光生物调节技术与动态热成像相结合，作为慢性腿部溃疡的诊断工具

《Lasers in Medical Science》：Photobiomodulation combined with dynamic thermal imaging as a diagnostic tool for chronic leg ulcers

　　摘要
静脉性溃疡（VUs）和糖尿病足溃疡（DFUs）是最常见的慢性腿部溃疡类型，但其发病机制截然不同。光生物调节（PBM）已被证明可以通过影响微血管灌注来加速伤口愈合。然而，慢性VUs对PBM治疗的反应不如DFUs显著。此前，我们发现光生物调节引起的皮肤温度变化与微血管血流之间存在相关性。本研究旨在通过动态热成像技术，比较静脉性溃疡和糖尿病足溃疡对光生物调节的急性微血管反应。在这项前瞻性研究中，对20名患者的33处慢性溃疡（22处DFUs，11处VUs）进行了评估，并使用PBM（808纳米波长，峰值功率250毫瓦，频率15千赫兹）进行治疗。在PBM治疗前及之后每5分钟采集一次热图像，持续30分钟。记录了溃疡区域的最低和最高温度。通过线性回归分析确定了反应的预测因素。基线时，两种类型的溃疡床温度（27.7±2.9摄氏度）均显著低于周围组织（温差4.6±2.2摄氏度，p<0.001）。PBM治疗使DFUs的溃疡床温度持续升高（ΔT=2.10±2.25摄氏度，p<0.001），而VUs的溃疡床温度仅略有升高（ΔT=0.68±2.49摄氏度，p=0.385）。DFUs对PBM的热反应与基线温度呈负相关（β=-0.521，p=0.008；R2=0.399），表明温度较低的DFUs对PBM的反应更为明显。这些发现表明，动态热成像技术有助于区分哪些溃疡可能从光生物调节引起的微血管血流刺激中受益，从而为个性化治疗提供重要的生理学依据。

引言
慢性腿部溃疡是一个主要的临床挑战，尤其是在老年人中。它们会显著影响生活质量与预期寿命，并给全球医疗系统带来沉重负担[1, 2]。在慢性腿部溃疡中，静脉性溃疡（VUs）和糖尿病足溃疡（DFUs）最为常见，但其病因和病理生理机制截然不同[1, 2]。DFUs的主要病理问题是灌注不足，而VUs的典型病因是静脉瓣膜功能不全。已有证据表明DFUs对光生物调节（PBM）治疗反应良好[3, 4, 5]，增强微血管血流被认为是其关键机制[6, 7, 8]。然而，关于PBM对VUs疗效的研究结果并不一致，大多数研究未能证明其能加速伤口愈合[9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19]。
PBM利用非电离光辐射，通过与内源性色素团的非热、光物理和光化学相互作用来调节生物过程[20]。在细胞水平上，PBM可提高线粒体膜电位[21, 22]，促进一氧化氮释放[23]，增强血管平滑肌细胞的增殖和胶原蛋白合成[24]，并减少活化巨噬细胞中促炎细胞因子的表达和分泌[23]。在组织水平上，PBM可促进血管扩张和新生[7, 25, 26, 27]。临床上，PBM被用作加速难愈伤口愈合的治疗方法[3, 4, 5, 9, 28, 29]。增强微血管血流被认为是其关键机制[8]。
热成像是一种非侵入性、无辐射的技术，通过检测红外辐射并将其强度转换为温度值来测量表面温度，并以彩色图像显示[30]。多种与血流变化相关的生理和病理过程（如炎症、坏死或恶性肿瘤）都会改变皮肤温度，因此可以通过该技术检测到[31]。动态热成像可以追踪外部刺激下温度随时间的变化[32]。
除了将PBM作为治疗方法外，我们的团队还将其发展为评估微血管功能的实验工具。此前使用动态热成像对手部进行的研究表明，基线皮肤温度是影响微血管调节的重要因素[7]。这些发现通过激光多普勒血流测量和光电容积描记法得到了验证[7, 26]。与依赖外部加热或冷却的热刺激不同，PBM直接与细胞成分相互作用，提供了关于微血管功能的生理学相关信息。在本研究中，我们应用动态热成像技术来刺激腿部溃疡的微血管血流，监测反应并评估治疗效果。我们假设DFUs因微血管灌注改善而对PBM反应良好；而VUs由于静脉瓣膜功能不全导致的静水压力增加而反应较差。因此，本研究利用动态热成像技术比较了PBM引起的DFUs和VUs的局部皮肤温度变化，以此间接反映微血管灌注情况，为区分哪些溃疡可能从PBM治疗中受益提供了重要依据。

