使用μ-Raman光谱和GC-MS技术来研究单个细胞水平与脂肪酸同位素水平上氘标记整合的异质性

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：μ-Raman and GC-MS to interrogate the heterogeneity of deuterium-label incorporation on the single cell vs. fatty acid isotopologue level

　　摘要
要理解微生物在整体生物分子和单细胞生物量水平上的代谢功能，需要精确追踪同位素的掺入情况。尽管已经建立了针对特定化合物和单细胞的稳定同位素探测（SIP）方法，但系统性的比较仍然缺乏。本研究对比分析了两种SIP方法：一种利用标记葡萄糖中的氘和重水通过气相色谱-质谱（FAME-GC-MS）追踪其掺入微生物脂肪酸的过程；另一种通过稳定同位素拉曼显微光谱（SIRM）追踪其掺入单细胞的过程。两种方法在Sphingomonas koreensis细菌样本中，无论使用何种（氘化的）底物以及不同浓度的D?O，都显示出了一致的氘掺入趋势。单细胞和脂肪酸的氘化水平在定量上相互支持。除了证明两组数据之间有很好的一致性外，还表明它们可以互补地提供信息。通过不同氘化程度的细胞簇，揭示了不同脂肪酸及其同位素异构体之间的异质性。此外，碳和氘来源的变化也影响了脂肪酸的组成和生物量的氘化程度。这项原理验证研究强调了脂质SIP和单细胞SIP方法的一致性和互补性，为未来关于微生物群落动态和有机底物生物降解的研究提供了基准。

图形摘要
该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。

引言
稳定同位素探测（SIP）通过追踪同位素标记的底物（例如13C或D）在微生物生物量或生物分子中的掺入情况，来表征微生物的代谢活动和功能，从而提供对微生物生理学和生态角色的见解[1,2,3,4,5]。在可能的情况下，这些测量结果可以与微生物的身份相关联。在不同的SIP方法中，针对不同的生物分子标记物来追踪底物中的同位素掺入过程。在核酸SIP中，通过检测DNA或RNA中的标记物可以确定降解微生物的身份[6,7,8,9]；而在蛋白质SIP中，通过分析蛋白质中的标记物来获取代谢活动的功能证据[10,11,12,13,14]。
脂质SIP专注于膜脂质，这些脂质可以包含系统发育信息，并提供对微生物生理状态的见解。与基于核酸的方法相比，脂质通常更容易提取和分析，并且需要较低的同位素富集程度。脂肪酸的同位素比值通常通过质谱法在提取特定脂质组分（如磷脂脂肪酸PLFAs或总脂肪酸）后进行量化。尽管它对个别微生物的特异性不如核酸SIP，但它非常适合研究活性微生物数量有限的复杂环境样本，或者分析具有特定生物标记脂肪酸的微生物（如甲烷氧化菌）。13C标记在脂质SIP研究中被广泛使用，因为它们能够直接探究中心碳代谢[15]。主要应用包括解析微生物对化能自养和基于甲烷的初级生产的贡献，包括在广泛环境中的甲烷氧化耦合自养[16,17,18,19,20,21]。此外，脂质SIP还被用于追踪微生物对植物来源碳[22, 23]以及人为碳源（包括除草剂[24]、碳氢化合物[25,26,27]和（微）塑料[28,29,30,31]的吸收。另一方面，氘标记提供了更广泛的底物选择、更低的成本和更低的天然同位素背景。通过施用D?O可以测量一般的微生物活动，并将其与追踪无机或有机13C标记在脂肪酸中的过程结合起来[32,33,34,35,36,37,38,39]。此外，Alexandrino等人使用苯乙烯-D?来识别生物过滤器样本中的活性苯乙烯降解菌，证明了氘化碳底物也可以作为脂质SIP研究的标记源[40]。在其他研究中，还使用脂质SIP分析了生物过滤器中己烷-D??[41]和沉积物微宇宙中普里斯烷-D??[42]的降解过程。
除了针对不同生物分子标记物的SIP方法外，还有研究生物量SIP的方法，这些方法调查底物标记物在整体生物量或单个微生物细胞中的吸收情况[4, 43, 44]。最常见的单细胞SIP（SC-SIP）方法是纳米级二次离子质谱（nanoSIMS）和稳定同位素拉曼显微光谱（SIRM），后者可以解析微生物群落内的异质性。nanoSIMS具有高达50纳米的质量分辨率和空间精度，并可以同时分析多种元素（如H、C、N和P）的同位素。这种方法已被用于研究不同的生物地球化学过程（参见[45]的综述）。然而，nanoSIMS仅适用于干燥样本，需要繁琐的样本制备过程且成本较高。相比之下，SIRM是一种非破坏性方法，样本制备和测量更加简单快捷，也可以用于水样，并具有高达1微米的空间分辨率，足以分辨单个微生物细胞。缺点是在自荧光样本中的干扰以及缺乏关于化学组成的精确信息，因为振动光谱仅提供化学指纹（参见[46, 47]的SIRM综述）。最常用的标记物是13C，与拉曼显微光谱结合使用，直接或通过反向标记追踪有机[48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58]或无机[59,60,61]底物中的碳。此外，D标记以D?O的形式应用，用于测量一般的代谢活动，例如对抗生素处理的响应[62,63,64,65,66,67,68]。为了研究特定代谢途径，D?O可以与未标记的碳底物结合使用[69, 70]。或者，也可以使用氘化碳底物（例如葡萄糖和萘[51, 69, 71, 72]、脂肪酸[73,74,75]或（微）塑料[76]）。SC-SIP方法的常见应用包括研究细胞代谢、不同条件下的微生物活性、揭示营养限制或环境波动下的表型异质性，以及研究微生物群落中的共生相互作用和交叉喂养[4]。虽然SC-SIP方法不提供分类学信息，但它们可以与其他方法（如荧光原位杂交FISH）结合使用，以建立表型和基因型之间的联系，或与微流控技术结合用于细胞分选和后续的基因组分析[49, 54, 60, 62, 63, 77,78,79]。
追踪从底物到特定代谢物（即脂肪酸）再到同一群体中单个细胞的稳定同位素标记物，可以在不需要校准的情况下测试相应方法的稳健性和一致性。此外，不同分析尺度（从整体测量到单个代谢物再到单个细胞和总生物量）的方法之间的潜在差异可以突出这些方法的互补性。然而，这些方法在不同分析尺度上的系统比较仍然缺乏。
尽管Stiebing等人之前将SIRM与脂肪酸甲酯气相色谱（FAME-GC）结合使用，但他们的研究关注的是不同的研究问题[73]。他们的重点是展示空间分辨的拉曼成像和整体FAME-GC在监测脂肪酸分布方面的互补价值。为此，他们追踪了巨噬细胞中氘化外源脂肪酸的吸收和储存情况，而不是研究底物利用和代谢活动。
Kukal等人发表了另一项将脂质SIP与振动光谱结合的研究[80]。他们追踪了葡萄糖-D?和D?O中的氘进入酵母样本和整体生物量中的三酰甘油，而不是单个细胞。他们使用了红外（IR）和拉曼光谱来确定生物量的氘化程度，显示出相似的定性趋势。然而，绝对值存在显著差异：C-H和C-D伸缩带下的面积比，分别代表生物量的氘化程度，IR的结果为0.5 ± 0.1，而拉曼测量的结果为3.03 ± 1.09。这突显了需要将光谱生物量数据与FAME-GC-MS数据进行定量交叉参考的必要性，但他们的出版物中没有提供这一点。因此，我们的目标是通过不同拉曼带的比率量化来自不同来源的D标记掺入单个细菌细胞的情况，并通过单离子追踪量化脂肪酸中的D标记掺入情况。这种方法可以区分色谱图中的重叠脂肪酸峰，并为与单细胞拉曼数据进行定量比较提供同位素异构体分布。
我们当前研究的主要目的是评估将两种成熟的、正交的SIP技术——SIRM和FAME-GC-MS——结合成一个统一的方法是否能够相互验证氘化水平和比例，并评估其协同价值。具体来说，我们通过分析Raman数据中的异质性来研究Sphingomonas koreensis的细菌生理学，以确定是否可以获得有关活性和非活性细胞以及细胞代数的信息。我们还比较了FAMEs的标记模式并分析了它们的氘化同位素异构体。此外，我们使用这两种方法研究了细菌活性和细胞脂肪酸谱型对不同碳底物（葡萄糖或乳酸）和氘源（D?O或葡萄糖-D??）的反应。

