啉IX的荧光干扰。在这项工作中，我们通过使用近红外（NIR）荧光团标记的二次抗体，并结合基于ATPγS的免疫印迹方法，来检测两种含有血红素的HKs的配体依赖性硫磷酸化活性。与先前的研究一致，我们的NIR荧光免疫印迹方法显示，GcHK在配体（O2/CO）结合时被激活，而O2传感器DosS在结合O2时被抑制。总体而言，这种易于实施的方法简化并普及了含有血红素的HKs的活性测量。

方法
DosS的表达
尽管DosS的精确亚细胞定位尚未确定[15, 39]，但多个研究小组[14, 20, 40, 41]已将其从大肠杆菌中重组表达并纯化为可溶性蛋白，且无需使用洗涤剂或两性离子，并验证了纯化蛋白保留了配体状态依赖的激酶活性。基于这些研究，我们在大肠杆菌细胞中重组表达了DosS，并在纯化过程中未使用任何洗涤剂或两性离子。具体操作如下：BL21(DE3)大肠杆菌细胞（ThermoFisher Scientific）被转化含有结核分枝杆菌DosS基因的pET23a(+)质粒（登录号：P9WGK3），该质粒在N端带有6xHis标签和TEV蛋白酶位点（GenScript），以及含有伴侣蛋白GroEL/ES的pACYC-GroEL/ES-TF质粒（Addgene 83923）。转化后的细胞接种在含有100 μg/mL氨苄西林和37 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上。初级培养（100 mL 2XYT培养基，含有100 μg/mL氨苄西林和37 μg/mL氯霉素）从琼脂平板上取一个菌落进行接种。在37 °C下摇床培养过夜，转速为220 rpm。次级培养（1 L 2XYT培养基，含有100 μg/mL氨苄西林和37 μg/mL氯霉素）用25 mL初级培养物接种，并在37 °C下摇床培养，转速为220 rpm。监测细胞密度直到OD600达到0.5–0.7。之后，将摇床条件改为30 °C和170 rpm。向培养物中分别加入5-氨基乙酰丙酸和硫酸亚铁，浓度分别为0.5 mM和0.1 mM。使用0.5 mM异丙基-1-硫-β-D-半乳吡喃糖苷（IPTG，GoldBio）诱导蛋白质表达，持续18小时。细胞通过在4 °C下以2000 rpm离心30分钟（Beckman Coulter）进行收获。我们的DosS表达和纯化方法与先前的研究相似[42, 43]。

HK853的表达
BL21(DE3)大肠杆菌细胞被转化含有HK853胞质部分的pET28a(+)质粒（由明尼苏达大学Carlson实验室提供），该质粒的登录号为Q9WZV7，编码氨基酸234–489，N端带有6xHis标签和凝血酶蛋白酶位点（GenScript）。转化后的细胞接种在含有50 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上。初级培养（100 mL 2XYT培养基，含有50 μg/mL卡那霉素）从琼脂平板上取一个菌落进行接种。在37 °C下摇床培养过夜，转速为220 rpm。次级培养（1 L 2XYT培养基，含有50 μg/mL卡那霉素）用25 mL初级培养物接种，并在37 °C下摇床培养，转速为220 rpm。监测细胞密度直到OD600达到0.5–0.7。之后，将摇床条件改为18 °C和170 rpm。使用0.5 mM IPTG诱导蛋白质表达，持续18小时。细胞通过在4 °C下以2000 rpm离心30分钟（Beckman Coulter）进行收获。

GcHK的表达
BL21(DE3)大肠杆菌细胞被转化含有Anaeromyxobacter sp. Fw 109-5 GcHK基因的pET28a(+)质粒（登录号：A7HD43），该质粒在C端带有6xHis标签（GenScript）。转化后的细胞接种在含有50 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上。初级培养（100 mL 2XYT培养基，含有50 μg/mL卡那霉素）从琼脂平板上取一个菌落进行接种。在37 °C下摇床培养过夜，转速为220 rpm。次级培养（1 L 2XYT培养基，含有50 μg/mL卡那霉素）用25 mL初级培养物接种，并在37 °C下摇床培养，转速为220 rpm。监测细胞密度直到OD600达到0.5–0.7。之后，将摇床条件改为18 °C和170 rpm。使用0.5 mM IPTG诱导蛋白质表达，持续18小时。细胞通过在4 °C下以2000 rpm离心30分钟（Beckman Coulter）进行收获。

