《Journal of Virology》：Pseudovirus-mediated proximity labeling identifies candidate host cell membrane proteins involved in viral attachment
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病毒感染对人类构成重大威胁，正如COVID-19大流行所例证的那样。为了减轻相关损害，了解致病病毒的生物学特征至关重要。本研究报告了一种鉴定宿主细胞分子（包括病毒受体）的新方法，这些分子是病毒附着所必需的，被称为宿主细胞附着因子（Host Cell Attac
病毒感染对人类构成重大威胁，正如COVID-19大流行所例证的那样。为了减轻相关损害，了解致病病毒的生物学特征至关重要。本研究报告了一种鉴定宿主细胞分子（包括病毒受体）的新方法，这些分子是病毒附着所必需的，被称为宿主细胞附着因子（Host Cell Attachment Factors, HCAFs）。该方法利用邻近标记（Proximity Labeling, PL）技术；工程化的表达PL酶的伪病毒被应用于宿主细胞，在其结合并启动PL后，由于HCAFs预计定位于病毒附着位点附近，因此候选HCAFs通过PL过程被特异性标记。对流感HCAFs的分析使得多种候选分子得以鉴定。随后使用中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO）细胞的病毒附着实验表明，神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1, NRP1）可能作为流感病毒的HCAF。鉴于其简便性和快速周转，该方法适用于广泛的包膜病毒，包括需要紧急分析的流行病毒。
论文解读：基于伪病毒介导邻近标记的病毒附着因子鉴定
研究背景
大流行病毒对人类的持续威胁促使科学家们寻求快速识别宿主细胞附着因子（Host Cell Attachment Factors, HCAFs）的标准化方法。尽管血管紧张素转换酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2, ACE2）作为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的主要受体已被迅速鉴定，但未来大流行病毒未必遵循相似规律，且许多病毒的关键受体仍不明确。传统的重组刺突蛋白虽然可用于邻近标记（Proximity Labeling, PL），但其制备耗时且可能无法完全模拟真实病毒的生理状态。因此，本研究旨在建立一种基于伪病毒介导的PL技术，以实现对包膜病毒HCAFs的快速、生理相关性鉴定。
该研究由N.K.等学者完成，发表于《Journal of Virology》。
关键技术方法
研究人员采用了酶介导的自由基源（Enzyme-Mediated Activation of Radical Sources, EMARS）这一PL技术，利用辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）催化生物素基酪胺（Biotinyl Tyramide, BT）或荧光素酪胺（Fluorescein Tyramide, FT）产生短寿命自由基，标记邻近膜蛋白。通过两种策略生产携带HRP的伪病毒：一是利用稳定表达糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol, GPI）锚定HRP的包装细胞系（两步法）；二是将GPI-HRP质粒与病毒基因共转染至HEK293T细胞（一步法）。随后，利用质谱（Mass Spectrometry, MS）对标记产物进行蛋白质组学分析，并通过流式细胞术（Flow Cytometry, FACS）结合CHO-K1细胞模型验证候选分子的附着功能。
研究结果
包装细胞生产与表征
研究人员构建了表达人密码子优化HRP与补体衰变加速因子（Complement Decay-Accelerating Factor, DAF）或Thy1的GPI锚定区的慢病毒载体。通过比较发现，源自DAF-HRP包装细胞的伪病毒表现出更强的HRP信号强度和EMARS反应产物，尽管其感染效率较常规细胞略有下降。
一步法与两步法伪病毒的生产与表征
为解决稳定细胞系增殖缓慢的问题，研究人员开发了“一步法”，即在HEK293T细胞中同时转染pLenti-DAF-HRP与病毒基因。透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察显示，携带流感血凝素（Hemagglutinin, HA）的DAF-HRP伪病毒（Inf-HRP）与对照GFP伪病毒（Inf-GFP）在形态和直径上无显著差异，且金颗粒标记证实HRP成功展示于病毒表面。然而，Gostix检测表明，HRP表达伪病毒的生产滴度略低于GFP病毒，其中VSV-G伪病毒的感染性下降尤为明显。
伪病毒介导的EMARS反应
利用一步法生产的伪病毒在A549细胞上成功诱导了EMARS反应，SDS-PAGE检测到明显的标记条带，且Western blot证实了荧光素标记蛋白的存在。使用商品化试剂盒纯化的伪病毒亦能引发反应。对照实验（仅转染pLenti-DAF-HRP）未检测到产物，证实了功能性伪病毒颗粒的必要性。此外，胰蛋白酶（Trypsin）处理并未显著影响伪病毒对宿主细胞的附着及后续标记。
重组刺突蛋白与伪病毒的EMARS比较
在HeLa-A-T细胞上的平行实验显示，重组SARS-CoV-2刺突蛋白与伪病毒引发的EMARS条带图谱相似，但伪病毒产生的标记产物量相对较低，这可能与病毒颗粒与可溶性蛋白的空间位阻差异有关。
EMARS产物因刺突蛋白和流感HA而异
通过生产携带三种不同流感HA（PR8、M71、D313）及SARS-CoV-2、VSV-G刺突的伪病毒进行比较，发现不同病毒产生的EMARS条带模式存在差异。其中，PR8伪病毒产生的标记产物最为丰富，这与western blot显示的PR8病毒携带较高水平HRP相一致。
EMARS和蛋白质组学分析显示候选HCAF
对A549细胞经三种伪病毒（VSV-G-HRP、Inf-PR8-HRP及对照Inf-GFP）处理后的标记产物进行质谱分析，研究人员鉴定出若干候选膜蛋白。其中，膜辅因子蛋白（Membrane Cofactor Protein, CD46）、富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体4（Leucine-Rich Repeat-Containing G-Protein Coupled Receptor 4, LGR4）、柯萨奇病毒和腺病毒受体（Coxsackievirus and Adenovirus Receptor, CAR）等已知病毒受体被列为高丰度蛋白。值得注意的是，神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1, NRP1）在Inf-HRP样品中的相对丰度约为VSV-G样品的3倍。
利用候选HCAF表达的CHO-K1细胞进行病毒附着实验
研究人员选取NRP1作为目标，GPC3作为阴性对照，在CHO-K1细胞中瞬时表达并进行附着实验。流式细胞术分析显示，表达NRP1的细胞群体中，病毒附着（生物素信号）与NRP1表达水平呈显著正相关，而对照组则无此关联。这一结果证实了NRP1作为流感病毒HCAF的潜力。
讨论与结论
本研究建立了一种基于伪病毒介导的EMARS平台，用于快速筛选HCAF候选物。相较于重组蛋白，该系统仅需病毒刺突蛋白的基因信息即可开展工作，且更具生理相关性。尽管不同伪病毒的生产效率和标记效能存在差异（如VSV-G伪病毒产量较低），但该方法仍成功鉴定出NRP1作为流感病毒的潜在附着因子。NRP1此前已被报道为多种病毒的共同受体，本研究的发现进一步支持了其作为跨种属包膜病毒通用附着因子的可能性。该系统的简便性、成本效益及广泛适用性，使其成为阐明病毒入侵机制及开发新型抗病毒策略的有力工具。