材料与方法
**Sphingomonas koreensis与不同非氘化/氘化底物的培养**
除非另有说明，所有化学品和材料均从Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）和Sigma-Aldrich（德国Steinheim）购买，并在120°C下高压灭菌用于培养实验。所有打开小瓶的培养和样品制备步骤都在层流罩（Stella Air, 4 more Labor, Zefa Group, Harthausen, Germany）中进行，以防止微生物污染。所使用的细菌菌株之前是从水中的老化聚乳酸悬浮液中分离出来的[48]，16S rRNA基因测序（SepsiTest? Blast, Molzym）显示其与Sphingomonas koreensis的序列同一性为98.9%，表明它们具有密切的系统发育关系。尽管这种同一性水平不足以明确物种级别的鉴定，但为了简便起见，这里将其称为S. koreensis。对于所有实验（见表1），细胞在优化的最小培养基（MM）中生长，盐浓度与[48, 76]中的相同，补充了D-葡萄糖、D-葡萄糖-D??（97原子% D，Santa Cruz Biotechnology，美国）或L-乳酸钠和0%、80%或96% D?O（99.9原子% D）。为了确保细菌已经适应了D-葡萄糖或L-乳酸作为碳源，它们在含有相应底物的MM中预培养了3天。

**表1** 实验包括以下碳底物和氘源的组合

**为了在不同碳源的培养基中实现一致的D?O浓度**，首先制备了不含D?O的培养基、含有80% D?O的培养基或含有96% D?O的培养基，然后将其分成5毫升的等分样品，用于各种实验。之后，向各自的子样本中加入110微升1摩尔/升的D-葡萄糖、D-葡萄糖-D??（97原子% D，Santa Cruz Biotechnology，美国）或L-乳酸钠溶液。在葡萄糖或乳酸上预培养的细菌悬浮液被洗涤（在4500转/分钟和4°C下离心10分钟，去除上清液，并将细胞沉淀重新悬浮在5毫升无有机碳的MM中，以去除未氘化的C底物）。获得的无有机碳细胞悬浮液被分成不同的D源和比例的组分（见表1），然后用相应D?O比例的MM再次洗涤。然后向每个实验中加入200微升的细胞悬浮液（样品包含5毫升不同D?O比例的MM加上110微升的碳源溶液）。充分混合后，每个样本取150微升三重复样，放入无菌微孔板中，使用BioTek Synergy HT微孔板读数器（Agilent Technologies，美国）测定600纳米处的光密度（OD600值）。OD600值在扣除空白值后范围为0.05至0.07。样品在带有盖子的15毫升离心管中，在32°C和120转/分钟的摇床培养器中培养。4天后，所有样品在层流罩中轻轻摇晃通风，已经观察到明显的生长。6天后，进行OD600、SIRM和GC-MS测量。

