基于抗生素抗性基因及拟杆菌目（Bacteroidales）作为粪便基因负荷标志物的MBR（膜生物反应器）和臭氧处理技术在高级废水处理中的附加价值 作者：Andreas Nocker、Grit Hofmann、Maximilian Werner、Jens Schoth、Christopher Breidenbach、Sabine Kuchler、Lina Bachert da Cunha、Gerhard Schertzinger、Hannes Schlottmann 和 Stefan Panglisch （另有1位作者）

《Water》：Added Value of MBR and Ozonation for Advanced Wastewater Treatment Based on Antibiotic Resistance Genes and Bacteroidales as a Marker for Fecal Gene Load Andreas Nocker, Grit Hofmann, Maximilian Werner, Jens Schoth, Christopher Breidenbach, Sabine Kuchler, Lina Bachert da Cunha, Gerhard Schertzinger, Hannes Schlottmann and Stefan Panglisch + 1 author

　　摘要：大型污水处理厂（WWTP）越来越多地采用四级处理工艺。传统的监测方法主要依赖于测量需氧量、微量污染物以及营养物质磷和氮。从微生物学的角度来看，评估处理效果的相关参数包括粪便基因负荷的去除效率（作为病原体风险的代理指标）、抗生素抗性基因以及细菌的再生潜力。为此，本研究结合使用了流式细胞术和定量PCR技术，并进行了存活率评估，以表征一个全尺寸的试点工厂。该试点工厂包括常规处理工艺、MBR（膜生物反应器）和臭氧处理工艺。粪便基因负荷的评估基于人类来源的拟杆菌属（Bacteroidales）的定量分析，因为这些专性厌氧菌在污水处理厂内无法复制。虽然常规处理对这些参数的去除效果仅中等，但四级处理通常能显著降低其浓度。MBR处理对去除效果贡献最大，与初级澄清出水相比，粪便基因负荷减少了约6个对数级，这证实了其在污水处理中的微生物学价值。除了去除微生物及其遗传物质外，数据还显示细胞外DNA减少了95%。臭氧处理进一步增强了微生物的去除效果。从分析角度来看，本研究展示了使用长扩增子定量PCR方法以及用存活率染料处理样品的附加价值，以减少假阳性信号并避免低估处理效果。所选择的诊断方法在评估污水处理厂的微生物处理效果方面显示出潜力，并为决定是否需要升级处理提供了依据。

1. 引言
污水处理厂被认为是限制污染物扩散的关键屏障[1]。然而，传统的市政污水处理厂（WWTP）仅针对化学需氧量（COD）和生物需氧量（BOD）以及营养物质磷和氮进行了优化。近年来，人们越来越关注有机污染物的释放、毒性、抗生素抗性以及微生物学参数[2,3]。在欧盟范围内，通过《欧盟城市污水处理指令》（UWWTD 2024/3019）加强了先进的污水处理和监测。特别是在欧盟成员国中，对于处理规模≥150,000人口当量的污水处理厂，四级处理已成为强制要求。对于处理规模≥10,000人口当量的污水处理厂，是否需要四级处理取决于是否进行了强制性风险评估。从“同一健康”（One Health）的微生物学角度来看，去除与卫生相关的参数和抗生素抗性至关重要，无论是升级现有处理厂还是设计新的处理厂。然而，由于缺乏对各个处理阶段处理效果的了解，减少这些参数的微生物负荷并非易事[4,5]。不同的处理步骤本身无法被赋予特定的效果，因为处理效果不仅取决于所采用的技术，还很大程度上取决于运行条件和废水的特性[6]。因此，微生物处理效果通常是未知的。这既适用于常规处理（包括机械和生物处理阶段以及沉淀处理），也适用于包括超滤、臭氧处理等先进处理技术，对于需要高质量水的应用，还包括反渗透处理。

本研究的目标是评估在常规处理后结合使用膜生物反应器（MBR）和臭氧处理作为高级处理工艺的附加微生物学价值。为此，采用了一系列非传统参数作为微生物学性能指标。分析内容包括使用流式细胞术评估细胞数量和细菌再生潜力，以及基于定量PCR的技术来量化抗生素抗性基因（ARGs）和人类拟杆菌属细菌。抗生素抗性基因包括常见的标记基因sul1、tetM、ermB、blaTEM和与第一类整合子-整合酶基因intl1，这些基因与许多抗性基因相关[7]。拟杆菌属被用作粪便污染的指标和处理效率的参数。拟杆菌属细菌通常用于确定粪便物质的来源，这是微生物来源追踪（MST）的一部分[8]。特别是属于拟杆菌属的细菌与宿主共同进化[9]，因此在不同宿主体内（如人类、反刍动物、猪、马和鸟类）存在特征性的拟杆菌属种群。本研究量化了与人类相关的拟杆菌属细菌。在人类结肠中，拟杆菌属细菌的浓度高于大肠杆菌，每克粪便中可含有高达10^11个拟杆菌属细菌[10]，而大肠杆菌的浓度为每克粪便10^7–10^8个[11]。拟杆菌属在人类肠道中的优势菌属是拟杆菌（Bacteroides），它占肠道细菌群落的20–52%[12,13]。因此，与人类相关的拟杆菌属细菌在市政废水中大量存在，并具有全球分布[15]。由于这些细菌是专性厌氧菌，它们不能在消化道外繁殖[16,17]，而大肠杆菌或肠球菌也可能来源于环境[18,19,20]。

