Cylindrospermopsin的毒代动力学研究：包括计算机模拟的ADMET（吸收、分布、代谢、排泄）模型、大鼠和人类肝脏微粒体的代谢过程，以及使用超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS/MS）技术对代谢产物的分析

《Archives of Toxicology》：Cylindrospermopsin toxicokinetics: in silico ADMET modeling, rat and human liver microsome metabolism, and UHPLC-MS/MS metabolite characterization

　　**摘要**
Cylindrospermopsin是一种强效的蓝藻毒素，由于其环境持久性和广泛的毒理学特性而日益受到全球关注。尽管越来越多的证据表明其具有毒性作用，但对其毒代动力学的了解仍然有限。本研究结合了计算机模拟的ADMET预测和体外微粒体实验（使用人类及按性别分层的大鼠肝脏微粒体），以表征CYN的生物转化过程。计算机模拟预测显示其肠道吸收率较低，难以穿透血脑屏障（BBB），与血浆蛋白的结合能力较弱，且CYP450介导的代谢非常有限。然而，研究发现了几种潜在的II期结合途径，某些代谢产物的毒理学性质预计与母体化合物有所不同。补充的体外实验在微粒体中证实了CYN的高代谢稳定性，在孵育过程中毒素浓度仅略有下降（8-15%）。值得注意的是，在II期条件下，尤其是葡萄糖醛酸化和氨基酸结合过程中，生物转化现象更为明显。通过超高性能液相色谱（UHPLC-/MS/MS）首次检测到了新的代谢产物，包括与半胱氨酸、甘氨酸、牛磺酸和精氨酸以及脂肪酸的结合物。尽管在性别或物种之间未观察到显著的定量差异，但代谢产物谱存在定性差异。这些发现为CYN的代谢命运提供了新的见解，强调了结合反应在其解毒过程中的重要性，并支持应用综合计算和实验方法来改进蓝藻毒素的风险评估。

**引言**
Cylindrospermopsin（CYN）是一种强效的蓝藻毒素，由于其在热带和温带地区淡水水体中的检出频率增加（这一现象由富营养化和气候变化驱动，参见Zhang等人2025年的研究），其全球重要性日益凸显。自该毒素被发现以来，包括Raphidiopsis raciborskii、Chrysosporum ovalisporum、Raphidiopsis curvata和Umezakia natans等产生CYN的物种已在世界各地被分离出来（参见Adamczuk等人2025年、Harada等人1994年、Li等人2001年及Schembri等人2001年的研究）。CYN的三环胍基-硫酸盐-尿嘧啶结构使其具有高度的水溶性，并且研究表明它在环境中非常稳定，不易通过水解、光诱导降解或微生物作用发生分解（参见De La Cruz等人2013年、Pichardo等人2017年及Zhang等人2025年的研究）。从毒理学角度来看，CYN被归类为多器官蛋白质合成抑制剂，具有肝毒性、肾毒性、神经毒性、内分泌毒性、遗传毒性、免疫毒性和可能的致癌性以及生殖毒性（参见Casas-Rodríguez等人2025a年、Chernoff等人2011年、Díez-Quijada等人2019年、Guzmán-Guillén等人2015年及Yang等人2021年的研究）。研究表明，CYN可能干扰蛋白质合成并耗尽细胞内的谷胱甘肽（GSH）水平（参见Froscio等人2003年及Runnegar等人1994年、1995年的研究），并可能与细胞色素P450（CYP450）发生相互作用（参见Runnegar等人1995年及Yang等人2021年的研究）。与毒性评估研究相比，关于CYN毒代动力学（ADME：吸收、分布、代谢和排泄）的数据较为有限（参见WHO 2020年的报告）。代谢是调节许多化学物质毒性的关键因素，因为原始化合物可能会转化为高毒性的代谢产物（参见Cascajosa-Lira等人2023年的研究）。研究表明，CYP450酶可能参与CYN的代谢活化，而CYP450的抑制会降低毒性并导致代谢产物与DNA的共价结合，这表明可能存在生物活化现象（参见Humpage等人2005年、Norris等人2002年及Runnegar等人1995年的研究）。迄今为止，仅有一项研究关注了口服暴露于CYN的大鼠脑提取物中的氧化应激，并鉴定了该毒素的I期和II期代谢产物（参见Plata-Calzado等人2025年的研究）。Runnegar等人（1995年）认为CYN引起的GSH耗竭是由于合成受阻所致，而Norris等人（2002年）则认为，无论通过结合还是合成抑制，这种耗竭都不是CYN肝毒性的核心机制。相反，我们的研究小组观察到暴露于CYN的罗非鱼中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）活性增加，GSH/GSSG比率降低，表明GSH合成并未受到抑制（参见Guzmán-Guillén等人2013年的研究）。最近，Adamski和Kaminski（2021年）进行了一项体外研究，评估了CYN及其分解产物（浓度为1、5和10 μg/mL）存在下GSH抗氧化特性的变化，结果表明CYN与GSH在体外条件下没有显著相互作用。然而，该实验仅关注了GSH与CYN或其分解产物之间的直接化学相互作用，未涉及可能影响CYN反应性的酶或其他细胞内化合物。因此，CYN与GSH之间相互作用的确切机制仍不清楚。Norris等人（2001年）确定尿液系统是CYN的主要排泄途径，仅有少量CYN可能以未代谢的形式随尿液排出。