**稳定同位素拉曼显微光谱测量**
在完成OD600测量后（按照上述相同程序），将150微升的子样本重新组合并准备进行SIRM测量。为此，细胞在4500转/分钟和4°C下离心3分钟以形成沉淀。细胞沉淀在800微升MilliQ水中洗涤两次，最后在500微升MilliQ水中重新悬浮。每个样本的三个1微升稀释液（1:100）滴在铝涂层玻璃载玻片（EMF Dynasil，美国）上，并在室温下干燥。使用波长为532纳米的绿色频率加倍Nd:YAG激光，在WITEC alpha300自动共聚焦拉曼显微镜（Oxford Instruments，乌尔姆，德国）上获取拉曼光谱。测量过程是自动化的，使用了WITec公司的ParticleScout软件，并设置了以下参数：样品处的功率为8毫瓦（mW），在“Optimize fast”模式下最多进行15次累积测量，每次积分时间为0.5秒；信号强度设置为低水平（50），信噪比为110；光谱自动对焦范围为-3至3（0.05, 1）。该仪器配备了一个300克每平方毫米（g mm^-1）的衍射光栅和100倍物镜（Zeiss EC Epiplan-Neofluar，数值孔径NA=0.9，工作距离WD=1毫米，Zeiss公司制造，德国）。

**光谱处理与氘代程度的计算**
用于处理光谱并计算氘代程度和比例的Python脚本是由作者使用AI语言模型ChatGPT（OpenAI）编写的，其中包含了一些小的代码片段和对数据结构的说明。所有代码均由作者独立验证、测试并整合，作者对其正确性和功能性负责。代码的详细结构附在支持信息（SI）中。简而言之，单细胞拉曼光谱的预处理包括基于每日硅晶圆测量的波数校正、使用Savitzky-Golay滤波器进行平滑处理、采用对统计敏感的非线性迭代峰值裁剪（SNIP）算法进行基线校正，以及归一化到C-D和C-H伸缩振动积分值。C-D和C-H伸缩振动的带面积是通过拟合光谱得到的五个高斯函数的总和来计算的，而C-D/(C-D + C-H)带面积的比值用于描述单细胞的氘代程度。

**图1**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**模型示意图**
用于描述未氘代饱和脂肪酸（FAMEs）、部分氘代饱和脂肪酸、未氘代不饱和脂肪酸以及部分氘代不饱和脂肪酸的质量谱。图中示意性地展示了三种氘代FAMEs的D同位素结构（蓝色、红色和绿色），尽管在我们的实验中观察到了多达14种同位素结构。

**脂肪酸甲酯的生成与提取**
剩余的4.1毫升样品用于FAME-GC-MS分析。为此，将细胞在4500转每分钟（4500 rpm）和4摄氏度（4°C）的条件下离心10分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀转移到带螺旋盖的1.5毫升玻璃小瓶中，并用铲子压碎以增加表面积。随后将其冷冻干燥并储存在-27摄氏度（-27°C）下直至使用，得到0.7至2.7毫克的细胞沉淀。为了将脂肪酸甲基化为甲酯，向每个冷冻干燥的细胞沉淀中加入500微升3摩尔浓度（3 M）的盐酸（HCl）。轻轻摇晃样品以使细胞沉淀悬浮在甲醇中，然后短暂打开瓶盖以平衡压力。衍生化过程在连接排风系统的通风烤箱中进行，温度为85摄氏度（85°C），持续时间为2小时。需要注意的是，在衍生化过程中压力会增加，这可能导致瓶盖破裂，因此瓶盖没有拧紧；通过添加更多的甲醇中的盐酸来平衡蒸发损失。衍生化完成后，样品在室温下的温和氮气流中干燥。FAMEs用100微升干燥己烷提取。充分混合后，每份样品取80微升转移到玻璃GC小瓶中用于测量。

**气相色谱-质谱测量**
FAME分析使用的是配备5979C三轴检测器（Agilent Technologies，美国）的Agilent 7890A GC系统。每个样品进行三次10微升的注入，每次注入使用PAL自动进样器（CTC Analytics AG，瑞士），从而每个样品获得三次测量结果。进样器以5:1的分流比运行，分流速率为5.5毫升每分钟（5.5 mL min^-1），温度维持在260摄氏度（260°C），压力为1.0巴（1.0 bar），总流量为9.6毫升每分钟（9.6 mL min^-1），隔膜清洗流量为3毫升每分钟（3 mL min^-1）。目标分析物的分离是在Rxi? 5ms柱上进行的（柱长30米，内径0.25毫米，膜厚度0.25微米；Restek，美国），氦气流速恒定为1.1毫升每分钟（1.1 mL min^-1）。柱子前后均装有失活的熔融石英保护层（内径0.25毫米；Agilent Technologies，美国），柱后温度在整个分析过程中保持在250摄氏度（250°C）。GC oven的程序设置如下：初始保持温度为150摄氏度（150°C）3分钟，然后以每分钟3摄氏度（3°C min^-1）的速率升温至231摄氏度（231°C）并保持1分钟，接着以每分钟15摄氏度（15°C min^-1）的速率升温至300摄氏度（300°C）。离子化使用高效源（HES）在70电子伏特（70 eV）下进行，离子源温度设定为230摄氏度（230°C）。四极杆温度设定为150摄氏度（150°C）。每个样品在5分钟的溶剂延迟后记录三次全扫描光谱（质量范围200–350）。