处理效果的评估还包括基于通用16S rRNA基因的抗生素抗性基因（ARGs）的定量和细菌基因负荷的总体去除。与拟杆菌属的定量类似，对细菌的分子评估考虑了PCR扩增子长度的影响。较长序列的扩增使得结果更具体地针对具有完整DNA的微生物，或者说，可以排除来自DNA降解微生物的信号[21]。长扩增子定量PCR（LA-qPCR）方法还具有使用存活率染料处理样品的优势，相比短扩增子定量PCR（SA-qPCR）能提高处理效率。本研究中的样品部分用丙啶单氮化物（PMA）处理，这可以选择性检测具有完整细胞膜的微生物。随着扩增子大小的增加，排除膜受损细胞的效率也提高了[22]。

本研究的总体目标是利用这种非传统的诊断方法，评估采用MBR和臭氧处理的四级污水处理相对于常规处理的附加价值。另一个目标是积累关于不同诊断方法性能的经验。除了评估微生物及其细胞内基因的保留情况外，本研究还探讨了MBR处理是否也能有效保留游离的细胞外DNA（exDNA）。细胞裂解时通常会释放出原本存在于细胞内的核酸。考虑到超滤（UF）膜的孔径约为20–50纳米，从孔径的角度来看，膜能够有效去除微生物，但对于像DNA这样的分子则不然。

2. 材料与方法
2.1. 废水处理
废水处理在一个位于Dinslaken的试点工厂进行，该工厂由Emschergenossenschaft und Lippeverband（EGLV）运营。处理流程的概览如图1所示。该污水处理厂主要接收来自附近城市集水区的生活污水。污水通过两个泵站被输送到一个收集井，然后供给试点工厂。进入工厂的污水流量被调节为恒定值。这个1000人口当量的试点污水处理厂包括一个筛网、一个带有初级处理的混合沉淀池，以及两个各为500人口当量的常规活性污泥处理单元，每个单元都配有上游脱氮装置。由于每个处理单元都有独立的二次澄清池和各自的污泥系统，因此这些单元可以独立运行。常规处理后的出水进一步经过MBR处理和下游臭氧处理（图1）。MBR工厂配备了BIO-CEL? L-2型平面膜模块（480平方米），膜材料为聚醚砜（PES，Pall Corporation，美国纽约州Port Washington）。膜的孔径为45纳米。下游的臭氧处理装置配备了Wedeco HC系列模块化臭氧发生器（Xylem Wedeco，德国Herford）。臭氧通过泵注入系统（PIS）引入。应用的臭氧浓度为0.2–0.8毫克O3/毫克DOC，这是常规臭氧处理厂的典型范围[23,24,25]。

2.2. 采样与样品处理概述
共分析了12次采样的样品；调查期为2023年11月7日至2024年10月9日。这段时间足以克服间歇性的操作问题并对臭氧浓度进行调整。为了减少昼夜变化，使用自动采样设备（Hach Lange，德国杜塞尔多夫）收集24小时混合样品，样品容器为玻璃材质（2.9升）。样品在储存期间冷却至4°C ± 2°C。随后将样品从收集容器转移到无菌玻璃瓶中，并冷藏运输到实验室进行当天分析。用于流式细胞术分析的样品装在不含可同化有机碳（AOC）的玻璃容器中。所有样品在分析前都保持冷藏状态（4°C ± 2°C）。用于定量PCR分析的样品在提取DNA前进行了过滤，并根据需要用PMA处理或不用PMA处理，以评估PMA处理的效果（样品处理流程见图2）。

