依赖溶剂的Acacia mearnsii树皮代谢组学分析：一种非靶向代谢组学方法

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Solvent-dependent metabolomic profiling of Acacia mearnsii bark: an untargeted metabolomics approach

　　**摘要**
黑金合欢树皮（Acacia mearnsii De Wild.）具有重要的社会和经济价值，其突出特点在于含有高浓度的缩合单宁。尽管它是一种已知且被广泛利用的原花青素来源，但关于这种原材料中可能存在的其他化合物及其对生物活性作用的贡献知之甚少。基于这一背景，本研究采用了非靶向代谢组学方法，利用不同的提取溶剂来探究黑金合欢树皮的代谢多样性，并重点分析了在巴西南部种植的黑金合欢树皮中的原花青素谱型。研究发现，不同溶剂的使用显著影响了代谢产物的提取和组成，其中水溶剂与有机溶剂之间存在明显差异。50%和70%的丙酮以及70%的甲醇在代谢产物相对丰度方面表现最佳。共鉴定出80种不同的化合物，包括有机酸和酚类化合物等，其中许多化合物是首次在黑金合欢树皮中被发现。这些结果展示了提取物在代谢组成上的丰富性，其化学复杂性远超缩合单宁。在原花青素方面，检测到了从单体到五聚体的各种寡聚体结构；(epi)儿茶素和(epi)没食子儿茶素作为聚合链的起始单元，而(epi)罗宾尼芬醇和菲塞蒂尼醇则是链延长单元。黑金合欢树皮中的代谢多样性为其提取物作为天然添加剂的潜力提供了依据，这些添加剂可在食品和饲料工业中得到进一步探索。

**引言**
黑金合欢（Acacia mearnsii De Wild.）是一种具有显著经济和社会价值的豆科植物，原产于澳大利亚，目前主要在巴西南部和南非栽培，是唯一一种在国内外大规模商业种植的温带金合欢物种[1, 2]。黑金合欢树皮可提取出富含单宁的提取物，传统上因其与蛋白质结合的能力而被用于皮革工业[3]。单宁属于酚类化合物中的重要成员，在自然界中广泛存在。这些次生代谢物是在植物受到压力时产生的，具有保护作用。单宁的分子量范围从500到20,000 Da不等，化学结构多种多样[4]。在各种单宁中，原花青素（或缩合单宁）因其在多个工业应用中的重要性而备受关注。近年来，来自木材和树皮的单宁因其在食品行业及其他领域的新型应用而受到关注[5]。虽然黑金合欢树皮主要以其高含量的原花青素而闻名，但对其所含其他化合物的研究仍十分有限，而这些化合物也可能对其提取物的生物活性有所贡献。Kusano等人[6]报告了黑金合欢树皮中存在其他酚类化合物（如山柰酚、丁香酚和丁香酸等），但其组成可能更为复杂，远超多酚类物质的范畴，这一领域在科学文献中尚未得到充分探索。在这种情况下，非靶向代谢组学成为研究黑金合欢树皮中丰富单宁提取物成分的宝贵工具。

**材料与方法**
**试剂与标准品**
没食子酸、鞣花酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、5-咖啡酰奎宁酸、对香豆酸、(+)-儿茶素、(+)-没食子儿茶素、(-)-表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸、槲皮素、橙苷、芹菜素、白藜芦醇、大豆苷元、羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸、焦性没食子酸、山柰酚、原儿茶酸、芥酸、反式-3-羟基肉桂酸、芦丁、茶素、菲塞丁、木犀草素、木犀草素、原花青素A2、B1、B2、C1等标准品的纯度均超过90%，购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）。HPLC级别的丙酮来自ScharLAB SL（巴塞罗那，西班牙）；Folin-Ciocalteu和香草醛同样来自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）。丙酮、乙醇和甲酸购自Neon Comercial（圣保罗，巴西）；甲醇购自êxodo Científica（圣保罗，巴西）；盐酸购自Química Moderna（圣保罗，巴西）；超纯水由Milipore System（莫尔斯海姆，法国）制备。

**样品**
黑金合欢树皮样品（约1公斤）由TANAC（蒙得维的亚，南里奥格兰德州，巴西）提供，该公司生产来自可再生资源的天然单宁提取物。样品取自生长在巴西南里奥格兰德州金合欢森林中的Acacia mearnsii De Wild.树木（坐标：32° 02′ 06″ S, 52° 05′ 55″ W）。为稳定新鲜样品，树皮先在超低温冷冻机（Coldlab, CL200）中冷冻，随后进行冷冻干燥（L101，利奥布拉斯，巴西）。干燥后的样品用研磨机磨成细粉，真空封装在袋中（Sulpack, SVC 200 G2型号，卡西亚斯杜苏尔，巴西），并储存在-18°C条件下。这些细粉随后用于不同溶剂的提取。