**GC-MS数据分析**
本研究仅包括了最丰富的C16和C18脂肪酸的甲酯，具体为C16:0、C16:1、C18:0、C18:0-OH以及两种C18:1异构体（分别标记为C18:1a和C18:1b），它们具有不同的保留时间。这些异构体是通过全扫描质谱识别出来的，其特征是m/z = 74处的McLafferty离子。对于详细的同位素分析，我们关注了饱和FAMEs的[M]+离子，以及不饱和FAMEs的[M-31]+、[M-32]+（在氘代情况下还包括[M-33]+离子）（详见SI，图S1，其中包含脂肪酸及其相关片段的结构式）。此外，所有含有一个13C原子的同位素结构也被纳入分析范围（见图1）。

**图2**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**数据解释**
(a) 生物量的氘代程度是通过每个单细胞拉曼光谱中C-D振动带面积与C-D和C-H振动带面积之和的比值来计算的。平均光谱是所有细胞的平均值，包括未氘代和氘代的细胞。
(b) 与不同底物共培养的n个S. koreensis细胞的平均拉曼光谱：葡萄糖，n=47；含80% D2O的葡萄糖，n=75；葡萄糖-d12，n=98；含96% D2O的葡萄糖-d12，n=101；乳酸，n=57；以及含80% D2O的乳酸，n=91。拉曼光谱经过归一化，以C-D（1960–2400 cm^-1）和C-H（2800–3030 cm^-1）区域的面积之和为基准。

使用Agilent GC-MS系统获得的数据通过Lablicate（德国）软件转换为.mzML文件，然后使用ProteoWizard的MSExportGUI [81]转换为.txt文件。数据分析和可视化是通过作者开发的Python脚本完成的。对于部分代码，咨询了AI语言模型ChatGPT（OpenAI）。作者亲自验证、测试并整合了所有代码，并对其准确性和功能性负责。数据处理和分析工作流程的详细描述见SI。简而言之，针对特定保留时间范围内的梯形积分值进行了计算，以确定未氘代FAMEs的丰度以及感兴趣的氘代FAMEs的手动确定的质量轨迹。根据SI中的描述，构建了带有约束条件的线性最小二乘问题，并使用SciPy中的lsq_linear算法进行求解，以解卷积不同D同位素结构的贡献。

**结果与讨论**
**基于拉曼光谱计算的生物量氘代程度**
在拉曼显微光谱中，激光束聚焦在一个单独的细胞上，激发细胞内所有生物分子的振动，从而得到整个生物体的光谱。这导致许多重叠的拉曼带。微生物的拉曼光谱可以分为指纹区域（最高1700 cm^-1）、C-H振动区域（2800–3100 cm^-1）以及中间的拉曼沉默区域（见图2a，下图为单个细胞光谱）。伸缩振动的频率与振动原子的折合质量的平方根成反比。因此，D与H之间的相对质量差异较大，导致C-H伸缩振动显著移动到通常为拉曼沉默的区域。因此，在氘代细胞中可以观察到频率范围为2000–2350 cm^-1的红色移位C-D振动（见图2a，上图为单个细胞光谱）。

**单细胞氘代程度的计算**
单细胞的氘代程度通常通过C-D/(C-D + C-H)伸缩振动的带面积比值来计算。图2a展示了与葡萄糖和80% D2O共培养的细胞的氘代程度分布示例，而其他所有样本的分布数据在图4中讨论。由于噪声和背景增强，代谢不活跃的细胞（见图2a中数据点的下框）可能显示高达6%的名义氘代程度（如图2a中的细胞373所示）。代谢活跃的细胞（见图2a中数据点的上框）显示出强度不同的C-D拉曼带。图2b显示了使用不同底物（乳酸或（氘代）葡萄糖）和不同D2O含量培养的代表性细胞数量的平均光谱，即每次培养47–57个S. koreensis细胞的平均光谱（无氘源）和75–101个细胞的平均光谱。这些光谱表明，所有暴露于氘源的细胞都吸收了氘，其中葡萄糖-d12中的氘掺入量最少，而葡萄糖-d12和D2O组合中的氘掺入量最多。

**脂肪酸的保留时间**
同一样本中不同脂肪酸的甲酯（FAMEs）根据其保留时间进行色谱分离。图3a–c展示了三个样本中C16:0 FAME的未氘代和氘代类似物的色谱图。在所有三个样本中都出现了16.64分钟的峰，该峰归属于未氘代的C16:0。在含有D源的样本的色谱图中（见图3b、c），在更短的保留时间出现了额外的宽峰。根据质谱信息，这些峰可以归属于氘代类似物，其保留时间与氘代程度相关。其背后的原理是C-D键比C-H键短，物理性质发生变化（如范德华力），导致具有更多C-D键的同位素结构具有更高的蒸气压和更早的洗脱时间[82]。这反映在图3b/c中显示的单质量轨迹上，代表了氘代C16:0的色谱峰。通过这些不同氘代同位素的质量轨迹进行解卷积是评估脂肪酸谱中标记掺入异质性的关键。

**图3**
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(a–c) 图中展示了S. koreensis分别与（a）葡萄糖、（b）葡萄糖-d12和（c）80% D2O共培养的样本中C16:0 FAME的同位素结构在16.00至16.75分钟范围内的色谱图部分。m/z = 270–303的单离子轨迹显示了所有可能的C16:0同位素结构。感兴趣的单离子轨迹用不同颜色标出。
(d) 基于图c的数据，构建了氘代C16:0 FAME同位素的质量谱。灰色显示的测量强度叠加了通过计算得出的[M]+（着色）和[M+1]+（带条纹着色）离子的贡献强度。
(e) 对图d中获得的D同位素分布拟合了二项式分布。
(f) 图e中二项式分布的氘代概率与强度最强的m/z（m/z = 289，61% D）的氘代程度进行了比较。

