“那个粉色的亚马逊区域？”通过宏条形码技术，人们发现红藻床实际上是全球海洋生物多样性的隐藏热点区域

《Biological Conservation》：The pink Amazon?’ Metabarcoding reveals Rhodolith beds as hidden hotspots of global marine biodiversity

　　佩德罗·A.S.隆戈|古斯塔沃·M.莫里|辛西亚·P.塔尔盖塔|玛丽亚娜·P.德C.特莱斯|辛西亚·西蒙娜·戈麦斯·桑托斯|弗拉维奥·迪亚斯·帕索斯|安德烈·R.塞纳|吉列尔梅·H.佩雷拉-菲略
海洋生态与保护实验室（LABECMar），圣保罗联邦大学海洋研究所，圣保罗，巴西

摘要
红藻是海洋生态系统中的关键基础物种，能够增加底栖结构的复杂性并支持高度的生物多样性。然而，与红藻床相关的许多多样性仍然未知、难以接触且记录不足。在这里，我们评估了基于细胞色素c氧化酶亚单位I（COI）的宏条形码技术在评估与红藻栖息地相关的无脊椎动物和大型藻类多样性方面的潜力。样本采集自巴西海岸的两个地点：阿布罗洛斯银行（17°S）和凯马达格兰德岛（24°S）。宏条形码技术恢复了超过1800个大型藻类和无脊椎动物的精确序列变异体（ESVs），其中包括21个潜在的新记录，特别是对于大型藻类。分子和形态学方法的结合使得识别出超过450个假定物种成为可能。尽管有这些高数值，但由于巴西海洋分类群的参考条形码数据库存在重大缺口，当地生物多样性可能被低估了。尽管如此，我们的结果表明，在西南大西洋这些相对较小的红藻覆盖区域内，大约有0.2-1%的所有已知海洋物种存在。与其他高度多样化的生态系统（如热带雨林或珊瑚礁）不同，红藻床在全球范围内分布，从极地到热带地区都有，范围从潮间带到200米的深度。这种高局部多样性与广泛全球分布的结合使红藻床成为被忽视但可能重要的海洋生物多样性储存库。因此，我们的发现进一步证明了红藻床属于最多样化的海洋栖息地之一，值得更多关注以保护其生态功能、相关资源及生态系统服务。我们呼吁国际社会协调努力，改进生物多样性评估，并准确量化红藻栖息地的全球贡献。

1. 引言
地球的生物资源对人类福祉至关重要。因此，生物多样性成为对当代和未来几代人具有不可估量价值的全球资产。尽管其重要性得到了认可，但保护措施常常存在偏见——例如地理或分类上的差异——并且仍需大幅扩大规模，以跟上由人类活动驱动的生物多样性丧失的加速速度（Caldwell等人，2024年；Langhammer等人，2024年）。为解决这一紧迫问题，联合国环境规划署（UNEP）在20世纪90年代初制定了《生物多样性公约》（CBD）（《生物多样性公约》，2025年）。CBD的主要目标是保护生物多样性、可持续利用其组成部分以及公平公正地分享利用遗传资源所带来的利益，包括通过适当获取这些资源。该公约得到了160多个国家的签署，不仅代表了现代社会的愿望，也体现了全球利益相关者致力于设计有效生物多样性保护策略的承诺。这反过来成为科学家们寻求最佳方法来测量生物多样性和创建保护优先区域模型的重要课题（Hu等人，2022年）。
海洋覆盖了地球表面的70%以上和95%的宜居空间，估计支持着50万到1000万种海洋物种，尽管只有约20万种被正式描述，这代表了世界生物多样性的重要组成部分（《生物多样性公约》，2025年）。反映这一重要性，联合国宣布2021-2030年为“海洋科学促进可持续发展十年”，旨在扩展科学知识以支持健康和可持续的海洋。在海洋生态系统中，珊瑚礁被广泛认为是生物多样性热点，容纳了大约25%的所有海洋物种（Sobha等人，2023年）。然而，研究表明，红藻床——非关节状的自由生活珊瑚藻结节（根据Jardim等人的定义，2025年）——支持的区域生物多样性比例甚至更高，在某些地区超过30%（例如，Pereira-Filho等人，2012年；Nelson等人，2014年；Brasileiro等人，2016年；Veras等人，2020年）。最近的估计表明，全球红藻床的面积超过4×10^6平方公里（Fragkopoulou等人，2021年），大约是热带珊瑚礁全球范围的20%（Tuya等人，2023年），以及海带森林、海草草地和其他大型藻类床的1.6-2.5倍（Jayathilake和Costello，2018年；Jayathilake和Costello，2021年；Fragkopoulou等人，2022年；Tuya等人，2023年）。与珊瑚礁和许多以大型植物为主的栖息地不同，红藻床从极地到热带地区都有分布，深度从浅水区延伸到200米（Foster，2001年）。这种高局部多样性与广泛全球范围的结合使红藻床成为被忽视但可能重要的海洋生物多样性储存库。因此，我们的发现增加了越来越多的证据，表明红藻床属于最多样化的海洋栖息地之一，需要更多关注以保护其生态功能、相关资源和生态系统服务。我们呼吁国际社会协调努力，改进生物多样性评估，并准确量化红藻栖息地的全球贡献。