2.3. 流式细胞术
流式细胞术用于量化总细胞数（TCC，包括具有完整和受损细胞膜的细胞）、完整细胞数（ICC，具有完整细胞膜的细胞）和细菌再生潜力。流式细胞术测量时，将250微升的样品置于未涂层的96孔微孔板（型号601808，HJ-Bioanalytik GmbH，德国Erkelenz）的孔中。使用多通道移液器将定义好的样品量转移到含有预分配染料的额外微孔板中。对于TCC的流式细胞术定量，将200微升样品与2微升SYBR? Green I（100倍稀释于DMSO）混合，并通过反复移液混合。为了确定ICC值，将细胞用SYBR? Green I（型号S7567，Fisher Scientific Inc., 美国Waltham）和丙啶碘化物（型号P3566，Fisher Scientific Inc., 美国Waltham）的染料混合物进行染色。具体来说，丙啶碘化物（1.5 mM）与SYBR? Green I（100倍稀释于DMSO）按1:6的比例混合，然后将200微升样品加入2.4微升的染料混合物中。混合后，样品在37°C的加热柜中孵育13分钟。

随后在NovoCyte ACEA（ACEA Biosciences Inc., 美国San Diego）仪器上进行分析，该仪器配备488纳米激光器。测量参数如下：快速设置（66 μL/min），分析体积：50 μL，FL-1阈值：600（在FL-1上触发）。绿色荧光在FL-1通道（530纳米）上测量，红色荧光在FL-3通道（675纳米）上测量。分析所使用的门限基于Gatza等人的方法[26]。所得到的细胞数表示采样时的微生物状态。

2.4. 再生潜力评估
在流式细胞术确定第0天的细胞数后，将含有AOC的样品在22°C（±1°C）下储存7天以评估再生潜力。7天后，再次通过流式细胞术量化细胞数。再生后的数据仅显示ICC值。7天孵育后获得的完整细胞数（ICCday 7）代表了由原始样品中的营养物质支持的细胞浓度。

2.5. PMA处理与DNA提取
对于分子生物学分析，样品在采样当天使用0.2微米聚碳酸酯过滤器（产品编号PC02CP04700，Pieper Filter GmbH，德国Bad Zwischenahn）和真空过滤装置进行过滤。可过滤的样品体积取决于样品类型。典型的样品体积分别为：初级澄清出水25毫升，二次澄清出水50–100毫升，MBR和臭氧处理出水500–1000毫升。每个样品制备了两个相同的过滤样品。一个过滤器用完整性染料丙啶单叠氮化物（PMA）处理，以限制仅来自膜完整的细菌的信号；另一个过滤器则未进行处理。PMA处理直接在真空过滤棒上进行。对于使用PMA处理的过滤器（产品编号40013；Biotium，Fremont，CA，USA），将1毫克的染料溶解在786微升的25%二甲基亚砜（DMSO）中，制备成2.5毫摩尔的储备溶液。然后将总共40微升的储备溶液加入到2毫升的无菌水中（在水浴中预热至37°C）。最终PMA浓度为50微摩尔的溶液用于涂覆过滤器。为了保护这种光敏染料，在处理过程中用铝箔覆盖过滤棒。暴露时间为10分钟，在此期间偶尔摇晃样品以确保染料溶液均匀覆盖。培养后，吸走剩余的染料溶液。

PMA处理完成后，将过滤器转移到一个无菌培养皿中，使过滤后的沉淀物朝上，然后在没有塑料盖的情况下，用蓝光LED灯（465纳米）照射15分钟（使用PhotoActivation Universal Light设备，PAUL，GenIUL，Terrassa，Spain）。之后盖上盖子，并将过滤器储存在-20°C的培养皿中，直到进行DNA提取。

从过滤后的生物量中提取DNA使用的是FastDNA? SPIN Kit for Soil（产品编号116560200-CF；MP Biomedicals，Solon，OH，USA）。使用BeadBug? 6 Homogenizer（Benchmark Scientific，Sayreville，NJ，USA）破坏细胞物质，并按照制造商说明书中的“废水案例研究”部分进行操作。洗脱体积为200微升。

2.6. 细胞外DNA的分离
从MBR池和MBR滤液中获取细胞外DNA（exDNA）。MBR池的样本是用勺子取的，而MBR滤液的样本则从排水管中的球阀处取的。取样前对球阀进行了火焰处理，取样是在排出一升水后进行的。每隔15分钟取三个独立样本。样本体积约为250毫升。样品冷运送到实验室后，静置约45分钟，以便MBR预处理前的颗粒沉淀。

MBR池沉淀物的上清液用移液管转移到25毫升的Falcon管中。然后对每个样本的25毫升液体进行过滤（使用0.1微米的Acrodisc过滤器，产品编号4611，Pall Corporation，Port Washington，NY，USA），以去除细胞。过滤后的液体收集在无菌的50毫升Falcon管中。这些无细胞的滤液（25毫升）与2.5毫升的醋酸钠溶液（3摩尔/升，pH 5.2）和17.5毫升的异丙醇混合，以沉淀核酸。混合物在室温下孵育30分钟，然后在4°C下以12,000×g的离心力离心30分钟。小心地倾倒上清液，并用5毫升的冷70%乙醇洗涤沉淀物。这个洗涤步骤重复一次。倾倒后，用移液管小心去除剩余的酒精，然后敞开盖子让沉淀物风干。每个干燥的沉淀物重新悬浮在100微升的TE缓冲液中，并使用定量PCR进行分析。