**溶剂筛选**
用于非靶向代谢组学研究的提取溶剂包括：室温下的蒸馏水（25°C，AW）、加热至85–90°C的蒸馏水（HW），以及一系列二元混合物——丙酮：水（50:50 v/v，AC5）、乙醇：水（50:50 v/v，E5）、甲醇：水（50:50 v/v，M5）、丙酮：水（70:30 v/v，AC7）、乙醇：水（70:30 v/v，E7）和甲醇：水（70:30 v/v，M7）。所有溶剂均用0.35%的甲酸进行酸化处理。这些溶剂的选择基于先前的研究[8, 9]。样品名称的详细信息见补充材料1中的表S1。

**代谢组学分析**
**代谢产物提取**
提取代谢产物时，将0.1克冻干样品与1.5毫升溶剂混合于Eppendorf管中。加入溶剂前，每个样品中加入少量0.5毫米玻璃珠。混合物在Bead Ruptor? 4细胞破碎器（OMNI International，美国）中以最大转速（150 G）搅拌2分钟。搅拌后，样品在Eppendorf AG离心机（汉堡，德国）中以13,416 g的离心力离心5分钟。上清液小心收集至新的Eppendorf管中。随后使用New Lab NL-45-02样品浓缩器（皮拉西卡巴，圣保罗，巴西）在40°C下处理45分钟以去除溶剂。剩余的水相提取物与等量的蒸馏水和甲醇重新混合至总质量1000毫克（500毫克水，500毫克甲醇），然后过滤至琥珀色小瓶中。提取过程重复五次（共五次独立实验）。通过混合五个单独提取物制备质控（QC）样品。实验中还包括溶剂空白和过程空白，以排除实验室耗材可能带来的污染。溶剂空白为甲醇：水（1:1）混合物，过程空白则按照样品提取的相同步骤进行，但用蒸馏水代替样品。

**数据采集**
代谢组学实验使用超高效液相色谱系统（UHPLC，Nexera X2 Shimadzu，京都，日本）和Impact II质谱仪（Impact II Bruker，布鲁克公司，马萨诸塞州，美国）进行，质谱仪配备四极杆-飞行时间（QTOF）分析器。离子化方式采用电喷雾（ESI）。样品的运行顺序随机排列，并在负离子和正离子模式下进行分析。UHPLC的分离柱为Acquity UPLC HSS T3（50 × 2.1 mm，1.8 μm颗粒大小），流速为0.5 mL/min，柱温为40°C。每份样品的进样量为5 μL。流动相由A相（用0.1%甲酸酸化的水）和B相（用0.1%甲酸酸化的丙酮腈）组成。流动相梯度为：0% B保持0.5分钟，然后线性增加到100% B持续8分钟，再回到0% B持续1分钟。质控样品反复进样以稳定仪器性能。每五个样品进样后分析一次质控样品，以评估实验间的变异情况。QTOF-MS参数设置为：扫描范围m/z 50至1000 Da，干燥气体温度200°C，雾化气体压力4.5 bar，干燥气体流量10 L/min。质谱/质谱（MS/MS）数据采用数据依赖性采集（DDA）模式，阈值设定为1500。仪器控制和原始数据处理分别使用Esquire Control和Data Analysis 4.3软件进行（Bruker Daltonics，美国马萨诸塞州比勒里卡）。原始数据使用甲酸钠簇进行内部校准。质谱裂解（MSMS）采用相同的质谱设置，采用自动MS/MS扫描模式，碰撞能量为10 eV。

**数据预处理**
从UHPLC-QTOF-MS分析中获得的文件最初是*.d格式。然后使用Data Analysis 4.3软件（Bruker Daltonics，美国马萨诸塞州比勒里卡）将这些数据转换为*.mzML格式。*.mzML格式的数据使用MZmine 4.5.20软件[12]进行峰解卷积处理。该过程包括质量检测、ADAP（自动化数据分析流程）、色谱图构建、色谱图解卷积、同位素分组、色谱图对齐、间隙填充和去除重复特征等步骤。所有参数在补充材料1中的表S2和S3中有描述。数据处理完成后，得到的文件（.csv格式）被导出以供进一步数据分析。

**数据分析**
数据过滤在Excel软件（2501版本）中进行。与过程空白样品相比，质量控制（QC）样品中质量至少增加十倍的特征被排除在分析之外。随后，QC样品中变异系数大于30%的特征也被移除。包含负离子和正离子模式下MS1数据的最终特征表分别列在表S4和S5中（补充材料1）。

数据分析使用MetaboAnalyst 6.0软件（https://www.metaboanalyst.ca/）[13]进行。特征根据重新悬浮提取物的质量进行归一化。然后对数据应用对数（以10为底）变换。使用MetaboAnalyst 6.0软件进行了单变量和多变量统计分析，包括主成分分析（PCA）、热图生成和火山图绘制。

**代谢物注释**
代谢物注释是根据MS/MS光谱数据进行的，遵循Metabolomics Standard Initiative指南。在此过程中使用了三种方法：手动注释、库搜索和计算机辅助注释。对于手动方法，考虑了以下参数：T3柱中的洗脱顺序、准确质量以及与标准和/或文献中可用数据的碎片化模式进行比较。在这种情况下，使用了Compass DataAnalysis 4.3软件。此外，数据分析软件中的数据被转换为*.mzML格式，并上传到Global Natural Products Social Network（GNPS）平台（https://gnps2.org）[14]，在那里使用了Library Search算法。为了生成分子网络，前体离子的质量容忍度设置为2.0 Da。离子碎片质量方差被设置为0.5 Da，用于对每组获得的MS/MS光谱进行聚类。只有当余弦得分超过0.7且碎片化光谱中至少有6个匹配峰时，节点才会被连接。然后将分子网络光谱与GNPS光谱库进行比较，对样本光谱应用了相同的数据参数。此外，还使用了Sirius软件（版本5.8.6），并启用了Canopus Class Prediction功能。