DosS、HK853和GcHK的纯化
含有DosS、GcHK或HK853的细胞沉淀物重新悬浮在50 mM Tris（pH 7.5）、250 mM氯化钠和1% Triton X-100中，并在冰上用超声破碎（Fisher Scientific）裂解。粗裂解液在4 °C下以20,000 rpm离心1小时（Beckman Coulter）。仅向GcHK裂解液中加入血红素（30 μM）以制备血红素结合蛋白。上清液通过0.44 μm注射器过滤器（Sartorius）过滤后，以2 mL/min的速度注入5 mL HisTrap FF柱（GE Healthcare）中。柱子用75 mL 50 mM Tris（pH 7.5）、250 mM氯化钠和20 mM咪唑以2 mL/min的速度洗涤。重组蛋白用50 mM Tris（pH 7.5）、250 mM氯化钠和400 mM咪唑洗脱。半纯化的DosS溶液用2.5 mM potassium ferricyanide（III）氧化。通过将蛋白溶液交换到50 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl和5%甘油中，并通过PD-10柱（Cytiva）进行凝胶过滤，去除多余的氧化剂。浓缩的GcHK或DosS溶液通过尺寸排阻色谱（SEC）用HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR柱（GE Healthcare）纯化。HK853通过HiLoad 26/600 Superdex 75 pg柱（GE Healthcare）进一步纯化。蛋白溶液的部分样品在液氮中快速冷冻并储存在-80 °C。

自磷酸化和自硫磷酸化检测
亚铁DosS溶液在厌氧条件下制备（Coy Lab Products），通过亚硫酸钠还原铁DosS，并使用PD-10脱盐柱和10 kDa centricon过滤器去除多余的亚硫酸盐及其氧化产物。亚铁-CO DosS是通过向亚铁蛋白中加入20摩尔当量的CORM-A1（Sigma Aldrich）制备的。亚铁-O2 DosS是通过将亚铁DosS暴露在空气中5分钟制备的。所有DosS的氧化还原和配体状态均通过UV-Vis（Agilent）确认。自磷酸化反应在50 mM Tris（pH 8.0）、50 mM氯化钾、10 mM氯化镁（II）和10%甘油中进行的，转速为300 rpm，温度为20 °C。反应体系中包含5 μM HK853、DosS或GcHK，并通过加入1 mM腺苷三磷酸（ATP；Millipore Sigma）进行自磷酸化检测，或加入腺苷5′-[γ-硫]三磷酸（AGS；Cayman Laboratories）进行自硫磷酸化检测。在指定时间点，取出反应混合物的部分样品，并通过加入100 mM EDTA进行淬灭。淬灭后的自磷酸化反应混合物进行凝胶电泳。在淬灭后的反应混合物中，用3 mM para-nitrobenzyl mesylate（PNBM，Astatech）修饰自硫磷酸化蛋白。修饰反应在300 rpm、20 °C下持续90分钟。

PhosBind SDS-PAGE
制备了含有50 μM PhosBind丙烯酰胺（APExBIO）的10% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶。磷酸化蛋白样品被施加到凝胶上，并使用Tris-甘氨酸运行缓冲液（pH 8.8）进行分离。凝胶用Coomassie染色，并使用Odyssey M成像仪（LI-COR）和700纳米通道进行成像。

自磷酸化样品的Western blot分析：蛋白质通过8% Tris-甘氨酸凝胶和Tris-甘氨酸运行缓冲液（pH 8.8）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，在37°C下干燥30分钟以将蛋白质固定在膜上。

自磷酸化样品的免疫印迹：Western blot的膜用TBS重新水化，并在室温下用Intercept（TBS）无蛋白封闭缓冲液（LI-COR）封闭60分钟，同时进行摇动。一级抗体溶液是通过将兔抗硫磷酸酯抗体（Abcam，ab92570）稀释在Intercept T20（TBS）无蛋白抗体稀释剂中制备的。膜在一级抗体溶液中孵育16小时，温度为4°C，同时进行摇动，然后用含有山羊抗兔IgG Alexa Fluor Plus 800（ThermoFisher Scientific，A32735）的二级抗体溶液孵育60分钟，室温下进行。膜用TBST清洗四次，然后在37°C下干燥60分钟，使用Odyssey M成像仪（LI-COR）和800纳米通道进行成像。图像使用Empiria Studio 3.0（LI-COR）进行处理和分析。随后，膜用SYPRO Ruby蛋白印迹染料（ThermoFisher Scientific）染色以确定总蛋白量。染色的膜再用Odyssey M成像仪和488纳米通道进行成像。图像使用Empiria Studio 3.0进行处理和分析。