理解ADME对于解释剂量-效应关系、暴露模型和风险评估至关重要。由于实验挑战以及动物到人类的外推存在局限性，将计算机模拟预测与经验模型相结合可以在研究的早期阶段简化研究工作。计算ADMET工具可以预测CYN及其可能代谢产物的吸收、分布、P450介导的代谢、排泄和毒性。这些计算机模拟方法为生物活性化合物与其酶靶点或器官靶点之间的分子水平相互作用提供了有价值的见解（参见Brogi等人2020年的研究）。在CYN的情况下，我们实验室之前的研究显示了CYN与雄激素受体的潜在相互作用（参见Chernoff等人2011年的研究）。此外，计算机模拟方法有助于确定体外验证的目标，并突出高风险代谢产物，从而指导实验策略。基于计算机模拟的结果，使用混合的人类和按性别分层的大鼠肝脏微粒体进行的体外研究可以阐明代谢速率、酶动力学、代谢产物谱，并识别潜在的生物活化中间体。微粒体是识别负责化合物代谢的具体微粒体酶的重要工具，这对于跨物种推广研究结果非常重要。此外，与高分辨率质谱联用可以检测和表征I/II期代谢产物，包括谷胱甘肽结合物、羟基化或脱硫物种（参见Cascajosa-Lira等人2023年、Chavan等人2018年、Feng等人2021年、Johnsi Rani等人2018年及Lee等人2015年及Plata-Calzado等人2025年的研究）。研究一致表明，不同物种（尤其是大鼠）的微粒体CYP450活性存在显著的性别差异，这对毒性和代谢数据向人类的外推具有重要影响。例如，大鼠表现出CYP2C和CYP3A家族等CYP亚型的显著性别特异性表达（参见Mugford和Kedderis 1998年的研究）。

关于其他蓝藻毒素（如微囊藻毒素MCs），已经进行了它们与GSH结合的研究（参见Buratti等人2013年及Gehringer等人2004年的研究）。在CYN的研究中，迄今为止唯一使用HepaRG细胞、人肝微粒体（HLM）和大鼠及人S9肝组织片段进行的研究发现，在孵育期结束时这些系统中的CYN回收率约为100%，且未检测到该毒素的I期代谢产物（参见Kittler等人2016年的研究）。因此，需要更全面的CYN体外代谢数据来增强风险评估工作。

鉴于上述背景，并根据下一代风险评估原则，本研究的目的是首次结合计算机模拟的ADMET建模和体外微粒体代谢研究来研究CYN。本研究使用了雄性和雌性大鼠及人类的微粒体，以识别与物种或性别相关的潜在代谢差异。该研究有助于了解CYN的代谢过程并识别潜在的代谢产物。CYN代谢产物的鉴定是通过UHPLC-/MS/MS方法完成的。