2. 材料与方法
2.1. 研究区域
2015年和2016年的南半球夏季，在巴西海岸两个不同纬度范围内的红藻床上进行了采样：阿布罗洛斯银行（AB，18°S；深度7-25米）和凯马达格兰德岛（QG，24°S；深度10-25米）（图1）。AB是巴西大陆架的重要延伸部分，以其复杂的珊瑚礁系统而闻名，那里拥有世界上最大的红藻床，面积约为20,000平方公里（Amado-Filho等人，2012年），而QG的红藻床则是最近被描述的，面积约为1平方公里，并与珊瑚礁相关（Pereira-Filho等人，2019年）。有关这些研究区域的详细描述，请参见Amado-Filho等人（2012年）和Pereira-Filho等人（2019年、2021年）。

2.2. 采样程序
在AB地区，选择了三个不同的采样点，深度分别为7米、15米和25米（图1）。在QG地区，选择了两个采样点，深度分别为10米和25米（图1）。在每个地点，使用SCUBA和混合气体潜水（TRIMIX）技术随机收集了大约60个红藻结节。每个结节单独放入500微米的尼龙袋中以防止附生物丢失，并小心地带到水面。样本在取出后立即用10%甲醛固定，以便对表层无脊椎动物进行形态学鉴定。此外，在AB地区的三个采样点共收集了六个红藻结节，每个点采集了两个结节（图1B）。在QG地区，收集了四个结节，每个对应不同深度的地点各采集了两个结节（图1C）。用于宏条形码分析的结节被选为代表每个地点最常见的形态类型。取出后，这些结节被固定在无水乙醇中，置于冰上，并避免阳光照射，以备后续的宏条形码分析。对于每个地点，来自同一地点的结节被合并，最终得到三个AB地区的综合样本和两个QG地区的综合样本用于宏条形码分析。

2.3 形态学鉴定
从甲醛固定的样本中鉴定出表层无脊椎动物。在实验室中，使用镊子、洗涤瓶和刷子小心地将这些无脊椎动物从红藻结节上分离出来，然后保存在70%乙醇中。初步鉴定是在较宽的分类学层次上进行的（大多数类群为纲，少数为门或目）。对于红藻床中三个最具代表性的类群——软体动物门（Mollusca）、多毛纲（Polychaeta）和端足目（Amphipoda）（Hinojosa-Arango和Riosmena-Rodríguez，2004；Veras等人，2020；Tamega等人，2024b），分类学信息可以更详细地获取（种、属或科级别），这些信息分别来源于Cesar等人（2024）、Cummings等人（2025）和Lino等人（2024）的研究。这些类群的凭证标本分别存放在坎皮纳斯州立大学（UNICAMP）的生物多样性博物馆（MDBio）（软体动物门）、里约热内卢州立大学（UERJ）的甲壳动物收藏馆（端足目）以及里约热内卢国家博物馆（多毛纲）。其余类群的标本鉴定结果在物种或更高分类水平上，保存在圣保罗联邦大学的“海洋生态与保护实验室”（LABECMar）。