**数据集可用性**
原始MS数据已存放在MetaboLights中，访问号为MTBLS13040[15]，而MS/MS数据则可在GNPS MassIVE仓库中找到，编号为MSV000098533[14]。

**酚类化合物的定量和表征**
总酚类化合物（TPC）的测定遵循Singleton和Rossi[16]开发的方法，并进行了修改。该方法在样品总体积和反应时间方面进行了调整。
提取物的制备遵循“代谢物提取部分”中描述的程序。提取后，向每个样品中加入0.25 mL的2 N Folin-Ciocalteu试剂和1.5 mL的超纯水。让这种混合物反应5分钟，然后加入1 mL的7%碳酸钠溶液。混合物在室温下避光保存2小时，之后使用UV–可见光分光光度计（Biospectro SP-220 – Eikonal do Brasil，巴西圣保罗）在765 nm处测量吸光度。使用没食子酸作为标准，总酚含量表示为每克样品中的没食子酸毫克当量（mg GAE g?1）。所有样品均进行了三次重复实验。

**总原花青素含量**
总原花青素（TPAC）的含量使用香草醛方法测定，遵循Price等人[17]描述的程序，并进行了一些修改。提取物的制备遵循“代谢物提取”部分中描述的程序。提取后，将0.4 mL的每种提取物与0.6 mL的甲醇和3 mL的香草醛工作试剂混合。该试剂在分析当天制备，通过混合等体积的8% HCl溶液和1%香草醛溶液在甲醇中制成。之后，混合物在30°C的水浴中避光保存10分钟。使用UV–可见光分光光度计（Biospectro SP-220 – Eikonal do Brasil，巴西圣保罗）在490 nm处测量吸光度。使用儿茶素作为标准，总缩合单宁含量表示为每克样品中的儿茶素毫克当量（mg CE g?1）。所有样品均进行了三次重复实验。

**原花青素注释**
高分子量原花青素寡聚体的存在通过LC–MS方法进行评估。提取时，将0.1 g的研磨样品与1.5 mL的甲醇：水（8:2, v/v）混合，并用0.35%的甲酸酸化。所得提取物在配备二极管阵列检测器（DAD，Shimadzu，SPD-20a）和四极杆飞行时间（QTOF）质谱仪（ESI – Bruker Daltonics，micrOTOF-QIII，德国不来梅）的HPLC（Shimadzu，京都）中进行分析。分离使用Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，4 μm）。流动相分为A（用0.1%甲酸酸化的超纯水）和B（用0.1%甲酸酸化的乙腈）。提取按照二元梯度进行，起始为A/B的99:1（v/v），随后在50分钟内变为50:50（v/v），最后在5分钟内变为1:99（v/v）。总运行时间为55分钟，流速为0.7 mL min?1，温度为29°C，进样体积为20 μL。
质谱数据在m/z范围50到1500内以扫描模式获取。MS采集参数如下：ESI源处于负离子模式，毛细管电压为3500 V，干燥气体温度（N2）为310°C，流速为8 L min?1，雾化气体压力为4 bar。
原花青素的注释使用GNPS平台进行（见“代谢物注释”部分），并结合手动解释，基于准确质量、MSMS碎片化模式、洗脱顺序和UV–vis吸收特性。

**统计分析**
数据的比较通过ANOVA进行，随后进行Tukey检验，显著性水平为95%（Statistica，13.0版本，Statsoft Inc.，美国塔尔萨）。

**结果与讨论**
**不同溶剂对代谢物提取的影响**
经过数据预处理和过滤后，负离子模式和正离子模式分别保留了3106个和4284个化学特征用于分析。最初，在负离子模式下检测到4756个特征，在正离子模式下检测到23,910个特征。因此，过滤后负离子模式保留了65.3%的特征，正离子模式保留了17.9%的特征。图S1a和S1b（补充材料2）分别显示了所有样品和特征的主成分分析（PCA），包括QC（质量控制样品），在负离子模式和正离子模式下。这些图表证明了输入数据的适用性。两种离子模式下合并的QC（浅绿色）的重叠表明质谱仪性能良好，数据清洗过程的一致性，表明相同样品之间的测量结果可靠。不同处理（溶剂）的重复实验显示出比QC样品更低的重现性，这是预期的，因为它们代表独立的生物学重复实验。此外，提取过程的复杂性（包括多个步骤，如样品浓缩和重新悬浮）可能增加了样品间的方差。
图S2a和S2b（补充材料2）分别显示了负离子模式和正离子模式的log10转换后的相对特征丰度数据的箱形图，样品按处理类型分组。这些图表证实了上述行为，表明相同QC的测量结果是一致的。
所有样品和特征的PCA得分图（不包括QC样品）可以在图1中找到，分别对应负离子模式（图1a）和正离子模式（图1b）。可以看出，PCA得分图在负离子模式和正离子模式之间表现出相似的行为。两种离子模式下形成两个不同的簇，表明使用水作为溶剂与使用有机提取溶剂时化学特征的相对丰度存在差异。尽管代谢物在不同离子模式下的离子化方式可能不同，但分析将主要关注负离子模式，偶尔也会参考正离子模式，因为两者观察到了相似的趋势。