2.7. 定量PCR
使用定量PCR（qPCR）检测提取的DNA的各种参数（表1）。PCR检测使用CFX96 Real-time System C1000 Touch（BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA）进行。PCR反应的总体积为20微升，包括2微升的模板DNA、0.5微升的重组白蛋白（20毫克/毫升，产品编号B9200S，New England Biolabs GmbH，Frankfurt am Main，Germany）和10微升的混合液。引物浓度根据具体检测方法不同而不同，分别为200纳摩尔（BacUni）、250纳摩尔（人类拟杆菌目）或400纳摩尔（ARGs）。对于基于Taqman的拟杆菌目qPCR检测，最终探针浓度为250纳摩尔，使用KAPA PROBE Fast混合液（产品编号KK4703；Kapa Biosystems，Wilmington，MA，USA）。对于基于SYBR Green的qPCR反应，则使用PowerTrack SYBR Green Master Mix（产品编号A46109；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。向样品中加入白蛋白以减少抑制作用。出于同样的原因，在用作qPCR模板之前，提取的DNA溶液需要稀释。使用基于16S rRNA基因的通用qPCR检测方法，对每个样本进行了1:4、1:16和1:64的稀释系列进行定量，并与未稀释的样本进行比较。当样本的基因组单位（GU）浓度随稀释因子增加时，表示存在抑制作用。最佳稀释倍数分别为：初次和二次澄清样本为1:64，MBR滤液和臭氧化水为1:4。

表1. 用于扩增不同目标基因的寡核苷酸以及循环程序。核苷酸符号遵循IUPAC命名法。扩增子大小约为平均值，可能因不同的细菌种类和菌株而异。具体的基因目标、扩增子大小和循环条件列在表1中。细菌消除效果是基于16S rRNA基因使用BacUni检测方法确定的[21]。qPCR进行了两种变体：扩增短序列（约105 bp）和长序列（约1483 bp）。检测较长序列的优点是可以优先检测到DNA完整的细菌。此外，较长序列的扩增提高了PMA处理的效率，因为随着序列长度的增加，至少有一个PMA分子结合到目标序列区域的概率也增加[22]。

在量化与人类相关的拟杆菌目时，生成了两种不同的扩增子大小（约167 bp和520 bp），而对于抗生素抗性基因只评估了一种扩增子大小。

2.8. 检测限
不同qPCR检测的检测限（LoD）是根据相应标准曲线的回归分析确定的。计算基于标准偏差（SD）和回归线的斜率，使用以下公式：
每个qPCR孔中理论上可检测到的拷贝数（以2微升模板DNA计），并考虑了DNA提取过程中的损失校正因子1.47、模板稀释因子4（适用于MBR滤液和臭氧化水样本）以及样本体积。LoD的计算结果如下：1.32 × 10^3 GU/L（BacUni short）、1.22 × 10^3 GU/L（BacUni long）、1.46 × 10^3 GU/L（Bacteroidales short）、2.07 × 10^3 GU/L（Bacteroidales long）、1.20 × 10^3 GU/L（tetM）、1.41 × 10^3 GU/L（ermB）、1.45 × 10^3 GU/L（blaTEM）、1.17 × 10^3 GU/L（sul1）和1.50 × 10^3 GU/L（intl1）。

3. 结果
该试点工厂主要处理生活污水。常规处理包括初次澄清、活性污泥工艺和二次澄清（图1）。曝气池和二次澄清器的出水以75:25的比例混合，然后进一步进行MBR和臭氧化的高级处理。

处理效果的微生物学表征包括通过流式细胞术测定的细胞计数和细菌生长潜力，以及通过分子生物学方法测定的细菌浓度和抗性基因浓度。初次澄清和二次澄清出水之间的差异提供了关于常规废水处理微生物效率的信息。另一方面，MBR和臭氧化后的额外处理提供了关于这些高级处理过程的效率以及第四级处理阶段的附加价值的信息。

