评估 STANDARD M10 和 Xpert C. difficile 检测方法在粪便中毒性艰难梭菌的检测效能

《Microbiology Spectrum》：Evaluation of the STANDARD M10 and Xpert C. difficile assays for the detection of toxigenic Clostridioides difficile in stools

　　

本研究旨在比较两种核酸检测 (NAAT) 方法，即 STANDARD M10 艰难梭菌 (M10) 和 Xpert C. difficile (Xpert) 检测，在粪便样本中毒性艰难梭菌菌株检测中的敏感性和特异性。这项前瞻性研究纳入了新鲜的腹泻粪便。在通过 C. difficile Quik Chek Complete 酶免疫测定 (EIA) 进行常规检测后，研究人员在选择性显色培养基 (ChromId C. difficile) 上并行测试了 M10 和 Xpert 以及毒性培养 (金标准)。M10 和 Xpert 检测由独立的操作员完成。研究人员还比较了 10 对天然粪便和粪便拭子配对样本的 M10 检测结果。共纳入 541 份粪便样本。毒性培养结果显示 60 份样本 (11.0%) 呈阳性，其中包括 32 份游离毒素阳性粪便。M10 和 Xpert 均表现出相当的敏感性 (100%) 和特异性 (97.5%)。M10 和 Xpert 检测获得的 tcdB 循环阈值 (Ct) 值高度相关 (皮尔逊相关系数: 0.909, P < 0.001)。在毒素 EIA 阳性/NAAT 阳性样本中，tcdB Ct 值的中位数在 M10 (25.50 对 32.39) 和 Xpert (23.70 对 31.15) 检测中均显著低于毒素 EIA 阴性/NAAT 阳性样本 (P < 0.001)。评估 Ct 值预测游离毒素检测能力的受试者工作特征曲线分析显示，M10 和 Xpert 的曲线下面积分别为 0.875 和 0.862。使用 400 μL 粪便拭子运输培养基获得的 Ct 值比使用 100 或 200 μL 时更接近天然粪便的 Ct 值。M10 C. difficile 检测显示出高敏感性和高特异性，并且与 Xpert 检测相当。

一、 研究背景、问题与研究目的

艰难梭菌 (Clostridioides difficile, C. difficile) 是抗生素相关性腹泻 (AAD) 和伪膜性肠炎 (PMC) 的主要病原体，也是住院患者医疗保健相关腹泻的主要原因。其临床诊断对指导治疗和感控至关重要。目前，欧洲临床微生物学与传染病学会 (ESCMID) 指南推荐采用两步诊断法，先采用高灵敏度的筛查方法，若为阳性，再用检测粪便中游离毒素的高特异性方法确认。核酸检测 (NAAT) 因可检测毒素基因 (如 tcdB) 而常被用作筛查工具。

目前，全球市场上有多种商业化的 NAAT 方法。STANDARD M10 艰难梭菌检测 (M10) 是一种新型的全自动实时荧光聚合酶链式反应 (PCR) 检测方法，但在该研究开展时，关于其性能的数据有限。Xpert C. difficile 检测 (Xpert) 是临床实验室广泛使用的 NAAT 方法。本研究的主要目的是评估 M10 与 Xpert 在检测粪便中毒性艰难梭菌方面的性能 (敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值) 并进行比较，所使用的金标准是毒性培养。次要目标是评估用于粪便保存的 Cary-Blair 培养基对 M10 检测结果的影响，即比较天然粪便样本与通过粪便拭子 (Copan) 采集的样本的检测结果。本研究旨在为实验室选择诊断方法提供新证据，并探讨与粪便样本保存形式相关的技术细节。相关研究成果发表在《Microbiology Spectrum》期刊上。

二、 主要技术方法

这是一项在法国圣安东尼大学医院临床细菌学实验室开展的前瞻性研究，共纳入了 541 份连续的新鲜非成形粪便样本。研究采用了以毒性培养为金标准的诊断性能评估框架。主要方法包括：1) 使用 C. diff Quik Chek Complete 酶免疫测定 (EIA) 检测谷氨酸脱氢酶 (GDH) 和游离毒素 (毒素 A 和 B)；2) 使用 STANDARD M10 和 Xpert C. difficile 两种独立的 NAAT 方法平行检测 tcdB 基因；3) 在选择性显色培养基 (ChromID C. difficile) 上进行厌氧培养以获得菌株，并使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF) 鉴定，再通过多重聚合酶链式反应 (PCR) 鉴定其毒性基因 (包括 tcdA, tcdB, cdtA, cdtB 等)；4) 通过基于毛细管凝胶电泳的 PCR 核糖体分型对菌株进行分型；5) 对于 NAAT 与培养结果不一致的样本，采用富集培养法进行复检以解决差异；6) 此外，还通过一个包含 10 对样本的对比实验，评估了使用不同体积 (100、200、400 μL) 粪便拭子运输培养基 (Cary-Blair 培养基) 对 M10 检测 Ct 值的影响。统计分析则包括性能指标计算、Ct 值比较 (曼-惠特尼 U 检验)、相关性分析 (皮尔逊相关系数) 以及受试者工作特征 (ROC) 曲线分析。