荧光发射光谱研究：50 μM DosS在50 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl和5%甘油中制备。使用TECAN Spark微孔板读取器获取DosS蛋白的荧光光谱，设置如下：激发波长为420 nm，发射扫描范围从520 nm到820 nm，步长为1 nm，增益保持恒定值110，Z位置根据样品孔计算和优化。

结果与讨论：为了证明使用标准可见光荧光或发光检测方法对基于血红素的HKs（heme-based HKs）的激酶测定不适用，我们进行了一项SDS-PAGE实验，其中包括未反应的铁和亚铁DosS，以及与ATP反应长达60分钟的CO/O2结合的亚铁DosS（参见图S4中每个样品的UV-Vis光谱）。我们还包括了一个无血红素的HK构建体——T. maritima HK853的截短形式[44]，它缺乏传感器结构域，即使在没有信号的情况下也会发生自磷酸化。在使用任何荧光染色之前，我们用可见光荧光检测参数对凝胶进行成像（见图1a；参见图S6a中的Coomassie染色凝胶），观察到所有DosS样品都有一个强且均匀的荧光信号（分子量=64 kDa）。为了了解这种荧光信号的来源，我们使用微孔板读取器测量了DosS的发射光谱。光谱显示一个大约在595 nm的主峰和一个大约在650 nm的宽次峰，这些是Zn-PPIX[29, 45]存在的诊断标志物，它们可能会干扰可见光荧光（见图S5）。另一方面，HK853在这些成像条件下没有荧光，显示出清晰的条带，并且在与其分子量32 kDa相对应的位置没有任何条带。当用PhosTag? Aqua染料（一种磷酸盐结合荧光团）对凝胶进行染色以评估自磷酸化水平时，我们观察到背景荧光掩盖了DosS信号（见图1b，上箭头）。相比之下，HK853在反应过程中显示出逐渐增加的自磷酸化（见图1b，下箭头）。接下来，我们进行了另一个SDS-PAGE实验，将其转移到硝酸纤维素膜上，并使用标准化学发光检测方法对膜进行成像，而没有进行任何一级/二级抗体的免疫印迹。我们注意到DosS条带能够催化鲁米诺的氧化，产生强烈且不需要的发光（见图1c，上箭头；参见图S6b中的SYPRO Ruby染色膜）。同样，HK853显示出清晰的条带，并且在与其分子量相对应的位置没有任何发光条带（见图1c，下箭头）。综上所述，这些研究表明，基于标准可见光荧光和发光检测的激酶测定在研究基于血红素的HKs时容易受到干扰。

图1：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
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(a) 含有未反应的铁和亚铁DosS的SDS-PAGE凝胶的荧光可视化，以及与ATP反应的亚铁-CO、亚铁-O2状态的DosS和HK853的时间进程（0、10、30和60分钟）。L表示蛋白质分子量梯度的条带。凝胶的荧光发射是在电泳分离后立即用532 nm的激发光和553 nm的发射光测量的。
(b) (a)中的凝胶用PhosTag? Aqua染色，并再次用532 nm的激发光和553 nm的发射光进行成像。
(c) 将(a)中SDS-PAGE凝胶的膜转移到硝酸纤维素膜上，并用鲁米诺进行成像，使用标准化学发光检测方法，而没有进行任何一级/二级抗体的免疫印迹。我们注意到DosS条带能够催化鲁米诺的氧化，产生强烈且不需要的发光（见图1c，上箭头；参见图S6b中的SYPRO Ruby染色膜）。