**图1**
不同提取溶剂的PCA得分图：a为负离子模式下的得分图，b为正离子模式下的得分图。提取溶剂包括：环境水（AW，室温下的水）、热水（HW，90°C下的水）、50%丙酮（AC5）、70%丙酮（AC7）、50%乙醇（E5）、70%乙醇（E7）、50%甲醇（M5）和70%甲醇（M7）。
如图1a所示，主成分1（PC1）解释了总方差的82.6%，而主成分2（PC2）解释了4.7%，表明从数千维到二维的降维可以解释大约87%的组间方差。如上所述，图表沿PC1清晰地分离了水溶剂和有机溶剂，形成了两个不同的簇。此外，图1a还显示了乙醇溶剂与基于丙酮或甲醇的溶剂之间的分离（70%甲醇除外）。这种模式表明不同的溶剂以不同的方式调节了从黑荆树皮中提取代谢物的过程，显示出使用水或有机溶剂时的差异。
图2显示了在假发现率（FDR）校正后的p值≤0.05的所有显著不同特征的热图，对样本（列）和特征（行）进行了聚类。该图显示了数据的视觉总结，突出了不同溶剂应用下化合物相对丰度的不同模式。第一个垂直簇根据处理（溶剂）将热图分为两个不同的区域。左侧区域包括两种条件下的水溶剂：室温下的水（AW）和加热至90°C的水（HW）。该区域主要呈现蓝色，表明提取特征的相对丰度较低。

**图2**
使用LC–MS在负离子模式下检测到的所有显著不同特征的热图，FDR校正后的p值≤0.05。水平方向使用欧几里得距离和Ward的链接方法进行层次聚类，垂直方向对样本进行分类，对特征进行分组。
相比之下，热图的中间和右侧部分形成了第二个簇，其特征主要是红色调，表明有机溶剂产生了更高的相对特征丰度。值得注意的是，中间有一个更强烈的红色区域，对应于使用50%和70%浓度丙酮进行的提取。这表明丙酮在提取某些特征方面比其他溶剂更有效。
表1显示了被注释为酚类化合物、有机酸和木脂素等化合物的80个特征，它们占负离子模式下检测到的特征的2.6%，以及正离子模式下检测到的特征的1.8%。黑荆树皮的代谢物谱显示了多种类别的多样分布。这些生物活性化合物包括初级代谢物和次级代谢物。在初级代谢物中，注释了碳水化合物、氨基酸和脂肪酸衍生物。在次级代谢物中，注释了有机酸，包括没食子酸、苹果酸、原儿茶酸和柠檬酸。黄酮类化合物如（+）-儿茶素、（+）-没食子酸、（+）-罗宾尼丁醇和菲塞丁醇，以及二聚体和三聚体形式的原花青素，突出了树皮中缩合单宁的存在。此外，香豆素如esculetin以及其他酚类衍生物如香草醛也增加了该矩阵的代谢复杂性。表1：Acacia mearnsii De Wild.树皮中的注释代谢物，包括保留时间、分子式、实验离子（正负模式）、超出实验误差的范围、碎片化模式以及注释级别等参数。完整表格显示了这种多样化的成分组合强调了黑金合欢树皮的多功能性，特别是其潜在的抗氧化和生物活性特性。尽管许多研究主要关注其原花青素含量，但表1揭示了比先前报道的更为复杂和多样的化学谱型。关于黑金合欢树皮特征的更详细讨论，请参见“黑金合欢树皮中酚类化合物的定量与表征”。为了进行特征分析，单变量t检验的结果以火山图的形式直观呈现，图中显示了显著性检验的p值以及相对丰度的变化倍数（图3）。水平和垂直虚线分别代表多重检验校正后的调整p值0.05和变化倍数1的临界值。这些图表同时考虑了变化的大小和变异性[18]。这些分析旨在阐明溶剂对特征数量的影响，同时考虑了温度、溶剂浓度和溶剂类型的作用。