材料与方法
**研究设计**
这是一项前瞻性、对照性的诊断性临床试验。在加拿大多伦多Scarborough Health Network的门诊伤口诊所招募了需要定期伤口治疗的患者。收集了患者的人口统计学信息和溃疡相关数据（类型、测量结果、病史、治疗方案等）。去除敷料后，轻轻清洁溃疡部位。根据诊所常规的PBM治疗方案，将近红外PBM光照射到溃疡床、边缘及区域淋巴结。在PBM治疗前及之后每5分钟采集一次溃疡区域的热图像，持续30分钟（图1）。治疗和成像过程中未观察到可见渗出物。自动从热图像中测量最低和最高温度。主要结局指标是溃疡温度对PBM的反应变化；次要结局指标包括溃疡床与其边缘之间的温差，以及PBM热反应与溃疡特征之间的相关性。

**图1**
**研究流程**
PBM治疗和动态热成像的时间线：在PBM治疗前进行了两次基线温度测量（Pre-PBM），治疗范围包括溃疡床、溃疡边缘和区域淋巴结（用红色条形和闪电符号标示）。在PBM治疗后的30分钟内，每隔5分钟采集一次热图像（Post-PBM），以评估表面温度变化，从而反映微血管血流情况。

**伦理**
该研究设计获得了Scarborough Health Network研究伦理委员会的批准。由于该研究符合Tri Council Policy Statement: Ethical Conduct for Research Involving Humans (TCPS2)指南中的质量改进标准，因此免除了知情同意的要求（决定日期为2021年4月16日）。临床试验编号不适用。

**研究人群与地点**
2021年4月至2022年3月期间，在加拿大多伦多Scarborough Health Network的门诊伤口诊所招募了患有慢性腿部溃疡的患者。纳入标准为：（1）慢性腿部溃疡持续至少3个月；（2）溃疡位于膝盖以下；（3）诊断为糖尿病足溃疡或静脉性溃疡。排除标准为：（1）由手术或癌症引起的溃疡；（2）正在接受积极肿瘤治疗的患者；（3）热图像质量不佳。

**溃疡类型**
溃疡类型由专门从事伤口护理的护士根据常规临床指南在参与实验前确定。简而言之，DFUs通过评估糖尿病患者的神经病变、外周动脉疾病和溃疡特征进行诊断；而VUs则通过双功超声检查发现的慢性静脉功能不全及其独特的溃疡位置和外观进行识别[33, 34]。

**数据收集**
收集了所有参与者的 demographic 信息、溃疡类型及相关合并症。溃疡位置记录为“非足部”（踝部或胫部）或“足部”（右侧/左侧及足背/足底）。足部溃疡进一步分为前足、中足或后足。

**光生物调节**
使用近红外GaAlAs PBM激光（B-Cure Laser Pro；Erica B-Cure Laser Ltd., 海法，以色列）对溃疡进行照射，该激光无需处方即可非处方购买，是诊所常规治疗的一部分。治疗参数包括：808纳米波长，峰值功率250毫瓦，脉冲频率15千赫兹，占空比为33%，光斑面积为4.5×1.0厘米（4.5平方厘米）。相应的峰值和平均功率密度分别为约55毫瓦/平方厘米和18毫瓦/平方厘米。治疗过程中，激光持续照射溃疡床（距离小于1厘米），分别接触溃疡边缘0.5分钟和2分钟，根据溃疡大小重复照射直至覆盖整个溃疡区域。此外，还照射了区域淋巴结（腘窝和腹股沟）2分钟。