接下来，我们采用了一种包含磷酸盐结合分子的电泳迁移率变化测定方法，该方法可以选择性减缓磷酸化蛋白质的迁移速度，从而将磷酸化和非磷酸化蛋白质分离成不同的条带，实现激酶活性的比率定量[46]。特别是，这种方法已被用于确定如GcHK和FixL[12, 13]等血红素蛋白的激酶活性。因此，我们应用这种方法来研究DosS的O2切换激酶活性。具体来说，当DosS的血红素传感器处于FeII或FeII-CO状态时，它是活跃的激酶，但在FeII-O2状态下被抑制。我们在含有1 mM ATP和10 mM MgCl2的50 mM Tris (pH 8.0)缓冲液中，使用5 μM DosS进行了自磷酸化测定。在这些测定的特定时间点用EDTA淬灭样品，并在含有50 μM PhosBind丙烯酰胺的10% Tris-甘氨酸凝胶上进行分离。凝胶用Coomassie染色，并使用Odyssey M成像仪（LI-COR）和700纳米通道进行成像。然而，无论是FeII、FeII-CO还是FeII-O2状态的DosS样品都没有显示出任何明显的磷酸化和非磷酸化条带分离（见图2a）。作为阳性对照，我们同时对GcHK进行了相同的测定，这是一种已知适用该方法的血红素激酶。与DosS不同，GcHK样品被分离成不同的条带（见图2b），从而可以对其自磷酸化活性进行比率定量（见图2c）。与先前的报告一致，这些结果证实GcHK在FeII-O2和FeII-CO状态下是活跃的，但在FeII状态下是不活跃的。这些研究表明，基于磷酸化迁移率变化的测定方法并不适用于所有蛋白质。

图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
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(a) 含有FeII-O2（顶部）、FeII-CO（中部）和FeII（底部）状态的DosS的Coomassie染色PhosBind丙烯酰胺凝胶的图像。
(b) 含有FeII-O2（顶部）、FeII-CO（中部）和FeII（底部）状态的GcHK的Coomassie染色PhosBind丙烯酰胺凝胶的图像。自磷酸化的GcHK与非磷酸化蛋白质分离成两个不同比例的条带。这些条带分别表示为P–GcHK（磷酸化GcHK）和GcHK（非磷酸化GcHK）。
(c) 一张图表显示了不同结合状态下GcHK随时间磷酸化的百分比。FeII-CO（蓝色）和FeII-O2（红色）状态是活跃的，在8分钟后达到大约50%的磷酸化，而FeII（黑色）状态是不活跃的，没有显示出显著的自磷酸化。虚线用于辅助观察。

由于迁移率变化激酶测定方法无法分辨DosS的磷酸化，这表明需要一种替代方法来表征其活性。基于NIR荧光的免疫印迹可以规避DosS样品中背景荧光带来的挑战。因此，我们将NIR荧光检测与先前开发的免疫印迹方法结合使用，该方法使用ATPγS代替ATP[31, 32]。在这种方法中，任何在硫磷酸化测定中形成的tpHis都被转化为生物正交表位对硝基苯基硫磷酸酯（PNB-tP），然后被高亲和力的抗硫磷酸酯抗体[31]识别[31]。基于ATPγS的免疫印迹方法已被用于检测和探测多种激酶[31, 32]，并且相比使用磷酸化组氨酸检测抗体具有几个优势。首先，该方法具有通用性，适用于组氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶。其次，针对HKs而言，tpHis比磷酸组氨酸[30]更稳定，从而减轻了后续免疫印迹步骤中可能导致的潜在水解问题。

图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
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(a) 示意图展示了使用NIR荧光二级抗体进行基于免疫印迹的血红素激酶硫磷酸化测定的方法。HK与ATPγS反应，将其硫磷酸（tP）基团转移到HK的组氨酸残基上。tP通过PNBM化学修饰形成PNB-tP抗原。这种修饰后的蛋白质样品被Western印迹到硝酸纤维素膜上，并用一级和二级抗体染色。我们的方法使用与NIR标记荧光团结合的二级抗体，从而避免背景荧光的干扰。为了清晰起见，图中仅显示了一个抗体。使用Biorender创建。
(b) 含有FeII-O2（顶部）、FeII-CO（中部）和FeII（底部）GcHK的免疫染色膜的荧光图像。从左到右，条带强度的增加表明硫磷酸化随时间的增加。荧光是在785 nm的激发光和820 nm的发射光下测量的。
(c) (b)中膜的图像用SYPRO Ruby染色以进行总蛋白定量。即使条带密度相同，也显示了等量的蛋白质加载和转移。荧光是在488 nm的激发光和590 nm的发射光下测量的。
(d) 根据时间绘制了FeII-O2（红色）、FeII-CO（蓝色）和FeII（黑色）GcHK的硫磷酸化信号。FeII-O2和FeII-CO GcHK表现出增强的硫磷酸化。虚线用于辅助观察。
(e) 含有FeII-O2（顶部）、FeII-CO（中部）和FeII（底部）DosS的免疫染色膜的荧光图像。从左到右，条带强度的增加表明硫磷酸化随时间的增加。荧光是在785 nm的激发光和820 nm的发射光下测量的。
(f) (d)中膜的图像用SYPRO Ruby染色以进行总蛋白定量。即使条带密度相同，也显示了等量的蛋白质加载和转移。荧光是在488 nm的激发光和590 nm的发射光下测量的。
(g) 根据时间绘制了FeII-O2（红色）、FeII-CO（蓝色）和FeII（黑色）DosS的硫磷酸化信号。FeII-CO和FeII DosS表现出比FeII GcHK更强的硫磷酸化。虚线用于辅助观察。