**D同位素结构的解卷积**
在讨论FAME的氘代程度时，我们将测量的m/z值与不同氘代程度的同位素结构相关联。每个分子质量为M的D同位素结构可以通过裂解产生不同的离子。我们考虑了以下诊断离子：[M]+（饱和FAMEs）；[M-31]+、[M-32]+（不饱和FAMEs，在去除一个甲氧基后产生的片段）以及[M-33]+（在去除一个甲氧基和一个氢原子后产生的片段）；以及[C18:0]-OH的[M-113]+（在去除C8H17后产生的片段，见SI，图S1）。此外，每个离子都包含一个13C原子（基于13C的自然存在）。因此，我们总结了具有相同氘代程度的离子的强度，包括图3d中带虚线的离子和图3d中实线的离子。例如，如果我们观察C_{16:0}色谱峰中的质量289（见图3d），它由含有19个D原子（289-270 = 19）且不含^{13}C原子的D同位素体（浅粉色条形）和含有18个D原子和1个^{13}C原子的D同位素体（阴影棕色条形）组成。为了计算含有19个D原子的D同位素体的丰度，我们将属于不含^{13}C原子的D同位素体（质量289，浅粉色条形）和含有1个^{13}C原子的D同位素体（质量290，阴影粉色条形）的份额相加。用于解卷积这两种贡献的自编算法如图3d所示，在“材料与方法”部分有进一步的解释。当这两个离子的估计强度相加后，得到了图3e中显示的D同位素体分布。它类似于二项分布，其中C_{16:0} FAME中的每个31个H原子的脱氢概率为62%。

图4
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通过SIRM测定的单个S. koreensis细胞的生物量脱氢程度与从质谱计算出的整个群体中不同FAME同位素体的脱氢程度进行了比较。质谱数据的圆圈大小基于积分大小。所有离子计数低于定量限的同位素体都以相同的大小显示。十字表示每种脂肪酸的平均脱氢程度。需要注意的是，C_{18:0}-OH的D脱氢程度的解释，因为它是从[M-113]^+离子计算得出的，而这是一个更小的片段，因此可能会导致更大的不确定性。

虽然对于仅含有[M]^+和[M+1]^+离子的饱和脂肪酸的甲基酯，D同位素体的解卷积过程相对简单，但对于不饱和脂肪酸来说则更为复杂，因为需要考虑更多的碎片离子（见图1），且强度可能低十倍。尽管如此，我们仍然成功地解卷积了S. koreensis与乳酸和D_{2}O共培养的样品中C_{16:1}的D同位素体分布（该样品的信噪比最高；见支持信息（SI）图S2 + S3）。我们的拟合结果显示，这是一个二项分布，其中n = 29个H原子，脱氢概率为65%。这个脱氢概率与同一样品中C_{16:0}的计算值68%非常接近。两者之间的差异相当于两个D原子，这可能可以通过脱饱和过程来解释。然而，要得出这样的进一步结论，需要具有更小标准差的生物学重复实验。

相比之下，其他FAME的信噪比太低，无法进行同样可靠的解卷积。因此，我们采用了一种简化的方法来描述脱氢程度。基于图3f的观察结果，即解卷积后的D同位素体分布与二项分布高度吻合，我们决定使用中位D同位素体来估计脂肪酸的脱氢程度。以图3d中的C_{16:0}为例，强度最大的m/z值（即分布的模式）是289。未脱氢的FAME的质量为270，这意味着在最丰富的峰中，31个氢原子中有19个被脱氢，即脱氢程度为61%。如图3f所示，从模式（61%）简化估计的脱氢程度与从二项D同位素体分布计算出的脱氢程度（62%）非常接近。简化模型对不饱和脂肪酸（见C_{16:1}）也给出了很好的吻合（SI，图S4显示了所有样品的简化D脱氢程度）。因此，我们提出这种简化方法作为一种方便的方法，前提是未来的研究中也存在二项分布。

补充的μ-Raman和GC-MS分析
在图4中，我们总结了Raman（即SIRM）和GC-MS（FAME）的数据。在不同底物上生长且来自不同D源的样品用不同的颜色表示。通过SIRM测定的未添加D源的细胞的生物量脱氢程度以灰色显示（S.k.+葡萄糖和S.k.+乳酸）。对于所有其他样品，SIRM数据与相应的不同脂肪酸的FAME-GC-MS数据一起呈现。x轴上的第一类样本标记为“细胞”，代表单个细胞的SIRM数据，接下来的五类样本分别用脂肪酸（C_{16:0}、C_{18:0}、C_{18:0}-OH、C_{16:1}和C_{18:1b}命名，这些脂肪酸通过GC-MS表征为微生物细胞的批量样品的甲基酯衍生物。所有SIRM数据点的大小相同，因为每个数据点代表一个单细胞的平均脱氢程度。不同的未脱氢、部分脱氢和完全脱氢的生物分子（例如脂肪酸、蛋白质和DNA）都可以贡献到SIRM测量的脱氢程度中。相应的FAME-GC-MS数据以不同大小的圆圈表示，代表每种脱氢脂肪酸的不同D同位素体的相对丰度，如图3中所推导的。对于强度太低的FAME峰（C_{16:1}和C_{18:1b}），无法可靠地计算其D同位素体的强度。因此，仅使用质量来确定每个同位素体的脱氢程度，所有圆圈的大小相同（有/无信息），尽管可以预期存在二项分布。我们注意到，相对丰度（圆圈大小）应该仅在给定脂肪酸的同位素体分布内进行比较，而不应在不同的FAME之间进行比较。原因是我们没有校准以校正不同的FAME特异性GC-MS响应因子，从而考虑离子化效率、碎片强度和当天仪器性能的影响。