3.1. 通过流式细胞术评估的完整细胞浓度和再生潜力
常规废水处理导致具有完整细胞膜的细菌浓度显著降低（图3A）。初次澄清的出水中含有4.4 × 10^7个完整细胞/毫升。与此值相比，二次澄清后的中位ICC值仅低0.4个对数单位。随后的MBR处理使ICC显著降低到2.0 × 10^5个完整细胞/毫升，相对于初次澄清的出水减少了2.3个对数单位。在滤液中检测到信号可以解释为之前附着在表面的细菌富集以及由于营养物质的存在而导致的再生。因此，它们的存在不能用来判断超滤膜（UF膜）的完整性。MBR池水和24小时MBR滤液中的流式细胞术指纹明显不同，证实滤液中的细菌并非来自MBR池（图3B）。MBR池样本主要由一个低核酸（LNA）比例较高的单一群体组成（LNA比例：88.7%），而MBR出水则表现出更多高荧光亚群体（LNA比例：19.4%）。图3. 沿处理流程的完整细胞计数（ICCs）变化以及超滤前后的流式细胞术指纹。（A）第0天的ICC值（细菌/毫升）反映了采样时的微生物状态，以及在22°C下培养七天后的情况。数据代表2023年11月7日至2024年10月9日期间12次采样的平均值。在臭氧化过程中，臭氧的特定浓度在0.20至0.62毫克臭氧/毫克DOC之间。（B）用SG和PI染色后，MBR池水和24小时MBR滤液的代表性流式细胞术指纹。臭氧化使ICC进一步降低到9.3 × 10^4个完整细胞/毫升，相当于整个处理流程中总体减少了2.7个对数单位。重复测量ANOVA和成对p值确认不同处理阶段之间的ICC差异具有统计学意义。

初次澄清和二次澄清过程的出水都表现出负的再生潜力，即在22°C下培养七天后细胞计数减少。初次澄清的出水在第7天的值约为第0天的三分之一，而二次澄清的出水则减少了四分之一。这在废水中是常见的现象。可能的原因包括细菌死亡、较大细胞比例的增加以及微生物群落组成的整体变化。总体而言，常规处理使再生潜力降低了0.6个对数单位。

经过MBR和臭氧化处理后的水显示出正的再生潜力，即在七天的培养期间细胞计数增加。与二次澄清的出水相比，MBR处理使第7天的ICC值显著降低，而臭氧化处理则略有增加。后者可以通过DOC向AOC的氧化转化来解释。第四级处理进一步将再生潜力降低了0.9个对数单位，使得整个处理流程中的总降低约为1.5个对数单位。与第0天的值相比，不同处理阶段之间的ICC差异具有统计学意义，MBR和臭氧化处理之间的差异除外。

3.2. 通过定量PCR评估的细菌浓度
细菌浓度也通过定量PCR进行了评估。16S rRNA基因的定量基于两种不同的扩增子大小，分别为约100 bp（图4A）和1500 bp（图4B），这些样本要么经过PMA处理，要么未处理。与完整细胞数量的情况类似，16S rRNA基因拷贝的浓度在整个处理过程中持续下降。MBR处理导致了特别显著的减少。使用PMA处理的样本在所有情况下都进一步降低了细菌信号，表明存在膜受损的细胞。使用LA-qPCR方法，16S rRNA基因的中位拷贝数低于SA-qPCR方法。在没有PMA处理的情况下，这种差异可以归因于LA-qPCR对DNA完整细菌的更高选择性。当应用PMA处理时，LA-qPCR比SA-qPCR更有效地排除了膜受损细菌的信号。PMA的效果在臭氧化后尤为明显，证实了这种氧化处理对细胞膜完整性的影响。图4。细菌浓度（细菌GU/L）通过16S rRNA基因qPCR扩增来量化，分别针对（A）短序列（约100 bp）或（B）长序列（约1500 bp），在11个月内的各个废水处理阶段进行测量（n = 12）。样品要么未经处理，要么用PMA处理。对于臭氧处理，具体的臭氧剂量在0.20到0.62 mg臭氧/mg DOC之间。细菌16S rRNA基因浓度的对数减少在SA-qPCR和LA-qPCR之间非常一致，差异主要由PMA处理引起。在没有PMA处理的情况下，常规处理使细菌基因浓度减少了约1.2个对数单位，在整个处理过程中减少了4个对数单位。使用PMA处理时，常规处理使细菌基因浓度减少了约1.2–1.4个对数单位，在整个处理过程中减少了4.7个对数单位。

3.3. 通过定量PCR评估的拟杆菌目（Bacteroidales）浓度
在处理过程中人类拟杆菌目浓度的变化作为人类粪便基因负荷去除的指标。对于总体细菌负荷，基于qPCR的量化基于两种不同的扩增子大小（图5A,B）。常规废水处理使粪便指示物浓度减少了约1.5–2个对数单位，而PMA处理后的值低于未使用PMA处理的情况（图5）。高级处理显著更好地去除了拟杆菌目，与二次澄清后的出水相比，额外减少了约4个对数单位。MBR处理的效果最佳，臭氧处理后的值仅略低于MBR处理后的值。臭氧处理未能产生更显著的减少可能是由于该参数的qPCR检测限约为103 GU/L（SA-qPCR的LoD：1.46 × 103 GU/L，LA-qPCR的LoD：2.07 × 103 GU/L）。