图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整图像：通过非靶向代谢组学分析在负离子化模式下检测到的特征火山图，比较了：a 室温下的水（AW）与热水（HW）；b 水溶液与有机溶剂；c 50%丙酮（AC5）与70%丙酮（AC7）；d 50%乙醇（E5）与70%乙醇（E7）；e 50%甲醇（M5）与70%甲醇（M7）；f 70%丙酮（AC7）与70%甲醇（M7）；g 70%丙酮（AC7）与50%乙醇（E5）；h 70%甲醇（M7）与50%乙醇（E5）。当比较室温水（AW）与热水（HW）时（图3a），只有三个特征存在显著差异，表明加热并未影响化合物的提取。相比之下，图3b显示水溶液与有机溶剂之间存在1205个显著不同的特征，这证实了之前的研究结果。在分析某些特定化合物的行为时也观察到了这一趋势。图4和图5展示了所有处理条件下选定化合物的相对丰度箱形图。其中一些化合物在不同处理条件下的差异具有统计学意义，这是通过ANOVA（α=0.05）后进行的Tukey检验确定的。特别是，没食子酸和原儿茶酸在室温水或热水提取时的相对丰度较低（图4）。有趣的是，50%和70%乙醇是提取柠檬酸效果最差的溶剂。图4还展示了所有处理条件下黄酮类化合物（本研究中在Acacia mearnsii De Wild.树皮中发现的主要组）的相对丰度箱形图。同样，室温和热水也是效果最差的溶剂。这种模式也出现在酚类糖苷化合物和原花青素单体（图5）、原花青素二聚体和三聚体（图5）以及其他代谢物（如esculetin，图5）中。

图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整图像：比较不同处理条件下有机酸和黄酮类化合物相对丰度的箱形图（ANOVA和Tukey的显著差异检验，α=0.05）。线条代表每种处理条件下的中位丰度。a 柠檬酸；b 没食子酸；c 原儿茶酸；d 芙芦丁；e 芙芦丁；f 苦杏仁苷；g 苦杏仁苷；h 莲芦苷；i 莲芦苷；j 莲芦苷；k 纳林根苷。

图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整图像：比较不同处理条件下酚类糖苷（a）、原花青素单体（b、c、d和e）、原花青素二聚体（f、g和h）以及其他代谢物（m）的相对丰度的箱形图（ANOVA和Tukey的显著差异检验，α=0.05）。线条代表每种处理条件下的中位丰度。a 氟化物；b 卡特钦/罗宾尼丁醇；c 表没食子儿茶素；d 芙芦丁醇；e 表没食子儿茶素；f 原花青素二聚体1；g 原花青素二聚体2；h 原花青素三聚体1；i 原花青素三聚体2；j 原花青素三聚体3；k 原花青素三聚体4；m esculetin。

对于水和加热条件下的提取结果，可以用两种相反的效果来解释：（1）温度升高提高了提取效率；（2）热敏感代谢物发生了热降解。这两种效应的平衡最终导致整体代谢物产量没有显著差异。根据Snyder的理论，溶剂的性质，特别是极性和介电常数，在溶质溶解度中起着关键作用[19]。提高温度通常通过降低溶剂粘度来增强提取效率，从而更好地渗透植物基质并增加溶质的扩散性，促进代谢物进入溶剂相。此外，加热会略微降低水的极性，这可能有利于提取中等极性的化合物。Iba?ez等人[20]报告称，高温可以将水的介电常数降低到与甲醇或乙腈相似的水平，从而提高低极性化合物的溶解度。相反，Snyder的理论也表明温度会影响溶质的稳定性。许多植物代谢物，尤其是某些酚类化合物，在高温下容易热降解，可能会发生氧化、转化、共轭形式的水解或聚合[21]。在本研究应用的温度范围（85–90°C）内，已经可以检测到酚类化合物的热效应，这一点得到了“黑金合欢树皮中酚类化合物的定量与表征”中Folin–Ciocalteu结果的支持，这些结果表明总酚含量因加热而减少。文献中也报告了类似的行为，酚类化合物表现出温度依赖性的降解，通常遵循一级动力学，影响它们的浓度和抗氧化活性[22, 23]。这两种相反的机制——提取效率的提高和同时发生的热降解——解释了在室温和加热水提取之间观察到的代谢物产量相当的原因。

有机溶剂在代谢物提取方面的优越性能也可以用Snyder的溶剂理论[19]来解释。根据作者的观点，溶剂根据其极性指数进行分类，这影响了它们溶解特定类型化合物的能力。水是一种高极性溶剂，适用于提取亲水性化合物，如有机酸。然而，Acacia mearnsii De Wild.树皮中的许多生物活性代谢物，如黄酮类和单宁，具有中等至低的极性。有机溶剂（如丙酮、乙醇和甲醇），当用于水溶液（例如50%或70%的溶液）时，提供了平衡的极性，增强了极性和非极性代谢物的溶解度。这种极性调节允许提取更广泛的化合物，包括那些在纯水中不易溶解的化合物。除了溶解度效应外，有机溶剂还可以改变植物基质的物理结构，通过破坏氢键和细胞壁成分来促进代谢物的释放，并提高对植物组织的渗透性。这种效应对于原花青素和黄酮类特别重要，因为它们通常与植物基质的结构成分结合在一起。对于有机溶剂，比较相同溶剂的不同浓度时，只有13个特征在50%和70%丙酮（AC5和AC7）之间存在显著差异，其中9个特征在70%丙酮中的丰度更高（图3c）。这表明浓度变化对提取的影响很小。图3d中也观察到了类似的趋势，其中只有10个特征在50%和70%乙醇（E5和E7）之间存在显著差异，其中8个特征在50%乙醇中的丰度更高。然而，图3e显示了甲醇的不同模式：50%和70%甲醇（M5和M7）之间有306个特征存在显著差异，表明甲醇浓度影响了化合物的提取。特别是，70%甲醇导致303个特征在相对丰度上高于50%甲醇。总体而言，图3a–e表明，与水提取相比，有机溶剂提取的差异最为明显。