**动态热成像**
成像前，轻轻清洁溃疡区域，并让其暴露在室温环境中10分钟以平衡表面温度。在溃疡周围贴上红外不透明贴纸以标记伤口边界，便于进行光学-热学对齐。在溃疡同一平面上放置一个10厘米的标尺贴纸，以便后续测量溃疡面积。使用FLIR C5红外相机（FLIR Systems, Wilsonville, OR）进行热成像，相机安装在距离溃疡30厘米的三脚架上。拍摄过程中相机位置保持不变。每次成像时记录室温，并输入FLIR Tools软件进行温度校准。DFU成像期间的室温为24.8±1.8摄氏度，VU成像期间的室温为25.5±1.6摄氏度。PBM治疗前拍摄两张基线图像，之后每隔5分钟拍摄六张图像，直至30分钟。每处溃疡共获取八张图像（图1）。使用FLIR Tools软件可视化热图像，温度刻度范围为7摄氏度，所有时间点的最小和最大温度值保持一致。每个受试者的最高温度为其图像序列中的最高温度。应用线性温度颜色分布，以便直观比较不同时间点的温度变化。由于个体基线皮肤温度存在差异，因此对每个受试者分别进行此处理。感兴趣区域（ROI）由红外不透明贴纸定义，包括溃疡床及其边缘。软件自动识别每个ROI内的最低和最高温度，并在整个时间点保持ROI的解剖标记一致。PBM治疗与热成像结合进行，优先于任何其他计划中的治疗程序，包括可能导致组织损伤的清创术以及辅助治疗手段（如高压氧、负压伤口治疗（PUSH）和压缩治疗）。

**溃疡面积测量**
使用ImageJ软件测量溃疡面积。边界是通过嵌入图像中的刻度手动标记的，用于校准。溃疡面积以平方厘米（cm2）为单位报告。

**统计方法**
连续变量以均值和标准差表示。分类变量以频率和百分比表示。如果同一患者在几周间隔的不同时间进行重复评估，并且假设存在临床相关的变异和测量条件不重叠，则这些重复评估被视为独立样本。为了解决潜在的统计聚类问题，我们对方向和幅度进行了敏感性分析，每次分析仅包括患者的首次访问数据点。配对t检验用于比较每位患者PBM治疗前后的两次基线图像之间的温度，以及溃疡床和边缘之间的温度。在进行了Levin方差相等性检验后，应用双样本t检验来比较DFUs和VUs之间的基线温度和温度变化。皮尔逊相关系数用于评估基线值与热响应之间的关联（“基线依赖性”）。多元线性回归用于评估基线伤口温度和伤口面积是否独立预测了对PBM的热响应，分别为DFUs和VUs构建了不同的模型。

**功效分析**
假设每种类型的溃疡至少有10例，并基于从基线到PBM后15分钟的初步温度变化测量（糖尿病溃疡：2.0±1.3°C；静脉溃疡：-1.9±3.2°C），该研究在5%的显著性水平下有90.8%的功效能够检测到统计学上的显著差异。

**责任性和人口统计学**
共评估了25名患有慢性腿部溃疡的患者，其中5人被排除在外：3人的伤口位于膝盖以上，2人是术后溃疡患者或活动性肿瘤患者。剩余的20名患者（13名男性，7名女性）被纳入分析。其中，13人患有DFUs，主要位于前脚，7人患有VUs，主要位于胫骨或踝部（表1）。

**表1 患者特征**
DFUs患者显著比VUs患者年轻（p=0.014）。然而，所有伤口的平均溃疡面积为7.9±9.1平方厘米，DFUs和VUs之间没有显著差异（p=0.758）（表1）。在DFU组中，2人有足部畸形，3人进行了截肢。关于活动能力，一半的患者（50%）可以独立行走，7人（35%）使用助行器或拐杖，1人（5%）无法行走。

标准护理包括伤口清创和各种敷料（例如，Hydrofera Blue、基于蜂蜜的产品）。此外，根据临床需要，患者还接受了辅助治疗，包括高压氧、PUSH和压缩疗法。合并症包括高血压、高胆固醇和心血管疾病——这些是该患者群体的典型情况。有5名患者的伤口在多个时间点进行了评估（有关重复访问的处理，请参见统计分析部分）。因此，总共评估了33个伤口，包括22个DFUs和11个VUs。

**温度：伤口床与伤口边缘**
使用热成像软件，我们发现所有溃疡都明显比周围皮肤温度低（p<0.001）（图2）。无论伤口类型如何，伤口床的绝对最低温度均为27.7±2.9°C（平均值±标准差：VU=28.0±2.2°C；DFU=27.5±3.2°C；p=0.878，通过重复测量ANOVA）。此外，伤口床平均比相邻的伤口边缘低4.6±2.2°C。