**方法**
**化学品和试剂**
Cylindrospermopsin（纯度95%）由Enzo Life Sciences（瑞士）提供。PBS、睾酮、7-羟基香豆素、还原型谷胱甘肽、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、氯化镁（MgCl2）、Tris缓冲液和尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。HPLC级甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）购自Merck（德国达姆施塔特）。混合大鼠肝脏微粒体（RLM）和HLM分别由Corning Gentest（美国马萨诸塞州沃本）和Gibco（西班牙塞维利亚Biomol）提供。Alamethicin、NADP+和葡萄糖-6-磷酸（G6P）购自Cayman Chemical Company（美国密歇根州安娜堡）。超纯水（电阻率为18.2 MΩ cm）通过NANOpure Diamond?（美国Barnstead）系统进行纯化。

**计算机模拟方法**
通过Biotransformer 3.0软件获取了不同生物转化途径产生的CYN代谢产物的化学结构，并将其转换为SMILES格式。随后，将这些SMILES提交给ADMETlab 3.0软件，以预测CYN及其鉴定代谢产物的ADME参数和毒性效应。关于吸收，预测了Caco-2和MDCK细胞的通透性以及人体肠道吸收（HIA）。在分布方面，计算了血浆蛋白结合概率（PPB）和穿越血脑屏障（BBB）的可能性。关于代谢，考虑了作为不同CYP亚型抑制剂或底物的可能性。作为排泄参数，计算了血浆清除率（CLplasma）和半衰期（T1/2）。为了评估CYN及其代谢产物的潜在毒性，预测了以下终点：Ames试验、致癌性、人体肝毒性、遗传毒性、药物诱导的肾毒性和神经毒性。

**体外代谢**
实验按照Lee等人（2015年）和Cascajosa-Lira等人（2023年）描述的方法进行，并根据Feng等人（2021年）和Johnsi Rani等人（2018年）的方法进行了少量修改。设置了三个实验组：一组代表I期（氧化），两组代表II期（与GSH或葡萄糖醛酸的结合）。分别使用雄性（MRLM）或雌性（FRLM）大鼠的微粒体以及HLM进行了反应。代谢反应混合物的最终体积为1 mL，包含：a) MRLM/FRLM/HLM（0.5 mg/mL）在磷酸盐缓冲液（PBS）（100 mM，pH 7.4）中——在GSH结合的情况下，还添加了GSH（5 mM）——并在37°C下孵育（5分钟，50转/分钟）；b) CYN（2 ppm，5 μM）或氧化和葡萄糖醛酸化的阳性对照（分别为20 μM睾酮和1 μM 7-羟基香豆素）；GSH结合不需要阳性对照，因为该反应可以在有或没有谷胱甘肽S-转移酶的情况下发生；c) NADPH再生系统用于氧化反应，以及UGT反应混合物用于葡萄糖醛酸化反应，以启动反应。NADPH再生系统包括G6PDH（0.4 U/mL）、MgCl2（3.3 mM）、NADP+（1.3 mM）和G6P（3.3 mM）。UGT反应混合物由Tris–HCl（50 mM，pH 7.5）、MgCl2（8 mM）、alamethicin（25 μg/mL，溶于1.25% MeOH）和UDPGA（2 mM）组成。阳性对照包括睾酮和7-羟基香豆素，用于分别确认CYP450和葡萄糖醛酸转移酶的酶活性。每个反应还包括不含毒素的空白对照，并且所有反应均重复三次。

加入所有试剂后，所有样品在先前描述的条件下孵育，并在不同时间点（0、1、3、5、15、30、60和120分钟）取100 μL样品，然后与相同体积的冷ACN混合以停止代谢反应。立即涡旋混合样品并冷冻保存直至分析。选定的孵育时间是根据微粒体制备物的稳定性限定的，这些限定由制造商的说明书指定。CYN的浓度（5 μM）是基于两个标准选择的：首先，它与阳性对照物的摩尔范围相同，确保了足够的酶活性和反应间的可比性；其次，它代表了一个与环境相关的浓度，因为在某些蓝藻水华事件中报告了类似的水平（Yang等人，2021年）。