Raman和GC-MS分析相互验证了彼此的结果
图4显示，这两种方法都能以显著的一致性表征细胞和脂肪酸同位素体中的氘掺入情况。在D_{2}O存在下，生长在葡萄糖-d_{12}上的细胞观察到最高的脱氢程度，而在葡萄糖-d_{12}上生长且在两种方法下生长的细胞观察到最低的脱氢程度。在D_{2}O存在下，生长在未标记葡萄糖上的细胞的细胞和脂肪酸的脱氢程度略低于在D_{2}O存在下生长在乳酸上的细胞。

SIRM和FAME-GC-MS数据都显示出双峰模式，值在零脱氢程度处累积，然后在更高的脱氢程度处再次累积，这两个范围之间有一个间隙。上层簇显示出一个内部结构，可能包含子簇，这一点将在后面详细讨论。氘的掺入可能发生在新生物分子的从头合成过程中，或者发生在不导致微生物生长的代谢过程中（例如，糖酵解后跟着脂肪酸合成）。因此，我们得出结论，未标记的细胞既不会生长也不会具有代谢活性。相反，脱氢的细胞可以被解释为正在生长或具有代谢活性。

正如预期的那样，我们观察到未脱氢脂肪酸的比例高于未脱氢细胞的比例（即见图4中在D_{2}O存在下生长在乳酸上的样品，呈紫色），因为未脱氢的生物分子可以同时存在于未脱氢和脱氢的细胞中。出于同样的原因，脱氢脂肪酸的脱氢程度高于脱氢细胞，因为脱氢细胞可能由脱氢和未脱氢的生物分子（脂肪酸、蛋白质、DNA等）混合组成。此外，这一推理还得到了以下观察结果的强化：Raman数据点内的细胞脱氢程度平均值（见图4）位于每个样品中不同脂肪酸的平均脱氢程度范围内（也标记为十字）。

因此，μ-Raman和GC-MS数据相互支持。然而，图4也揭示了一些细微的差异，这些差异包含了关于单个细胞水平上标记异质性的额外信息；这些异质性表现在不同分子结构上的脂肪酸之间（在C_{18:1a}和C_{18:2}中最为明显，这些脂肪酸完全没有脱氢，数据未显示），以及FAME-GC-MS所指示的同位素体之间的异质性（即同位素体分布的扩散），这将在后面详细讨论。

单细胞脱氢程度揭示了表型异质性，并暗示了每个样品内不同细胞代际的存在
每个实验中单细胞生物量脱氢的变异性表明了S. koreensis细胞在代谢活性方面的表型异质性。虽然我们知道单细胞脱氢程度取决于细胞的生长状态及其代谢活性，但在这里，我们暂时基于这样一个假设进行计算：具有不同平均脱氢程度的细胞簇主要代表不同的细胞代际。以光密度作为细胞生长的独立补充指标，我们观察到在80% D_{2}O存在下生长在葡萄糖上的样品的OD600增加了433%，其中+300%代表第三代，+700%代表第四代（见SI，图S5）。我们假设在这个样品中，大部分标记发生在细菌生长的背景下，而通过其他代谢活动的D掺入可以忽略不计。

图4显示了在80% D_{2}O存在下生长在葡萄糖上的三个细胞簇（橙色数据点）：一个代表未脱氢细胞，第二个显示细胞脱氢程度约为30%，第三个约为45%。脱氢脂肪酸的比例（橙色圆圈）显示脱氢程度约为60%。如果考虑二元细胞分裂，一个细菌细胞必须将其生物分子加倍才能产生两个等效的细胞。假设所有从头合成的生物分子的脱氢程度与脂肪酸相似（约为60%），并且细胞在分裂前由50%的初始未脱氢生物量和50%的从头合成的脱氢生物量组成，我们可以预期第二代细胞的生物量脱氢程度为30%。如果这些细胞再次分裂，第三代细胞的生物量脱氢程度应为（30%+60%）/2 = 45%。这两个值与两个簇相符，支持了我们关于不同细胞代际的假设。

同样，与乳酸和80% D_{2}O共培养的S. koreensis细胞样品（紫色数据点）也显示了两个簇，但其脱氢程度高于葡萄糖样品。这与该样品中脂肪酸的脱氢程度升高是一致的。

有趣的是，在D_{2}O存在下生长在葡萄糖-d_{12}上的群体中没有观察到不同的簇，表明不同的代际。尽管这个实验显示了最慢的细胞生长（见SI，图S5中的OD600值），但它产生了最高的细胞和FAME脱氢程度（见图4）。鉴于这一观察结果的模糊性，我们提出了两个可能的解释。（a）细胞需要适应培养基中的高D含量。一旦适应，细胞就会持续生长，并且都属于同一代。（b）细胞最初无法在高度脱氢的培养基中生长，但仍然具有代谢活性。由于培养基中的高D含量，这些细胞已经被强烈标记。在适应新的生长条件后，已经标记的细胞复制，导致不同代际的脱氢程度向更高的值移动并重叠。这也解释了尽管细胞生长缓慢，但仍存在大量脱氢细胞的现象。