关于AB和QG地区红藻床中大型藻类的信息来源于现有数据集（Rocha-Jorge，2015；Brasileiro等人，2016），这些数据集目前分别存放在里约热内卢植物园研究所的植物标本馆和圣保罗州“Maria Eneyda P. Kaufmann Fidalgo”植物标本馆。在AB地区，2009年使用两台遥控潜水器对33个地点进行了采样，每个地点每台潜水器拍摄了约20分钟的视频，并通过技术潜水采集了20个红藻结节，覆盖深度范围为20-70米。在QG地区，数据收集时间在2011年至2014年之间，采用基于水肺的100米水平剖面调查，每隔5米取样一次，深度范围为0-20米。有关数据收集和原始数据集的详细信息，请参见Rocha-Jorge（2015）和Brasileiro等人（2016）。

2.4 红藻结节的宏条形码分析
2.4.1 分子生物学程序
在实验室中，将用100%乙醇固定的红藻样本单独捣碎，然后使用DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen）从捣碎的材料中提取基因组DNA，并对制造商的方案进行了修改以增强细胞裂解效果（Broom等人，2008）。样品在65°C的水浴中孵育4小时，期间偶尔进行涡旋混合。通过柱层析提取后，使用100%乙醇和5M NaCl进一步沉淀DNA以提高DNA回收率。每个采样点的DNA提取都进行了两次。提取后的基因组DNA使用DNeasy PowerClean Cleanup Kit（Qiagen）进行纯化，并用NanoDrop分光光度计进行定量。所有样本随后被稀释至10 ng/μL的浓度。
线粒体COI基因的扩增采用Illumina标记方法，使用引物adapigHCO-R和adapmlCOlint-F（Leray和Knowlton，2015）。PCR反应进行了三次重复，使用Qiagen Multiplex PCR Kit，在以下热循环条件下进行：95°C下15分钟；94°C下10秒、56°C下90秒、72°C下90秒各45个循环；最后在72°C下延伸10分钟。每次测序的PCR产物被合并，并使用AMPure XP Beads（Agencourt）进行纯化。然后使用Illumina Nextera XT DNA索引和KAPA Taq HotStart PCR mix（Roche）进行索引，进行8次PCR循环。第二次纯化步骤也使用AMPure XP Beads（Agencourt）完成。文库定量通过实时PCR（qPCR）使用KAPA Library Quantification Kit（Roche）进行。片段大小分布和DNA浓度使用Bioanalyzer（Agilent High Sensitivity DNA Kit）进行评估，并将文库浓度标准化至4 nM。为了验证稀释效果，进行了第二次qPCR。一旦浓度在预期范围内，文库就被合并用于测序。文库变性使用NaOH进行，测序池用20% PhiX对照DNA（PhiX Control v3 Kit，Illumina）制备。测序在Illumina MiSeq平台上使用MiSeq Reagent Kit v3进行，生成2×300 bp的配对末端读段。测序数据已存入NCBI Sequence Read Archive（SRA），BioProject访问号为PRJNA1426902。