图5. 通过qPCR扩增（A）短序列（约167 bp）或（B）长序列（约520 bp）在11个月内的各个废水处理阶段量化拟杆菌目（GU/L）浓度（n = 12）。样品要么未经处理，要么用PMA处理。对于臭氧处理，具体的臭氧剂量在0.20到0.62 mg臭氧/mg DOC之间。虽然基于LA-qPCR的qPCR值在常规处理阶段与SA-qPCR的值没有显著差异，但长序列的扩增增加了高级处理后完全信号抑制的概率。结合PMA处理后，臭氧处理后检测不到拟杆菌目的信号，表明这种人类粪便标志物被有效减少到了检测限以下。

3.4. 抗生素耐药基因（ARGs）的浓度
本研究通过qPCR量化了四种常见的抗生素耐药基因sul1、tetM、ermB、blaTEM和与许多耐药基因相关的1类整合子-整合酶基因intl1。所有基因在特定废水中都能被检测到。与之前的微生物参数一样，检测是在有无PMA处理样品的情况下进行的。对于所有ARGs，常规处理导致浓度减少了1到2个对数单位（图6A–E）。常规处理对tetM、ermB和blaTEM的去除效果最佳，对sul1和intl1的效果稍差，而PMA处理则导致信号显著减少。对于其他研究的参数，MBR处理对ARGs的信号减少最为显著。特别是经过PMA处理后，臭氧处理的效果尤为明显，尤其是在sul1和intl1的情况下，信号减少了≥5个对数单位。对于其他ARGs，由于在MBR处理后信号已经接近检测阈值，臭氧处理的效果可能不那么明显。

3.5. 特定臭氧剂量与微生物处理效果之间的关系
臭氧处理在0.20到0.62 mg臭氧/mg DOC的特定剂量范围内进行。在本研究的臭氧浓度范围内，未发现任何分析参数与臭氧浓度之间的剂量-效应关系。拟杆菌目和intl1浓度与特定臭氧浓度之间的相关性作为一个例子（图7）。图7. 在11个月的研究期间（n = 11），（A）人类拟杆菌目（长扩增子）和（B）intl1信号（有无PMA处理）的对数减少与特定臭氧浓度（0.20和0.62 mg臭氧/mg DOC）之间的关系。对数减少指的是初次出水与臭氧处理后出水之间的浓度差异。剂量-反应关系的缺失部分可能是因为MBR处理后的信号接近检测阈值。拟杆菌目和ARGs的qPCR检测限分别计算为1.17 × 103 GU/L（sul1）和2.07 × 103 GU/L（拟杆菌目长扩增子）。还应注意的是，本研究中使用的臭氧浓度是针对有机污染物去除进行调整的。为了有效破坏遗传物质，可能需要更高的臭氧浓度。

3.6. 细胞外DNA的保留
核酸不仅存在于微生物的细胞内，也存在于细胞外。虽然MBR已被证明能有效阻挡细菌及其细胞内DNA，但我们探讨了细胞外DNA（exDNA）是否以及如何被有效保留的问题。为此，从MBR池和MBR滤液中取样。通过过滤去除细菌和细胞后，检查滤液中是否存在游离的exDNA。为此，通过沉淀浓缩无细胞滤液中的DNA，并通过qPCR分析16S rRNA基因的存在。MBR池中的样品平均含有1.0 × 106（±3.6 × 105）细菌基因组单位（GU）/L，而MBR滤液中的样品平均含有4.8 × 104（±8.1 × 103）细菌基因组单位（GU）/L。这种游离exDNA浓度在进料和滤液之间的差异相当于减少了95.3%。

4. 讨论
为了设计有效的缓解策略并为旨在减少环境传播的监管框架提供信息，了解不同处理阶段去除相关污染物的效果至关重要。本研究表征了一个废水处理试点工厂在一系列微生物参数去除效率方面的表现。结果证实了与常规废水处理相比，高级处理的微生物效益显著。这一发现与先前的研究一致，这些研究仅报告常规废水处理对卫生相关细菌和ARGs的减少有限[30,32]。这并不奇怪，因为废水处理厂历来并不是为了高效的微生物处理而开发的[5]，而是为了去除需氧量和营养物质。后者通过评估再生潜力间接测量，再生潜力代表了特定水体中营养物质支持的细菌最大浓度。据报道，营养物质对细菌群落组成的影响比物理化学因素更大[33]。为了确定可吸收营养物质的水平，在22°C下孵育开始和结束时进行了两次细胞数量测量。在整个处理过程中，ICCday7平均值从初次澄清后的2 × 107细胞/mL下降到臭氧处理后的5 × 105细胞/mL。后者低于人口密集地区地表水（如湖泊或河流）的典型细胞计数≥106个完整细胞/mL[34,35]。因此，以这种方式处理的废水排放不会增加可吸收营养物质的负荷，也不会给接收水体增加生长潜力。臭氧处理后的生物后处理似乎没有必要。实际上，最大细胞数量甚至与自来水相当，因为据报道停滞的地表水在再生测试中支持的最大细胞数量约为106个完整细胞/mL[36,37,38]。然而，必须承认，具体的细胞数量始终取决于再生过程中建立的细菌微生物组。