UHPLC-MS/MS：色谱条件和数据采集
色谱分析使用Thermo Scientific液相色谱系统进行，该系统包括一个二元UHPLC Dionex Ultimate 3000 RS，连接到一个四极杆-轨道阱Qexactive混合质谱仪（ThermoFisher Scientific，美国），配备了一个Waters C18 Acquity HSST3柱（10 × 2.1 mm，1.8 μm），柱温保持在35°C，HESI离子源以正模式运行（喷雾电压：3,500 V；毛细管温度：320°C；鞘气：50单位；辅助气体：12.5单位；探针加热器温度：425°C；S-Lens RF水平：50）。自动采样器保持在15°C。流动相A由含有0.1%甲酸的水组成，流动相B由含有0.1%甲酸的ACN组成，流速为0.45 mL/min，梯度如下：从0.0到7.0分钟为2% B，然后在7.0分钟升至70% B，在7.1分钟达到100% B，保持到8.0分钟，最后在8.1分钟回到2% B，直到10.0分钟结束运行。质谱仪采用数据依赖性分析，在m/z 100–1500的全扫描范围内工作，分辨率为70,000（FWHM），AGC目标为3 × 10^6，最大注射时间为200 ms，最强的5个离子（Top5）被进一步进行MS/MS裂解分析。提取的离子色谱图使用TraceFinder 5.1软件生成，以精确搜索CYN（m/z 416.12345）、睾酮（m/z 289.21621）和7-羟基香豆素（m/z 163.03897）的质量，质量误差在5 ppm以内。

代谢物表征：数据分析
为了全面分析代谢物（I期和II期），数据进一步使用Compound Discoverer? 3.2（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）进行，遵循以下工作流程：光谱选择、保留时间对齐以及基于准确质量和MS/MS裂解模式的化合物鉴定，通过与真实标准的比较或在各种数据库（MassBank、mzCloud、ChemSpider和塞维利亚大学内部质谱服务数据库）中的搜索来完成。

统计分析
结果以平均值±标准差（SD）表示。统计评估使用GraphPad Prism 9（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，美国）进行。在分析之前，使用Kolmogorov–Smirnov检验评估数据的正态性。对于正态分布的数据，应用单因素方差分析（ANOVA），当检测到显著差异时，随后进行Tukey–Kramer事后检验。对于不符合正态性标准的数据集，使用Kruskal–Wallis检验，并进行Dunn的多重比较检验。p值低于0.05被认为是统计显著的。

结果和讨论
基于Biotransformer 3.0软件的预测代谢物（M1-M9）显示在图1中。CYN的主要代谢途径是烷基-OH-葡萄糖醛酸化（M1）、硫酸化（M2）和环状N-酰脲的水解（M3）。次级代谢似乎仅影响M3：三种不同的葡萄糖醛酸化、与甘氨酸和肉碱的结合以及硫酸化。

图1
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根据使用Biotransformer 3.0软件进行的体外代谢分析结果预测的CYN代谢途径

图2反映了CYN及其代谢物（M1-M9）的主要动力学和毒理学参数，这些参数由ADMETlab 3.0软件预测。关于吸收的观察参数（Caco-2和MDCK通透性，以及HIA）（图2A-C）显示CYN的吸收概率较低（HIA的2%），这与体外结果一致（Fernández等人，2014年；Pichardo等人，2017年）。此外，Plata-Calzado等人（2024年）观察到CYN在THP-1（单核细胞）培养物中的吸收有限，并且具有浓度依赖性。因此，在最高暴露浓度（3 μg/mL）下，细胞内和细胞外分别检测到1.30%和65%的CYN。对于代谢物，Caco-2和肾细胞的吸收概率仍然较低，但对于HIA，结果因化合物而异：M3的吸收概率非常低（3.6%），尤其是M4（0.1%），但M7（98.6%）和M9（98.9%）的吸收概率较高。然而，目前没有关于CYN及其潜在代谢物在体内的吸收的研究。我们小组最近的一项研究对大鼠进行了CYN的口服暴露（500 μg/kg体重），并通过基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）在暴露后约2小时内在其肠液中检测到了该毒素及其钠和钾加合物，其浓度在肠道中逐渐减少，但没有证据表明有上皮细胞吸收或系统进入（Casas-Rodríguez等人，2025b）。同一研究还报告了与炎症反应相关的脂质家族的变化、氧化应激的增加以及细胞膜完整性的逐渐破坏。这些发现强烈表明，CYN或其代谢物可能对肠上皮产生局部毒性作用。尽管有报告和结果表明CYN及其代谢物的吸收有限，但仍有大量证据表明其具有毒性。因此，评估其对人类健康的潜在风险非常重要。在这方面，ADMET和体外代谢结果提供了新的见解，表明哪些代谢物可能通过肠屏障渗透，支持需要进一步研究的体内吸收假设。