2.4.2 生物信息学流程
生物信息学处理遵循MetaWorks v1.12.0流程（Porter和Hajibabaei，2022）。原始配对末端读段使用SEQPREP v1.3.2（St. John，2016）合并，要求最小重叠长度为25 bp，重叠区域的Phred质量阈值为13，最大错配比例为2%，序列同一性至少为90%。引物序列使用CUTADAPT v2.6（Martin，2011）进行修剪，读段末端的最小Phred得分为20，允许整个合并序列中最多有三个不确定碱基（Ns），并丢弃修剪后长度小于150 bp的合并序列。此阈值仅用于去除严重截短的序列；保留的读段主要对应于预期的扩增子长度（约313 bp）。去重使用VSEARCH v2.21.1（Rognes等人，2016）进行，去噪包括错误校正和去除单碱基和双碱基，使用VSEARCH中实现的UNOISE3算法（Edgar，2016），得到精确序列变异体（ESVs）（Callahan等人，2017）。
由于Leray COI引物能够扩增具有不同线粒体遗传密码的多种类群，因此流程针对主要分类群（无脊椎动物、褐藻、绿藻和红藻）分别独立运行，使用ORFfinder中的相应线粒体遗传密码。假基因的识别和去除使用MetaWorks pseudogene filtering模块和ORFfinder v0.4.3（Porter和Hajibabaei，2022）进行，基于基于四分位数范围（IQR）的标准（1.5 × IQR）识别出的异常短或长的开放阅读框（ORFs）。

为了最小化潜在的错误标记效应（例如标签跳跃或索引跳转），应用了基于相对丰度的去噪后过滤步骤（Drake等人，2022）。当某个ESV的读段计数占所有样本中该ESV最大丰度的0.1%以下时，将其移除。没有设定固定的绝对读段计数阈值，因为去噪步骤已经去除了极稀有的序列。

2.4.3 分类学分配和验证
分类学分配使用RDP Na?ve Bayesian Classifier（Wang等人，2007）和Eukaryote COI Classifier v. 5.1.0（Porter和Hajibabaei，2018；Porter，2023）进行。为了获得较宽的分类学分辨率，没有应用额外的自助法截止值，确保至少在目级别有99%的准确性。对于更细的分类学分辨率，采用了更严格的阈值（属级别≥0.3，种级别≥0.8），从而在属级别获得大约99%的准确性，在种级别获得大约95%的准确性，遵循RDP的建议。仅保留海洋或半咸水类群。ESV的输出表见补充材料1中的表S1–2。
属和种级别的分配随后进行了系统发育验证。代表性的ESV序列与从BLAST搜索中获取的参考序列对齐，用于推断系统发育树，以评估基于分类器的分配与系统发育位置之间的一致性。树拓扑结构被用作主要标准，以确定每个ESV可以可靠标注的最高分类等级，基于其与已知身份的参考序列的聚类情况。只有当ESV位于得到良好支持且分类学上连贯的支系中时，才接受种和属级别的分配；否则，注释保守地限制在更高级的分类学级别。
BLAST比对统计信息，包括百分比同一性、查询覆盖率和E值，被用作补充证据，但在缺乏一致的系统发育位置时不足以进行种级别分配。为了最小化过度分类，分类学决策需要分类器信心、系统发育拓扑结构和序列相似性指标之间的共识。在系统发育位置指示性但不完全确定的情况下，使用 qualifiers cf.（confer）表示临时种分配。系统发育标准和选定的BLAST比对结果的汇编见补充材料2和3。
这一综合框架确保了保守和可重复的分类学分配，明确考虑了巴西海洋无脊椎动物和大型藻类在COI参考数据库中的不完全表示（见结果）。巴西海岸的新发现信息在补充材料1中的表S3–4中进行了评估和报告。物种分布信息来自OBIS（OBIS，2024）、WoRMS（WoRMS编辑委员会，2025）和AlgaeBase（Guiry和Guiry，2025），并辅以针对性的文献搜索。