实际完整细胞浓度（ICCday0）从4 × 107细胞/mL下降到9 × 104细胞/mL（臭氧处理后），相当于减少了2.7个对数单位。最大的减少不出所料是由MBR处理引起的。由于滤液中含有之前附着在过滤后隔室表面的微生物，数据无法得出关于过滤性能或超滤膜完整性的结论。比较MBR池和MBR滤液的流式细胞术指纹显示了明显差异，表明滤液中的细胞是由于表面附着的细菌富集或再生造成的，而不是细菌穿透膜。数据表明超滤改变了细菌群落组成。使用反渗透膜[39]和其他超滤膜[40]的废水处理过程也得到了类似的结果。更长的水停滞时间会导致第0天的细胞数量增加到七天再生潜力的上限。

对于使用qPCR量化总体细菌负荷的MBR处理，获得了类似的对数减少，尽管基因组单位（qPCR）的绝对值不能直接与流式细胞术中的细胞/mL进行比较。在没有PMA处理的情况下，基于短扩增子和长扩增子的MBR去除率分别为3.5和3.4个对数单位（图4）。PMA处理将MBR去除率提高到3.9（短扩增子）和3.7（长扩增子）个对数单位。总体而言，基于16S rRNA基因拷贝数的qPCR数据证实MBR在处理过程中对细菌减少的效果最强。臭氧处理导致的总体信号减少不那么明显，尽管PMA处理在这一步的效果最强。这并不奇怪，因为氧化步骤预计会产生最大的膜损伤，尤其是在颗粒数量较低且臭氧需求较低时。已知臭氧既会导致膜损伤也会导致核酸损伤[41,42]。扩增子长度的影响较小（在没有PMA处理的情况下，它是DNA完整性的传感器），而PMA处理的效果显著（作为膜完整性的传感器），这表明在所应用的Ct范围内，臭氧主要造成了膜损伤而很少对DNA造成损伤。这一观察结果与J?ger等人的研究结果一致[43]，他们也使用了不同长度的扩增子进行了qPCR分析。作者报告在高级废水处理中（400 J/m2的UV处理后）发现了DNA损伤和其他影响PCR效率的DNA改变，但在本研究中使用的更高臭氧剂量（1 mg臭氧/g DOC）的臭氧处理后没有发现这些变化[43]。