图2
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CYN及其代谢物（M1-M9）的不同动力学和毒理学参数的预测。A Caco-2通透性（对数单位）；最佳：高于-5.15对数单位。B MDCK通透性（cm/s）；低通透性：<2 × 10^-6 cm/s；中等通透性：2–20 × 10^-6 cm/s；高被动通透性：>20 × 10^-6 cm/s。C 人体肠道吸收，范围在0到1之间，显示被吸收的概率；D 血浆蛋白结合（%）；最佳：<90%；E 血浆清除率（CLplasma；ml/min/kg）；高清除率：>15 ml/min/kg；中等清除率：5–15 ml/min/kg；低清除率：<5 ml/min/kg；F 半衰期（T1/2，小时）；超短半衰期：<1 h；短半衰期：1–4 h；中等短半衰期：4–8 h；长半衰期：>8 h；G AMES测试，范围在0到1之间，其中0：无AMES效应（-），1：有AMES效应（+）；H 致癌性，范围在0到1之间，其中0：无致癌性，1：有致癌性；I 人体肝毒性，范围在0到1之间，其中0：无肝毒性，1：有肝毒性；J 药物诱导的肾毒性，范围在0到1之间，其中0：无肾毒性，1：有肾毒性；K 遗传毒性，范围在0到1之间，其中0：无遗传毒性，1：有遗传毒性；L 药物诱导的神经毒性，范围在0到1之间，其中0：无神经毒性，1：有神经毒性。

评估CYN在体内分布的参数表明，CYN及其潜在代谢物与血浆蛋白的结合概率较低（图2D），并且穿过血脑屏障（BBB）的可能性可以忽略不计（0%）。然而，我们的体外研究是有限的，因为它们无法预测物质的器官选择性。体内研究表明，CYN主要分布在肠道、肝脏和肾脏中（Gutierrez-Praena等人，2014年；Guzmán-Guillén等人，2014年）。到目前为止，只有两项使用ELISA测试的研究在暴露于该毒素的鱼类大脑中检测到了CYN（Da Silva等人，2018年；Guzmán-Guillén等人，2015年），这证明了它能够穿过BBB。然而，ELISA测试中CYN检测的假阳性结果引起了一些担忧。与体外预测相反，Plata-Calzado等人（2025年）在口服CYN的大鼠脑样本中检测到了14种潜在的CYN衍生物化合物，并观察到不同参数的变化（乙酰胆碱酯酶活性和氧化应激生物标志物）。因此，CYN与BBB的相互作用是一个需要进一步研究的重要问题。

CYN及其代谢物被不同细胞色素异构体（CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9；CYP2D6、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C8）代谢的概率非常低；因此，这些概率在任何图中都没有表示，因为大多数预测值为零，只有一个例外：CYP2C9对于M2、M4、M5、M6、M7和M8。同样，CYN及其代谢物与HLM的相互作用概率也非常低（数据未显示）。

关于CYN及其代谢物的排泄过程，计算了Cl和T1/2（图2E，F）。在所有情况下，Cl值都低于5 mL/min/kg，表明清除率低。然而，T1/2值在1到2.5小时之间，反映了较短的半衰期。尽管低血浆清除率（Cl）通常与长消除半衰期相关，但当分布体积（Vd）极低时，这种预期会改变（Mansoor和Mahabadi 2023）。对于CYN及其预测的代谢物，较低的Vd表明这些化合物主要局限于血浆中，而不是广泛分布在身体组织中。这与这种毒素的亲水性特征一致[16]。此外，值得注意的是，WHO为CYN制定的基于健康的指导值是基于肾脏损伤的。在这些条件下，即使清除率低，体内的总物质量也是有限的，这可能导致更快的消除和更短的半衰期。也计算了CYN及其预测代谢物的Vd；然而，由于获得的值极低，因此没有在图中显示。先前的研究试图表征CYN的动力学消除过程；然而，由于粪便排泄的变异性很大（范围从0.7到55.8%），这些研究的解释受到了限制。此外，这些研究依赖于使用放射性标记的毒素，而没有计算相应的药代动力学参数（清除率和半衰期）（Norris等人，2001年）。