2.4.4 形态学信息与分子信息的对比
对于具有较高分辨率形态学鉴定的红藻相关分类群（即软体动物门、端足目、多毛纲、褐藻门、 Florideophyceae纲和Ulvophyceae纲），我们检查了通过形态学方法和宏条形码方法鉴定出的物种之间的一致性和差异。对于仅通过形态学方法鉴定但未通过宏条形码方法检测到的物种，我们评估了BOLD和GenBank数据库中相应COI序列的可用性。物种的分类学信息参考了WoRMS（WoRMS编辑委员会，2025）和AlgaeBase（Guiry和Guiry，2025）的信息。
最后，为了识别巴西主要海洋无脊椎动物和大型藻类类群的COI序列数据中的普遍关键缺失，我们首先根据巴西生物多样性信息系统（SiBBr，2025）的记录编制了每个分类群的巴西物种列表。然后，检查每个物种在BOLD或GenBank数据库中是否有COI序列。

2.4.5 统计分析
为了评估两种方法（即形态学和宏条形码）的采样充分性，我们使用了稀释/外推曲线和样本覆盖率估计（补充材料1，图S1）。这些分析表明两个地点的样本完整性都很高（>90%的样本覆盖率）（见补充材料1，图S1）。
此外，我们使用S?rensen指数评估了β多样性，并将其分为周转率和嵌套度两个组成部分，遵循Baselga（2010）的方法。该分析应用于：（1）不同地点之间的大型藻类和无脊椎动物ESV组成的比较（AB vs. QG）；（2）不同方法之间的大型藻类和无脊椎动物目级别组成的比较（形态学 vs. 宏条形码）。分析基于ESV和目级别分类单元的存在-缺失矩阵。
所有统计分析均在R版本4.4.3（R Core Team，2025）中进行。稀释和样本覆盖率曲线使用iNEXT包（Hsieh等人，2016）生成，而β多样性指标则使用betapart包中的beta.pair函数（Baselga和Orme，2012）计算。

3. 结果
考虑到在ESV级别进行的分类学分配（即使用较宽松的截止值），宏条形码分析共发现了1054个无脊椎动物ESV，其中816个出现在AB地区，290个出现在QG地区。对于大型藻类类群，共发现了783个ESV，AB地区有660个，QG地区有181个。两个地点共有52个无脊椎动物类群和58个大型藻类类群。AB地区有764个独有的无脊椎动物和602个独有的大型藻类，而QG地区有238个独有的无脊椎动物ESV和123个独有的大型藻类ESV。
在无脊椎动物ESV中，环节动物门（主要由多毛纲代表）、节肢动物门（主要由软甲纲代表）、刺胞动物门（主要由水螅纲代表）、软体动物门（主要由腹足纲代表）和多孔动物门是最具代表性的类群（图2）。本研究还发现了另外八个动物门，但ESV数量较少（图2）。在大型藻类中，大多数记录的目属于Florideophyceae纲（红藻门），包括Ceramiales、Gigartinales、Corallinales和Nemaliales等超过20个目，这些目分别拥有最多的ESV（图3）。在AB地区发现了一种属于Bangiophyceae纲的红藻。褐藻门中的Phaeophyceae纲由8个目代表，最常见的目是Ectocarpales和Fucales（图3）。关于绿藻，宏条形码分析未检测到任何Ulvophyceae纲的代表。相反，所有鉴定出的序列都属于微藻纲Mamiellophyceae和Pyramimonadophyceae，包括来自Mamiellales、Dolichomastigales和Pyramimonadales目的14个ESV（补充材料1，表S2），其中10个ESV仅出现在AB地区，4个仅出现在QG地区。总体而言，来自AB和QG地点的rhodolith床在ESV（环境序列变异）水平上表现出明显的分类组成差异，前者（图2、图3）的生物组合更为多样化。无脊椎动物的β多样性值为0.91，大型藻类的β多样性值为0.86，这些差异主要由ESV的更替而非嵌套性驱动（图4A）。下载：下载高分辨率图片（554KB）下载：下载全尺寸图片

图2. 与Queimada Grande（A）和Abrolhos（B）地区的rhodolith床相关的主要分类单元（门/纲/目级别）检测到的ESV数量。数据基于COI基因的metabarcoding分析得出，并考虑了至少99%正确的分类分配的最低bootstrap阈值。星号（*）表示通过metabarcoding和传统形态学鉴定都检测到的分类单元。