我们首先研究了GcHK在其FeII、FeII-CO和FeII-O2状态下的时间依赖性硫磷酸化。硫磷酸化反应在预定时间点用EDTA淬灭，随后与p-硝基苯甲酰甲酸酯（PNBM）反应。然后对蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳分离和Western印迹转移（见图S7-S8中的完整凝胶）。FeII-O2和FeII-CO GcHK的条带强度随时间增加（见图3b，顶部和中间面板），表明有自硫磷酸化活性。相反，FeII GcHK的条带强度基本保持不变（见图3b，底部面板），表明自硫磷酸化活性较低。荧光信号相对于FeII-O2 8分钟样品和每个条带中的总蛋白量进行了归一化，后者是通过用SYPRO Ruby染色膜确定的（见图3c）。在这种基于NIR的免疫染色方法中观察到的GcHK活性趋势与使用迁移率变化激酶测定获得的结果一致，突显了该方法用于比较不同结合状态下血红素激酶硫磷酸化活性的适用性。

接下来，我们使用这种方法研究了DosS在30分钟时间进程中的结合依赖性硫磷酸化活性（见图3e-f，见图S9-S10中的完整凝胶）。由于缺乏100%硫磷酸化的参考标准，我们的方法中的荧光强度不能直接转换为硫磷酸化的百分比。相反，我们的方法比较了不同刺激下的时间依赖性荧光信号强度，从而可以确定硫磷酸化速率的比例，而不是绝对动力学。在将信号归一化到总蛋白含量后，我们观察到FeII和FeII-CO DosS的荧光信号增加速率是FeII-O2 DosS的四倍（图3g）。总体而言，我们的研究表明，FeII和FeII-CO状态在硫磷酸化过程中的活性明显高于FeII-O2状态，这一趋势与之前基于放射性标记的激酶活性研究结果一致[14, 20, 21]。我们还评估了这种检测方法在点印迹（dot-blot）格式下的适用性，并加入了失活的H395Q DosS变体（图S11-12）。该突变体保留了血红素结合结构域，但缺少在野生型（WT）DosS中发生硫磷酸化的目标H395组氨酸残基，因此可用作阴性对照。正如预期的那样，我们在H395Q DosS中未检测到任何硫磷酸化现象（图S12）。这证实了我们自动硫磷酸化检测中观察到的信号确实是由H395位点的功能性硫磷酸化事件引起的。总体而言，这些研究展示了基于近红外（NIR）荧光的硫磷酸化检测方法在捕捉GcHK的配体诱导激活以及DosS的O2特异性抑制方面的多功能性。此外，这项工作确立了基于NIR的硫磷酸化检测方法作为一种强大、灵敏且广泛适用的工具，可用于研究血红素激酶的配体状态依赖性硫磷酸化速率。

**结论**：微生物利用多种基于血红素的激酶来感知并传递其氧化还原环境的变化[5]。从生化和微生物学的角度来看，了解这些激酶如何区分不同的氧化还原刺激并向下传递信号以调节反应机制是一个关键的研究焦点。此外，由于类似DosS的激酶参与了传染病，它们成为有吸引力的药物靶点[5]。本研究引入了一种基于NIR荧光的硫磷酸化检测方法，以低成本、易于实施且可扩展的方式研究基于血红素的激酶的活性。尽管这种方法中的硫磷酸化动力学较慢[44]，可能会减弱刺激转换后反应的幅度（相对于传统的磷酸化检测方法），但研究表明DosS和GcHK的调节行为仍然保持完整。我们相信，这种方法为更深入地研究基于血红素的激酶特性以及开发高通量方法以发现它们的小分子抑制剂奠定了基础。