脂肪酸的脱氢程度在不同同位素体之间有统计学上的差异，并且根据分子结构而有所不同
虽然细胞脱氢程度被认为可能反映了细胞分裂的次数，但脂肪酸的脱氢程度是由生物合成过程而不是生长动态决定的。具体来说，它们取决于D源在脂肪酸生物合成过程中的掺入方式以及相关的动力学同位素效应。由于我们在一个样品中观察到不同脂肪酸的不同脱氢程度的同位素体，并且这些分布遵循二项行为，我们可以假设每次潜在的D掺入事件都是以一定的概率独立发生的。从葡萄糖-d_{12}和96% D_{2}O共培养的细胞中提取的脂肪酸的同位素体分布最窄，因为它们的脱氢水平接近上限（100%），这本质上限制了数据的可能分布范围。

图5
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饼图显示了S. koreensis在与不同底物共培养时的脂肪酸谱型变化。百分比表示每种脂肪酸中氘代（虚线区域）和非氘代（实线区域）同位素异构体的总和丰度，这些数据是在每个样本中的所有脂肪酸中测得的，并未经过标准验证。因此，实际的脂肪酸谱可能有所不同，图表仅用于比较变化，例如，在含有葡萄糖和80% D?O的样本中C??:?a的比例较高。以下离子的质量谱被选用来描述相应的脂肪酸：[M]?代表C??:?（蓝色）和C??:?（绿色）；[M-31]?、[M-32]?和[M-33]?代表C??:?（橙色）、C??:?a（紫色）、C??:?b（棕色）和C??:?（粉色）；[M-113]?代表C??:?-OHC??:?，它通常被认为是大多数其他脂肪酸生物合成的基础。因此，可以预期从C??:?通过链延长、去饱和或氧化形成的脂肪酸具有相似的氘代程度。这可以在图4和补充信息图S4中看到，其中C??:?、C??:?、C??:?和C??:?b在每个样本中的氘代程度变化很小。根据这些差异，可以计算出在去饱和反应过程中移除了多少D或H原子。然而，由于我们实验中这些化合物的信噪比较低，我们放弃了这种解释。虽然从头合成的脂肪酸显示出与C??:?相似的氘代程度，但我们注意到C??:?a和C??:?是例外，它们在所有样本中都没有显示出氘代，因此在我们实验中没有从头合成。

氘源和碳底物影响氘代程度

除了样本中细胞和FAME的氘代程度观察到的变化外，氘代程度还受到氘源和碳底物类型的影响。为了讨论氘源如何影响脂肪酸的氘代程度，我们关注C??:?，因为它是一种核心脂肪酸，并且由于其在整个样本中始终较高的氘代比例而成为D同化的指标（见图5）。在脂肪酸从头合成过程中，质子来自水、碳源和其他代谢物。因此，脂肪酸的氘代概率取决于培养基中D?O的比例以及碳源和其他代谢物中的氘含量。

在我们的实验中，我们使用了D?O、葡萄糖-D??以及两者的混合物来确定它们对脂肪酸合成过程中氘代程度的影响（见图4）。然而，我们没有测量生物学重复实验，所以无法确定不确定性。在葡萄糖上生长的S. koreensis大约从培养基中以水的形式获取了78%的氢原子用于脂肪酸生物合成。这个估计是基于在含有80% D?O的葡萄糖培养基中C??:?的平均氘代程度为62%（橙色数据的二项分布；62%的氘代C??:?/80%的D在培养基中=78%）。此外，脂肪酸中的18%的氢来自葡萄糖，这是通过葡萄糖-D??孵育的FAME氘代确定的（图4中的绿色数据）。因此，水和葡萄糖共同占用于脂肪酸合成的氢的96%。剩余的4%可能来自其他代谢物（如NADPH），这些代谢物是在引入D之前形成的，或者来自未标记的死亡细胞。此外，动力学同位素效应可能会降低从水中吸收的D，因此我们会低估来自水的氢的贡献。尽管如此，根据这些计算，我们可以估计在葡萄糖-D??和96% D?O培养的细胞中氘代的预期值，并将其与观察到的值（图4中的红色数据）进行比较，以得出我们误差的数量级。对于C??:?，预期值为93%（78%的氢原子来自水×96%的D在培养基中+18%的氢原子来自碳源×100%的D在葡萄糖中），这与观察到的氘代概率98%（图4中的红色数据）相当。考虑到我们比较的是在三种不同环境中生长且生长速率不同的群体所获得的值，这两个值非常吻合。

此外，碳底物似乎也影响脂肪酸的氘代程度和活性、氘代细胞的比例。这可能是基于不同的活性代谢途径。因此，我们观察到在含有80% D?O的葡萄糖上生长的细胞的脂肪酸和细胞氘代程度略高于在乳酸上生长的细胞（见图4）。此外，对于在葡萄糖（葡萄糖+D?O）上生长的群体，47个测量细胞中有40个是氘代的=85%；在葡萄糖-D??上生长的群体，62/75=83%（通过单细胞光谱视觉确定）；在葡萄糖-D?O+D?O上生长的群体，83/101=82%；而在乳酸作为另一种碳源的群体上生长的群体，这一比例显著不同（乳酸+D?O，90/91=99%）。