**图2**
这张图片的替代文本可能是使用AI生成的。

**糖尿病足溃疡（DFU）的热成像和临床图像。左图：带有银色标记的慢性DFU，用于标识解剖位置。右图：相应的热成像显示溃疡部位（灰色箭头）的表面温度低于周围组织。溃疡中心的最低温度=28.5°C；边缘的最高温度=32.8°C。Bx1表示用于温度提取的感兴趣区域。热成像反映了伤口床相对于边缘的微血管血流受损情况。**

**动态热成像**
在PBM治疗前的-5分钟和基线时间点拍摄的两张热成像图像之间没有观察到显著差异，排除了环境因素对后续温度变化的影响（平均值±标准差，T-5 vs. T_Base：27.8±2.9°C vs. 27.3±3.2°C，0.147，通过配对t检验）。

PBM治疗导致DFUs的伤口床温度显著升高，而VUs的伤口床温度没有变化（温度变化[°C]，平均值±标准差：DFU [n=22] = 2.1±2.2，p<0.001；VU [n=11] = 0.7±2.5，p=0.385，通过配对t检验）（图3）。在排除了提供多个数据点的患者数据后进行的敏感性分析并未影响结果的效果幅度或方向（DFU [n=13] = 2.2±2.2，p=0.003；VU [n=7] = 0.5±2.5，p=0.638）。

**图3**
这张图片的替代文本可能是使用AI生成的。

**糖尿病溃疡与静脉溃疡的光生物调节治疗热成像。(A) 糖尿病足溃疡（DFU，上排）和静脉溃疡（VU，下排）在PBM治疗前（基线[左]）和治疗后25分钟[右]的热成像。注意DFU的伤口周围区域（Sp2：32.4°C → 34.4°C）和相邻完整脚趾（Sp1：29.9°C → 31.6°C）的表面温度均有所升高——这与微血管灌注改善一致。相比之下，VU在PBM治疗后变化很小（Sp1：29.7°C → 30.3°C）。所有面板使用了一致的热范围（29.0–36.1°C）以便进行比较。(B) 条形图显示了PBM治疗前（基线）和治疗后（平均值±SEM）的伤口床温度。数据代表DFUs（n=22）和VUs（n=11）在10–30分钟内的平均温度。***p<0.001，通过配对t检验。**

**多元线性回归**
DFUs的基线伤口温度强烈预测了对PBM的热响应（β = -0.521，p=0.008）；然而，伤口面积并不能预测这种响应（β = -0.069，p=0.143）。该模型解释了40%的变异（R2 = 0.399）。相比之下，对VUs进行的相同分析显示，基线伤口温度和伤口面积都不能预测对PBM的热响应（模型p>0.05）。

**讨论**
在糖尿病患者中，34%的人会发展成DFUs，这与截肢和死亡风险显著增加有关[2]。周围神经病变，通常与DFUs的形成有关，影响了近一半的糖尿病患者，尤其是在西方国家[35]，并导致保护性感觉丧失。皮肤和皮肤神经的微血管血流受损是其发展的原因。最长的神经纤维往往首先受到影响，这反映在DFUs通常首先出现在脚部[35]。因此，容易受到创伤和压力的区域，如脚趾尖和第一跖骨的内侧，特别容易发生溃疡[36]。

VUs是最常见的腿部溃疡类型，约占病例的80%[37]。VUs通常发生在小腿的袜套区域——尤其是内侧。其主要病因是静脉瓣膜功能不全，导致逆流增加、静水压异常升高和毛细血管渗漏，从而引发一系列局部皮肤和系统性的后果，包括皮肤淤血和色素变化、组织和氧及营养输送受损、炎症细胞浸润（可能伴有感染）、静脉曲张、血栓形成以及疼痛，这些通常会导致活动能力下降和生活质量降低[38]。

本研究使用动态热成像来评估慢性腿部溃疡对PBM的热响应，作为微血管灌注的代理指标。我们发现DFUs和VUs最初都比周围皮肤温度低——这与灌注受损一致[39]。PBM治疗导致DFUs的温度显著且持续升高，而VUs的温度没有升高，DFUs的响应受到基线伤口温度的强烈影响，较冷的DFUs显示出更大的改善。这些发现表明，动态热成像结合PBM可以捕捉到生理上相关的灌注反应，提供了有用的微血管功能评估。虽然DFU组的年龄略高于VU组，但在老年人群中平均年龄的差异很小，这种比较主要反映了影响微循环的不同的病理生理机制。尽管没有评估愈合结果，但DFUs的基线依赖性响应表明PBM可能对灌注不良的组织特别有效，这种方法有助于识别最有可能从这种微血管刺激治疗中受益的DFUs，从而优化治疗方案。