为了进一步比较不同有机溶剂之间的差异，我们关注了在考虑相对丰度时表现出最多显著上调特征的溶剂（图3f–h）。图3f显示，70%丙酮（AC7）与70%甲醇（M7）之间的比较产生了135个显著不同的特征，其中82个特征在70%丙酮中的丰度高于70%甲醇。相比之下，图3g显示，70%丙酮（AC7）与50%乙醇（E5）之间的比较使显著不同特征的数量增加到166个；在这种情况下，123个特征在70%丙酮中的丰度高于50%乙醇。此外，图3h表明，70%甲醇（M7）与50%乙醇（E5）之间只有39个特征存在显著差异，21个特征在70%甲醇中的丰度更高，这表明两种溶剂对化合物提取的影响相似。总体而言，70%丙酮（AC7）提取的具有较高相对丰度的特征数量最多，突显了其作为提取溶剂的有效性。这一结果与Chavan等人的报告一致[8]，他们描述70%丙酮是从海滩豌豆中提取最高浓度生物活性化合物的最佳溶剂。这一趋势可以用丙酮的极性和非质子性质来解释。根据Mokrani和Madani[24]的说法，丙酮是提取高分子量化合物（如缩合单宁）的更有效溶剂。此外，Tourabi等人[25]描述了丙酮在从植物材料中提取化合物方面的高效性，因为它可以溶解广泛极性范围内的分子。然而，正如Meneses等人[26]所展示的，丙酮：水混合物比纯丙酮更有效地提取某些化合物，如酚类。这种效率的提高归因于混合物的更高极性，为溶解极性化合物创造了更有利的条件。尽管如此，由于成本低和环境可持续性，水仍然广泛用于工业应用中提取代谢物，如缩合单宁。在考虑在食品或饲料工业规模上使用丙酮：水混合物时，评估去除丙酮和随后纯化目标生物活性化合物的策略至关重要。

图4显示，70%丙酮对所有有机酸的提取效率最高。对于（+）-表没食子儿茶素和（-）-表没食子儿茶素（图5），50%和70%丙酮都是最合适的提取溶剂。同样，50%和70%丙酮也最大化了原花青素二聚体的相对丰度（图5），以及香豆素等（图5）。然而，对于黄酮类（图4），70%丙酮并不是某些化合物（如芙芦丁、苦杏仁苷和莲芦苷）的最有效溶剂。相反，70%甲醇（M7）和70%乙醇（E7）似乎是提取这些化合物的最有效溶剂。对于（+）-卡特钦、（+）-罗宾尼丁醇和芙芦丁醇，70%乙醇和70%甲醇也是最有效的提取溶剂（图5）。对于氟化物，一种苦杏仁苷衍生物，50%和70%丙酮以及70%甲醇也是最有效的提取溶剂。此外，对于原花青素三聚体，在几乎所有情况下，50%和70%丙酮以及70%乙醇和70%甲醇都是合适的提取溶剂（图5）。

这些发现强调了不同溶剂以不同方式影响化合物提取的情况，并与热图分析（图2）中观察到的模式一致。Creydt等人[7]还表明，当目标是提取极性和非极性代谢物时，并没有单一的协议。总体而言，有机溶剂在从黑金合欢树皮中提取代谢物方面更有效。其中，50%和70%丙酮以及70%甲醇产生了最高的代谢物特征丰度。

除了非靶向代谢组学分析外，还使用先前研究的提取溶剂进行了总酚类化合物（TPC）和总原花青素含量（TPAC）的分析，以表征黑金合欢树皮并评估溶剂依赖的差异。图6a和b分别展示了TPC和TPAC的结果。

图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整图像：使用不同提取溶剂得到的黑金合欢树皮中的总酚类化合物（a）和总原花青素（b）。*同一图表中不同的字母表示数据之间的显著差异（p<0.05）。