体外结果显示CYN及其代谢物的致突变概率（图2G），这已在体外得到证实（Puerto等人，2018年）。这一发现与预测的致癌性（图2H）相反，后者表明CYN代谢物的毒性低于母体化合物。在其他毒理学终点方面，CYN及其代谢物诱导肝毒性、肾毒性和遗传毒性的潜力（图2I-K）相似，表明这些效应的发生不需要生物激活。相反，代谢物的神经毒性潜力（图2L）低于CYN，表明与神经毒性相关的解毒过程。已经确定CYN的尿嘧啶环结构对其毒性作用至关重要（Banker等人，2001年）。在我们的研究中，那些保持尿嘧啶环完整或仅表现出轻微修饰的代谢物（M3、M5、M6）似乎与增加的致突变活性相关，如Ames测试所示，或者在CYN的情况下保持了致癌性。相比之下，尿嘧啶环发生显著结构改变的代谢物在大多数评估参数中显示出明显的毒性降低。已经确定CYN可以在各种器官中发挥毒性作用（Chernoff等人，2018年）；然而，这些效应是否需要先前的生物激活尚不清楚。虽然一些遗传毒性和致突变性研究表明需要生物激活，但仍然缺乏确凿的证据（Puerto等人，2018年）。

在与三种不同微粒体（雄性大鼠、雌性大鼠和人类）孵育后，阳性对照（图3）证实了代谢混合物中存在的酶的最佳代谢活性。睾酮和7-羟基香豆素都表现出时间依赖性的减少。

图3
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大鼠（雄性和雌性）和人类肝脏微粒体中睾酮和7-羟基香豆素的代谢稳定性。数据表示为三次重复实验的平均值±标准差。