PBM治疗前的伤口床温度为27.6°C，DFUs和VUs之间的温度没有显著差异。这比周围完整皮肤的温度低4.6°C，远高于临床上认为有意义的0.5°C阈值[40, 41]，表明伤口床区域的灌注明显受损。Mendon?a等人[42]报告称VUs的伤口床和正常皮肤之间的温度差异为2.9±2.2°C，而Nam等人[43]描述了患有外周动脉疾病的患者的DFU受影响脚和对照脚之间的温度差异为4.0±0.1°C。需要注意的是，由于热成像捕捉的是表层皮肤温度，所测量的信号主要反映了真皮毛细血管网络内的微血管灌注[7]，而外周动脉疾病主要影响更深层的宏观血管流入。

一些研究通过监测皮肤温度来预测溃疡的形成，注意到温度升高可能先于溃疡的发生[44, 45]。有研究表明，神经病变的DFUs可能比周围皮肤温度更高[42]。尽管当前研究没有评估神经病变状态，但我们的队列中没有DFUs的伤口床温度高于周围皮肤。尽管如此，这强调了识别次要和共存病理的重要性，以便最大化治疗效果。

本研究的主要目的是表征DFUs和VUs对PBM的热响应。PBM治疗后立即记录了伤口床温度，并每5分钟记录一次，持续30分钟。由于局部加热效应通常在10分钟内消散[32]，因此仅分析了PBM后10–30分钟的测量数据，排除了初始光热加热可能造成的混淆效应。

在DFUs中，PBM治疗后伤口床和周围组织的皮肤温度显著升高，并且至少持续了30分钟。这种持续的升高与热成像所反映的微血管血流增强一致。基线伤口温度是这一响应的显著独立预测因素，解释了约40%的变异，而伤口大小则没有关联。值得注意的是，溃疡面积≥1平方厘米已被确定为DFU患者死亡风险增加的独立风险因素（风险比1.50；95%置信区间1.42–1.59）[46]。我们研究中缺乏关联表明，血管状态可能比溃疡范围更关键，决定了对PBM的生理响应性。事实上，先前的临床试验即使在非常大的DFUs中也报告了PBM的好处[28]，这加强了灌注状态而非大小本身决定了治疗潜力的观点。基线温度与PBM响应之间的中度负相关进一步表明，较冷的DFUs——反映了较差的灌注——从PBM诱导的血管扩张中获益最多。

相比之下，接受相同PBM治疗的VUs没有观察到显著的温度变化。这可能反映了两种溃疡类型的病理生理差异。然而，VUs缺乏响应可能反映了特定于方案的效应，如不同的波长、给药技术或剂量策略。我们建议，DFUs中温度的升高与微血管灌注增强一致，而VUs中温度的微小净变化至少部分是由于初始血液重新分布所致。

当前研究的发现强调了需要根据不同类型溃疡的病因和发病机制以及可能的共存病理制定个性化的PBM方案，以提供有效的治疗。

**局限性**
本研究没有控制患者使用血管活性药物的情况或糖尿病足溃疡患者的神经病变状态，这两者都可能影响微血管反应，也没有包括假照射对照组。通过在治疗前获取两张基线热成像图像并记录室温来进行校准，同时分析调整了基线温度以反映伤口的潜在灌注状态。一些患者提供了多次观察数据；然而，将每个患者的观察次数限制为一次仍得到了类似的结果。未来需要更大样本量的研究，并纳入假对照组，以进一步阐明所观察到的热反应的生理和临床意义。

结论：虽然增强微血管血流是PBM（脉冲电磁场）对糖尿病足溃疡产生有益效果的核心机制，但在静脉性溃疡中并未观察到类似的反应。静脉性溃疡的主要发病机制是由于静脉瓣膜功能不全导致的静水压力升高。本研究证明了将PBM与动态热成像技术结合使用的可行性，这种技术可作为诊断慢性溃疡的新工具，并用于评估患者对PBM治疗的急性反应性。