提取溶剂的选择显著影响了TPC和TPAC的含量（p<0.05）。其中，50%丙酮（AC5）产生了最高的TPC值，而使用50%和70%浓度的丙酮（AC5和AC7）时TPAC最高。然而，值得注意的是，70%丙酮（AC7）在有机溶剂中产生了最低的TPC。根据这一点，Bhebhe等人[28]报告称，在分析红茶和选定的浸泡液时，50%的丙酮比纯丙酮能更好地提取总酚类化合物。作者认为，这种趋势可能归因于天然酚类化合物在中等极性溶剂中的溶解性。相比之下，无论是室温下的水（AW）还是加热到90°C的水（HW），其总酚含量（TPC）和总多酚酸含量（TPAC）都最低。乙醇和甲醇在不同浓度下，TPC和TPAC的值没有统计学上的显著差异。尽管这些结果是预期的，但它们具有重要意义，特别是因为水由于其环保特性，在工业规模上常用于提取原花青素。然而，需要强调的是，50%的丙酮（AC5）在提取酚类化合物和原花青素方面表现出最高的效率，这可能对优化提取过程具有重要的经济意义。在这项研究中，首次鉴定了黑荆树皮中的几种酚类化合物（表1），包括柚皮苷、山柰酚和甘草素。这突显了其提取物中生物活性化合物的丰富性。这些化合物以其强大的抗氧化特性和其他生物活性而闻名，如抗菌、抗肥胖和抗糖尿病作用[29]。此前已有报道指出，这种材料中也含有其他黄酮类化合物，如槲皮素[30]。此外，本研究还鉴定出了异山柰酚、花蕾素和花翠素[1]。柚皮苷的黄酮异构体布丁也被检测到，这证实了Roux和Paulus[31]在荆树心材中的早期发现。此外，Kusano等人[6]在Acacia mearnsii De Wild的树皮中鉴定出几种低分子量成分，包括丁香酸和布丁，其中丁香酸在这里也被证实与一种六糖苷相关联。据我们所知，最近没有研究报道黑荆树皮提取物中存在除原花青素以外的其他酚类化合物。这里发现的酚类化合物的多样性强调了这种材料作为食品和饲料工业中有价值的生物活性化合物来源的潜力，不仅可以在产品开发中增强抗氧化和生物特性，还可以贡献技术功能。在动物营养领域，最近的研究探索了将缩合单宁作为饲料添加剂的可能性，因为它们具有抗菌特性和促进生长的潜力[4]。虽然这些生物活性通常归因于缩合单宁，但本研究的结果表明，黑荆树皮中含有许多其他生物活性化合物，这些化合物也可能对这些效果有所贡献。原花青素的生物合成是黄酮途径的一部分，该途径起源于苯丙素代谢途径[32, 33]。这一过程始于苯丙氨酸的脱氨基作用，生成柚皮苷查尔酮，从而建立了黄酮类的特征性C3-C6-C3骨架[32, 34]。一系列酶，包括水解酶、合成酶和异构酶，调节这一途径，生成中间体和最终代谢物，如柚皮苷、芹菜素、槲皮素和山柰酚。这些化合物随后生成白花青素，即黄烷-3-醇单体的前体（例如儿茶素、没食子儿茶素、罗宾尼丁醇和菲塞提尼醇）。通过聚合和黄烷间相互作用，这些单体形成原花青素[32, 34]。这一生物合成途径解释了黑荆树皮中存在各种黄酮类化合物作为中间体或最终产品的现象。本研究首次在该材料中鉴定出柚皮苷、山柰酚和甘草素，进一步支持了其次级代谢物组成的复杂性和多样性。

关于原花青素，本研究鉴定了四种单体单元：儿茶素、没食子儿茶素、罗宾尼丁醇和菲塞提尼醇。这些发现与先前的报道一致[3, 35, 36]。众所周知，儿茶素和没食子儿茶素是黑荆树皮中原花青素的起始单元，而罗宾尼丁醇和菲塞提尼醇则作为扩展单元[35, 36]。在本研究中，首次在该材料中鉴定了表儿茶素和表没食子儿茶素，这与该属植物的特性相符，因为这些单体通常存在于植物树皮中。我们假设这些非对映异构体可能作为原花青素生物合成中的额外起始单元。这些非对映异构体的存在是出乎意料的，因为Roux[37]之前报告称黑荆树皮中不存在它们。据我们所知，最近没有研究确认该材料中存在（?）-表儿茶素和（?）-表没食子儿茶素。本研究在黑荆树皮中鉴定的黄烷-3-醇单体的分子结构见图7。

在负离子和正离子模式下应用质谱（MS）技术，能够检测到黑荆树皮中的低聚体直至三聚体。Pasch等人[38]使用MALDI-TOF/MS分析了来自不同来源的缩合单宁提取物，他们检测到了Acacia mearnsii De Wild树皮中的低聚体直至八聚体。鉴于预期会有更大的低聚体，本研究使用LC-DAD-MS和C18柱进行了额外分析。这种方法不仅确认了单体、二聚体和三聚体的存在，还发现了四聚体和五聚体。表2基于文献中先前报道的MS数据[3]，展示了黑荆树皮中鉴定出的低聚体的估计组成。

在黑荆树皮提取物的负离子模式下，质谱谱中观察到三个二聚体峰，分子量分别为m/z 561、577和593。对于三聚体，检测到四个低聚体，分子量分别为m/z 833、849、865和881。关于四聚体，鉴定出两个低聚体，分子量分别为m/z 1153和1169。这些结果与Venter等人[3]的报告不同，他们检测到Acacia mearnsii De Wild树皮中有五种潜在的四聚体。这种组成差异可能归因于样品来源和地理条件的差异，因为Venter等人[3]分析的是南非的提取物，而本研究关注的是巴西的Acacia mearnsii De Wild。在五聚体方面，检测到三种化合物，它们以16 Da的间隔形成簇状结构，这种模式也出现在二聚体、三聚体和四聚体中。五聚体的分子量分别为m/z 1425、1441和1457。正如Venter等人[3]所描述的，黑荆树皮中的原花青素化学组成比其他来源（如quebracho）更复杂，后者由一个儿茶素起始单元和一个菲塞提尼醇扩展单元组成。这些结构差异表明，不同来源的原花青素在食品和饲料工业中可能有不同的应用。