三、 研究结果

1. 样本特征与菌株分型

共纳入 541 份腹泻粪便样本。毒性培养结果显示 60 份样本 (11.1%) 呈阳性。在 60 份毒性菌株阳性样本中，只有 32 份 (53.3%) 通过 EIA 检测到游离毒素。毒性菌株属于多种 PCR 核糖体型 (RT)，包括 RT 014、106、126、002 等，其中 7 株还检测到二元毒素 (cdtA/cdtB) 基因。

2. M10 与 Xpert 的诊断性能比较

与毒性培养相比，两种 NAAT 方法均表现出极高的敏感性 (100%) 和特异性 (97.5%)。在通过富集培养解决不一致结果后，M10 的敏感性仍为 100%，特异性提升至 98.7%；Xpert 的敏感性略有下降 (98.3%)，特异性提升至 98.5%。M10 的 6 例假阳性样本和 Xpert 的 7 例假阳性样本，其 Ct 值均高于 30，提示菌载量可能很低。值得注意的是，GDH 检测漏检了 6 例毒性培养阳性样本，其检测毒性菌株的敏感性为 92.3%。

3. Ct 值的相关性、差异与预测效能

M10 与 Xpert 检测获得的 Ct 值高度相关 (皮尔逊相关系数 = 0.909)。在两种检测中，毒素 EIA 阳性/NAAT 阳性组的 Ct 值中位数均显著低于毒素 EIA 阴性/NAAT 阳性组 (M10: 25.50 对 32.39; Xpert: 23.70 对 31.15)。ROC 曲线分析显示，M10 和 Xpert 的 Ct 值预测游离毒素 EIA 结果的曲线下面积 (AUC) 分别为 0.875 和 0.862，通过约登指数确定的最佳截断值分别为 31.4 和 26.2。

4. 粪便运输培养基对 M10 检测的影响

在 10 对配对样本的比较中，使用 400 μL 粪便拭子运输培养基进行 M10 检测得到的 Ct 值 (均值 28.25) 最接近天然粪便的 Ct 值 (均值 28.18)。使用 100 μL 时，一份天然粪便中 Ct 值很高 (35.79) 的样本出现了假阴性结果。这表明增加样本量可以减少因运输培养基稀释效应导致的潜在灵敏度损失。

四、 讨论与结论

讨论部分总结：本研究证实了 M10 检测在检测粪便中毒性艰难梭菌方面具有与 Xpert 检测相媲美的高性能，两者的敏感性和特异性均非常出色，且优于 GDH 检测，支持了 NAAT 在两步诊断算法中作为筛查方法的优势。研究也观察到了少量假阳性结果，其 Ct 值均较高 (>30)，原因可能是极低的菌载量低于富集培养的检测限，或抗生素治疗后残留的 DNA 所致。关于 NAAT 在艰难梭菌感染 (CDI) 诊断中的作用，讨论指出，阳性 NAAT 结果不能区分真正的感染与单纯的毒性菌株定植，而游离毒素的检测与疾病严重程度更相关。虽然 Ct 值有助于预测游离毒素的存在，但设定通用的截断值是困难的，因为它受到不同 NAAT 扩增效率、所用 EIA 方法、艰难梭菌核糖体型产毒量差异以及肠道内环境调控毒素释放等多种因素的影响。因此，实验室若希望利用 Ct 值来预测游离毒素，需自行验证。关于粪便运输介质的研究表明，使用 400 μL 粪便拭子运输液可以减少因稀释效应导致的假阴性风险。研究也承认了其局限性，包括单中心研究、使用毒性培养而非临床诊断作为金标准，以及未对所有样本进行富集培养可能导致的敏感性高估。

研究结论翻译：总之，我们的研究表明，M10 艰难梭菌检测在检测毒性菌株方面显示出高敏感性和高特异性，其表现与临床实验室广泛使用的 Xpert 检测相当。