与总体细菌浓度相比，拟杆菌目或抗生素耐药基因这一特定细菌组的对数减少更大。对于拟杆菌目，常规处理仅减少了约2个对数单位，而高级处理导致的减少接近或低于检测阈值。与总体细菌群体相比，更大的减少可能是因为这一细菌群体在废水处理厂中无法复制。拟杆菌目作为丰富的肠道专性厌氧菌，越来越受到水处理和废水监测的关注[44]。Demeter等人[44]强调，越来越多的文章报告使用遗传MST标记物来评估处理效果。拟杆菌目的高丰度和一致检测性使其具有比基于培养的粪便指示生物更高的平均预测潜力，并有助于测量不同处理阶段的大范围对数减少[44,45]。先前报道的拟杆菌目（Bacteroidales）遗传标记物的浓度范围为8至10 log10拷贝/升[46,47]，与我们在初级澄清后样品中发现的浓度非常吻合。此外，传统处理过程中拟杆菌目遗传标记物大约减少了2 log，这与活性污泥污水处理厂（WWTPs）中不同人类粪便微生物群（MST）qPCR标记物（如拟杆菌特异性crAssphages或PMMoV）的减少情况也相当一致（综述见[44]）。在应用新的指标体系时，一个关键问题是所测得的去除率的相关性。在一些分散式污水处理系统中，拟杆菌目和粪便指示菌的去除率相似[48]。然而，通常情况下，当比较qPCR和基于培养的粪便指示菌去除方法时，后者去除效果更为显著，从而导致对处理效率的高估[49]。去除率通常可以按以下顺序排列：基于培养的指示菌 > 生存能力qPCR > qPCR。结合PMA的活菌-死菌鉴别技术的qPCR被认为适合评估消除过程[49]。基于培养的指示菌（如大肠杆菌或肠球菌）的更快去除率意味着这些可培养细菌的浓度较低，使得准确量化其减少量变得更加困难[50]。对于膜处理过程，滤液中通常没有可培养的指示菌或只有非常低的浓度[51,52]，因此偶见的指示菌更多反映了膜完整性的破坏。总体而言，一个有用的粪便指示菌应具备以下特性：在粪便中含量高、易于检测、在环境中不生长、且在污水处理厂中的去除率与相关病原体相当[53]。拟杆菌目似乎满足了所有这些要求，唯一的问题是其去除率与病原体的比较情况。本研究没有比较拟杆菌目的去除率与传统粪便指示菌（如大肠杆菌或肠球菌）的去除率。不过，通常情况下，遗传标记物在污水处理过程中的持久性比可培养的粪便指示菌更强[54]。主要在消毒过程中会出现差异，因为消毒过程会对可培养性产生强烈影响，而DNA的持久性更强[50,55]。这意味着拟杆菌目DNA的去除率低于大肠杆菌的菌落形成单位，使得DNA标记物更难以在处理过程中完全消除。鉴于DNA标记物是难以在处理过程中去除的保守性指标，尽管拟杆菌目的PMA-qPCR信号具有高持久性和高丰度，但在MBR和臭氧处理后仍低于检测阈值，这一点值得注意。基于遗传标记物的效率评估有助于在可培养菌体数量较少或不存在的情况下进行微生物学评估。考虑到每天有大量游离遗传物质排放到环境中[56,57]，与单纯去除菌落形成单位相比，遗传物质的去除在未来可能变得更加重要。遗传学方法已被广泛用于监测抗生素耐药性，其原因在于检测协议简单、一旦获得DNA即可针对多种基因目标进行分析，并且结果能够快速获得。另一个好处是它可能有助于评估游离DNA在抗生素耐药性传播中的作用（这一作用可能被低估了[58]）。我们的数据支持了先前的研究结果，即传统处理方法不足以将抗生素耐药基因（ARGs）从水中去除[59]。平均而言，MBR和臭氧处理后，ARGs的去除量增加了3.8 log单位，其中ermB的去除量最大，达到了4.3 log单位。与其他微生物参数的研究结果一致，MBR处理对ARGs的去除效果最为显著。这与先前的研究结果一致，即超滤法在去除耐抗生素细菌方面最有效，而臭氧的效果则不如超滤法[32]。有研究报道，超滤法平均去除了5 log单位的ARGs和兼性致病菌，而经过微污染物处理的臭氧法平均去除了2 log单位。整个处理过程中，包括ARGs和兼性致病菌在内，总体去除量达到4-5 log单位（至少99.99%）被认为是合理的处理效率参考值[32]。我们的研究中也观察到了这种情况。最后但同样重要的是，可以确认MBR膜有助于去除细胞外DNA。通过0.1 μm滤膜的游离DNA减少了95.3%。该技术程序未考虑附着在较大颗粒或胶体上的游离DNA，而这些物质也被报道可以通过超滤膜去除[60]。此处观察到的减少量与不同超滤膜类型中游离DNA（含ARGs）减少量（95-99.8%）的结果相符[61]。这些作者讨论了主要的保留机制，包括尺寸排除、膜表面电荷和吸附作用[61]。总体而言，细胞外DNA的保留情况与先前的研究结果一致，即高级处理过程（如超滤或臭氧）能够将细胞外DNA的浓度降至最低[62]。尽管浓度较低，但细胞外DNA仍占处理后废水总DNA的80%[62]。

**结论**
本研究证实，MBR和臭氧处理的组合相比传统处理方法具有显著的微生物学优势。虽然传统处理方法在选定的微生物参数（细胞计数、细菌再生潜力、细菌基因负荷和抗生素耐药基因）方面仅实现了中等程度的减少，但第四阶段的处理效果显著更好。这主要归功于MBR过程，它带来了最大的对数减少量。除了去除细菌外，MBR还改变了细菌群落组成，并减少了95.3%的游离细胞外DNA。MBR处理后的低信号可能解释了臭氧处理未表现出明显的剂量-反应关系。然而，臭氧处理进一步减少了某些参数的值，尤其是那些接近qPCR检测限的参数。在研究的Ct范围内，臭氧的微生物学作用主要表现为对细菌膜的损伤，而非对DNA的损伤。使用高度丰富的拟杆菌目遗传标记物，可以在MBR超滤后量化去除效率，因为在超滤过程中通常没有可培养的粪便指示菌。尽管这种遗传标记物在处理过程中具有高持久性，但长扩增子qPCR和活菌-死菌鉴别技术的结合显示拟杆菌目的信号低于检测阈值，证实了处理效果的有效性。