通过与标准品的比较，鉴定了包括（表）儿茶素和（表）没食子儿茶素在内的单体，而（表）罗宾尼丁醇和菲塞提尼醇则是通过诊断方法和文献数据进行鉴定的。在这方面，菲塞提尼醇在m/z 149处显示出特征性碎片峰（负模式），正如Abilkassymova等人[39]所报告的。关于（表）儿茶素和（表）罗宾尼丁醇的鉴定，需要更深入地分析某些特征。在这方面，补充材料2提供了用于鉴定黑荆树皮中这些化合物的方法的图示。在图S3中，为了鉴定（+）-儿茶素（峰1）和（?）-表儿茶素（峰3），使用了实验室中可用的分析标准品，实现了一级鉴定。关键特征，包括保留时间、准确质量和MSMS碎片模式，在标准品和样品中的相应代谢物之间是一致的。图S3展示了使用“数据采集”（方法A—图S3a）和“原花青素鉴定”（方法B—图S3b）描述的LC–MS方法获得的m/z 289处的提取离子色谱图（EIC）。图S3c显示了样品和通过方法B获得的分析标准品的色谱图叠加图，突出了两种非对映异构体及其相应标准品之间的保留时间相似性。对于（+）-罗宾尼丁醇（峰2）和（?）-表罗宾尼丁醇（峰4）的鉴定，没有可用的分析标准品；因此，鉴定是基于它们的MSMS碎片模式，这些模式与（+）-儿茶素（峰1）和（?）-表儿茶素（峰3）的不同。需要注意的是，我们假设（+）-罗宾尼丁醇及其非对映异构体（?）-表罗宾尼丁醇的碎片模式是相同的，就像我们对（+）-儿茶素（峰1）和（?）-表儿茶素（峰3）所做的假设一样。因此，在提到碎片模式时，将使用（±）-（表）儿茶素或（±）-（表）罗宾尼丁醇的表示法。此外，假设这两种非对映异构体的洗脱顺序与（+）-儿茶素（峰1）和（?）-表儿茶素（峰3）观察到的行为相同。方法B应用了高碰撞能量（35 eV），使得m/z 289.0720的前体离子在负模式下发生更强烈的碎片化。图S4展示了（+）-儿茶素（图S4a）和（+）-罗宾尼丁醇（图S4b）的MSMS结果。从这些图中可以看出，（+）-儿茶素和（+）-罗宾尼丁醇显示出不同的碎片模式。虽然（+）-儿茶素在m/z 109、123和137处有最强烈的MSMS碎片，但（+）-罗宾尼丁素在m/z 109、125和139处有最强烈的MSMS碎片。因此，尽管提到的代谢物具有相同的前体离子（负模式下的289.0720 Da），但碎片模式的差异表明R基团（例如羟基）在分子中的连接位置不同。此外，还需要提到，这两种化合物都经历了RDA（Retro-Diels-Alder）碎片化，导致A环和B环从分子中释放。图S5和图S6分别展示了这些分子的碎片化路径。

这些描述的单体构成了鉴定出的二聚体、三聚体、四聚体和五聚体的结构基础。如表2所示，黑荆树皮中的低聚体主要是前罗宾尼丁醇（罗宾尼丁醇），由一个儿茶素或没食子儿茶素起始单元和一个罗宾尼丁醇扩展单元组成。在本研究中，还鉴定了表儿茶素和表没食子儿茶素这两种非对映异构体，表明它们可能作为额外的起始单元。此外，还鉴定了含有菲塞提尼醇作为扩展单元的低聚体。根据Venter等人[3]的研究，在二聚体中，扩展单元连接到起始单元的更活跃的C-8位置，而在三聚体中，额外的扩展单元也可能连接到剩余的C-6位置。本研究的结果证实了这些发现，并强调了Acacia mearnsii De Wild树皮提取物中除了原花青素之外还含有多种生物活性化合物。这些见解可以作为开发具有增强抗氧化特性的食品和饲料产品的宝贵工具。

结论

本研究探讨了Acacia mearnsii De Wild（黑荆树）树皮的代谢组成，揭示了超出原花青素的植物化学复杂性。提取溶剂的选择对代谢物的回收起着关键作用，70%的丙酮被证明是最有效的提取多种化合物的溶剂。这些结果强调了在代谢组学研究中优化提取方案的重要性。共鉴定出80种代谢物，包括黄酮类、有机酸和其他生物活性化合物，其中几种是首次在黑荆树皮中报道的。原花青素的表征确认了（表）儿茶素和（表）没食子儿茶素作为起始单元，以及二聚体、三聚体、四聚体和五聚体，其中（表）罗宾尼丁醇和菲塞提尼醇作为扩展单元，证明了该材料中缩合单宁的结构多样性。这些发现突显了黑荆树皮提取物在食品和饲料工业中的应用潜力，特别是由于它们含有丰富的具有抗氧化和其他有益特性的生物活性化合物。此外，先前未报道的代谢物的鉴定强调了进一步研究这种材料的技术和功能潜力的必要性。