图4显示了CYN与三种不同微粒体在三种代谢反应条件下的浓度。尽管阳性对照显示出明显的代谢活性，但在I期反应中孵育2小时后，CYN仅减少了约8%。相比之下，在II期反应中，与葡萄糖醛酸和GSH孵育时观察到了约15%的减少。虽然先前的研究已经证明了这种毒素的高代谢稳定性（Kittler等人，2016年），但当前的研究结果与Plata-Calzado等人（2025年）在大鼠脑内暴露于CYN后的研究结果一致，他们发现CYN更容易发生第二相反应而非第一相反应，这很可能是由于其高亲水性所致。实际上，在本研究中，检测到的大多数代谢物都来自第二相反应。通过第一相酶对CYN的代谢激活在其代谢转化中似乎只起次要作用。然而，由于方法学上的限制（Kittler等人，2016年），也不能完全排除存在少量代谢（高达9%）的可能性。图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：在三种不同的微粒体条件下孵育CYN的代谢稳定性：a 第一相CYP-450；b 第二相葡萄糖醛酸化；c 第二相GSH结合。数据表示为三次实验的平均值±标准差。在本研究中，被代谢的CYN比例反映在表1中首次鉴定出的低浓度代谢物（M10–M27）上。这些代谢物大多数来自还原反应，而只有三种（M10、M15和M20）是通过氧化反应形成的。由于缺乏分析参考标准，只能进行定性表征。表1：使用雄性（MRLM）和雌性（FRLM）大鼠以及人类（HLM）微粒体进行体外CYN代谢后潜在的第一相代谢物的鉴定，通过UHPLC-MS/MS方法。全尺寸表格。关于第二相代谢，首次鉴定出的代谢物列在表2中。绝大多数代谢物来自氨基酸结合，其中半胱氨酸结合物尤为突出，可能来源于GSH结合。还检测到了与精氨酸、甘氨酸、牛磺酸和鸟氨酸的结合。此外，还观察到了与棕榈酰和硬脂酰等脂肪酸的结合。其他反应，包括甲基化、乙酰化和硫酸化也被识别出来，但这些似乎是较少使用的代谢途径。此外，还鉴定出了几种葡萄糖醛酸结合的代谢物（M70、M72和M73）。本体的体外结果证实了Plata-Calzado等人（2025年）已经在体内证明的甘氨酸和葡萄糖醛酸结合反应在CYN代谢中的重要性，尽管本研究中检测到的代谢物在结构上与这些作者鉴定出的不同。其中一些反应，如与甘氨酸、葡萄糖醛酸或硫酸化的结合，已经通过计算机模型预测过。然而，应该注意的是，从体外生物转化获得的质量有所不同，因为结合之前需要一个第一相反应，而这在计算机模型中并未预料到。表2：使用雄性（MRLM）和雌性（FRLM）大鼠以及人类（HLM）微粒体进行体外CYN代谢后潜在的第二相代谢物的鉴定，通过UHPLC-MS/MS方法。全尺寸表格。结果表明，在不同物种或性别之间没有显著的定量代谢差异，因为在所有测试的微粒体中（雄性大鼠、雌性大鼠和人类）三种不同的代谢反应中，被代谢的CYN比例是相似的。这表明CYN的整体代谢稳定性与其生物来源无关。然而，在检查具体生成的代谢物时，观察到了一些变异性。只有部分代谢物（特别是M11、M12、M43、M67和M75）在多种微粒体中一致被检测到，而其他代谢物似乎具有物种或性别特异性。这一发现强调了尽管没有观察到定量差异，但在定性水平上存在广泛的代谢可能性。CYN被认为是一种在淡水系统中相对持久的蓝藻毒素，并且据报道在环境相关条件下具有抗降解性（Kinnear 2010；Scarlett等人，2020）。我们研究中观察到的有限生物转化（8–15%）支持了CYN在吸收后可能仍然具有生物可利用性的观点，可能会导致长期的内部暴露。此外，多项研究报道了CYN在水生生物（如鱼类）以及用受污染的水灌溉的可食用植物中的积累（de la Cruz等人，2013；Duque等人，2025），突显了其在营养传递和人类暴露中的重要性。尽管关于生物放大的证据仍然有限，但环境持久性和代谢稳定性的结合强调了在长期暴露情况下考虑CYN的重要性。在本研究中，第二相代谢物中氨基酸结合物的主导地位表明CYN经历了与一般解毒机制一致的生物转化途径（Hodges和Minich 2015）。然而，需要先进行第一相还原的事实表明，在结合之前可能会产生中间代谢物，这些中间代谢物可能表现出不同的反应性或生物活性（Li等人，2011）。正如文献中所描述的，第一相激活与第二相结合之间的不平衡可能导致能够与细胞大分子相互作用的活性中间产物的积累，从而增加毒性（Pot?ga 2022）。计算数据和实验数据之间的差异突显了当前基于规则系统和训练数据集的计算机方法的公认局限性，这些方法可能无法完全捕捉酶的特异性、顺序代谢途径或生物系统中的生物转化复杂性。此外，这些工具通常在单个化合物的水平上操作，没有考虑混合物效应、酶竞争或辅因子的可用性，所有这些因素都可能影响代谢结果（Kar和Leszczynski 2019）。需要进一步的研究来探讨蓝藻毒素的不同生物转化途径及其代谢物在毒性中的作用。此外，还需要研究微生物代谢在CYN命运中的作用，这在自然条件下可能起着重要作用，正如其他蓝藻毒素的情况一样。例如，在MCs的情况下，已经确定了微生物降解途径，包括由Sphingopyxis sp.等细菌进行的环裂解，揭示了非酶促解毒机制的存在（Ding等人，2018）。事实上，也有研究表明在暴露于结肠细菌后CYN浓度有所下降，进一步表明了微生物代谢在其解毒中的重要性（Diez-Quijada等人，2020）。未来的研究应该进行这些途径的体内验证，研究微生物代谢的作用，以及与其他污染物的共同暴露对人类和环境健康的影响。结论：本研究首次通过结合计算机模拟ADMET方法和体外实验使用人类和大鼠肝微粒体，对CYN的代谢进行了综合评估。计算建模预测CYN的吸收、分布和CYP450介导的代谢有限，同时强调了潜在的结合途径和具有不同毒理学特性的代谢物的形成。补充的体外实验证实了CYN的高代谢稳定性，孵育后毒素水平仅略有下降（8–15%）。特别是葡萄糖醛酸化和氨基酸结合（第二相反应），包括半胱氨酸、甘氨酸、牛磺酸和精氨酸的作用比第一相氧化更为显著，导致多种新型代谢物的鉴定。尽管在性别或物种之间没有检测到显著的定量差异，但生成的代谢物的定性变异性表明存在多种可能的生物转化途径。总体而言，这项工作通过提供体外首次发现的结合代谢物证据，推进了对CYN毒代动力学的理解，并支持使用综合的计算机模拟和体外方法进行风险评估。