生长条件调节脂肪酸谱

我们分析方法的价值不仅在于分析细胞和脂肪酸氘代的异质性，还在于从不同脂肪酸组成中得出的结果，如下所述。根据氘源（D?O和葡萄糖-D??）和碳底物的不同，观察到了不同的脂肪酸丰度。由于没有进行校准，我们只能对代表不同生长条件的同一脂肪酸进行定量比较，而不能对同一实验中的不同脂肪酸进行比较。尽管如此，图5的数据表明，脂肪酸的产生或积累程度不同，从而导致饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的相对比例也发生变化。已知细菌会调节脂肪酸的生物合成，以适应膜的属性，如化学稳定性、硬度和通透性，或将饱和脂肪酸作为能量来源储存。因此，分析不同的脂肪酸谱及其氘代程度对于未来研究包括生物学重复实验具有很大的潜力。它还可以作为寻找未来研究合适生物标志物的指南。例如，C??:?-OH显示出一致的较高氘代比例，特别是在使用D?O作为D源的实验中。

结合拉曼和GC-MS的方法可以帮助基于脂肪酸的氘代来解释拉曼谱带

基于图4，我们展示了单细胞拉曼和批量脂肪酸数据如何很好地对齐并相互补充。在这里，我们更进一步探讨FAME-GC-MS测量是否可以帮助根据脂肪酸的氘代程度来限制先前出版物中假设的拉曼C-D伸缩带的分配。在一项研究中，S. koreensis在氘代聚乳酸（微塑料）颗粒上生长[76]，除了常见的氘代脂质、蛋白质和DNA谱带外，还发现了一个额外的C-D拉曼伸缩带，位于2068 cm?1。假设这个额外的带对应于强氘代脂质（例如，末端CD?）的C-D振动。因此，我们探讨了通过GC-MS进行脂肪酸分析的机会，除了SIRM之外，以更深入地讨论这个拉曼带。

我们只在平均脂肪酸氘代程度至少为60%的样本中检测到了2068 cm?1的拉曼带（见图2b）。（例如，在含有乳酸和D?O的S. koreensis样本中，C??:?的氘代程度为68%。）假设分子中的31个氢位置中有21个被随机替换为氘（氘代程度为68%），那么末端甲基组的三个氢原子都被氘代的概率是30%，这是由超几何分布给出的（“无放回抽样”）。相比之下，在葡萄糖-D??样本中，C??:?的氘代程度为18%，CD?组的概率仅为0.4%。因此，如果2068 cm?1的拉曼带代表脂质中末端CD?组的强拉曼活性C-D伸缩振动，这将解释为什么在葡萄糖-D??样本中看不到这个带。

此外，由于CD?组的对称性和极化率高于CD?组，CD?组的C-D伸缩振动应该具有更高的拉曼活性。实际上，我们观察到的2068 cm?1拉曼带的强度高于从脂质中CD?和CD?组的C-D键比例预期的强度（即C??:?中的3/28=11%）。蛋白质中的CD?组比脂质中链末端的CD?组更接近其他电子吸引基团。由于蛋白质CD?碳的电子密度较低，导致C-D键更强，我们可以根据它们的拉曼频率区分脂质和蛋白质中甲基组的C-D伸缩振动，蛋白质信号出现在更高的波数。因此，脂肪酸氘代模式的分析支持了我们的假设，即2068 cm?1的拉曼带来源于具有末端CD?组的强氘代脂质。

结论

在这项研究中，我们提供了证据，表明使用SIRM（单细胞-SIP方法）获得的氘代细胞比例和细胞氘代程度与FAME的氘代比例以及从FAME-GC-MS数据（化合物特异性SIP方法）得出的氘代程度非常一致。当同一微生物的细胞在具有不同形式的底物和氘标记（葡萄糖、乳酸、D?O和葡萄糖-D??）的情况下生长时，观察到了这种一致性。因此，这两种SIP方法的结合扩展了每种方法的能力，实现了多尺度理解，包括单细胞和批量级分析，以及整个细胞的分析和对特定代谢物的靶向表征。虽然单细胞SIRM信息揭示了代谢活动和生长的表型异质性，但FAME-GC-MS的批量分析确保了单细胞数据的代表性。作为特定代谢物的脂肪酸分析展示了不同脂肪酸、它们的同位素异构体以及在不同同位素组成或底物下的脂肪酸谱的异质性，反映了环境因素对细菌生理的影响。相比之下，整个细胞的SIRM数据将单个代谢物数据置于整个生物体的框架中，并指示了不同细胞代的存在。总之，我们展示了SIRM和FAME-GC-MS数据不仅相互验证，而且还相互补充。

基于这一基础——在这种原理验证研究中证明的化合物特异性和单细胞SIP方法的价值——同样的方法可以扩展到更复杂的系统。SIP方法的总体目标是将功能活性与自然系统中的微生物身份联系起来，正如Dumont和Murrell [1]以及Kreuzer-Martin [2]所总结的。因此，下一步是与微生物群落一起工作。在这种方法中，可以探索SIRM和FAME-GC-MS组合的另一个优势：SIRM的高横向分辨率和共聚焦能力能够进行空间映射，以发现复杂样本中的微环境，而FAME-GC-MS还可以提供分类学信息。一个有前景的工作流程将是针对活性细胞，通过基于它们的D掺入量进行拉曼细胞分选，然后使用FAME-GC-MS分析不同细胞部分的脂肪酸组成和标记，同时获得分类学细节。

可能的应用可以扩展到研究天然系统中氘代（微塑料）的生物降解。之前已经使用SIRM在单物种以及土壤群落实验中研究了氘代聚乳酸在微生物生物量中的掺入[76]，这样的SIRM + FAME-GC-MS方法组合将受益匪浅。总之，我们的工作为将细菌功能与细菌生理学以及潜在的分类学身份和空间分辨率联系起来铺平了道路。