图3. 与Queimada Grande（A）和Abrolhos（B）地区的rhodolith床相关的主要分类单元（门/纲/目级别）检测到的ESV数量。数据基于COI基因的metabarcoding分析得出，并考虑了至少99%正确的分类分配的最低bootstrap阈值。星号（*）表示通过metabarcoding和传统形态学鉴定都检测到的分类单元。

图4. 基于S?rensen指数的β多样性估计值，分为更替和嵌套性两个组成部分。（A）基于ESV组成存在-缺失矩阵的宏观藻类和无脊椎动物群落之间的β多样性（AB vs. QG）。（B）基于在更高目级别聚合的分类单元存在-缺失数据的两种方法（metabarcoding vs. 形态学鉴定）之间的β多样性。

在AB地区，metabarcoding识别出38种无脊椎动物和29种大型藻类的分类单元，而通过形态学分析分别只识别出25种和无脊椎动物22种（图2、图3）。同样，在QG地区，metabarcoding也发现了更多的分类单元——26种无脊椎动物和19种大型藻类，而形态学方法分别只识别出18种和无脊椎动物14种（图2、图3）。值得注意的是，metabarcoding揭示了一些在两个rhodolith床地点的形态学分析中未观察到的分类单元，包括无脊椎动物如Ascidiacea、Porifera和Nemertea，以及大型藻类如Batrachospermales和Acrosymphytales。相反，一些之前在AB和/或QG的rhodolith相关群落的形态学研究中报道的分类单元未能通过metabarcoding被识别出来。这些包括甲壳类如Tanaidacea和Cumacea、多板纲软体动物以及红藻如Nemastomatales和Sporolithales等（图2、图3）。两种方法之间的估计β多样性为0.38，其中嵌套性的贡献略高（图4B）。相比之下，大型藻类的β多样性较低（0.19），主要归因于更替（图4B）。

在应用了更严格的分类分配标准并进行系统发育验证后，有74种无脊椎动物分类单元和68种大型藻类分类单元被鉴定到属/种级别。完整的注释分类列表及其在两个采样地点的出现情况见补充材料1中的表S3–4。在属/种级别上有最多分类单元注释的分类单元是来自Florideophyceae纲（59属/种）和Phaeophyceae纲（8属/种）的红藻，以及来自Porifera门（22属/种）和Polychaeta纲（10属/种）的无脊椎动物（图5）。此外，更高分类分辨率的数据显示，有8个分类单元（即Florideophyceae、Phaeophyceae、Mollusca、Polychaeta、Anthozoa、Nemertea、Porifera和Xenacoelomorpha）包含了对巴西海岸的新记录，其中包括大西洋的几个新记录（图5、补充材料1、表S3–4）。

对于那些已有形态学鉴定生物多样性数据的六个群体（即Polychaeta、Mollusca、Amphipoda、Florideophyceae、Phaeophyceae和Ulvophyceae），每种群体中通过形态学和metabarcoding方法都只恢复了不超过7%的物种或属（图6、补充材料1、表S5–8）。一般来说，大多数分类单元是通过形态学方法识别的，但在metabarcoding分析中未被检测到（图6）。具体来说，对于Amphipoda和Ulvophyceae，通过形态学识别的物种没有一个是通过metabarcoding发现的（图6）。通过形态学鉴定发现的物种中有相当一部分在GenBank或BOLD数据库中缺乏COI序列，比例分别为多毛类35.1%和红藻41.1%，而对于端足类和绿藻则分别为75%和89.2%（图6）。然而，有153种具有可用COI序列的物种在所有群体中都没有通过metabarcoding被检测到。另一方面，metabarcoding也能够识别出一些在形态学研究中未记录的物种，特别是在Florideophyceae中（图6、补充材料1、表S5–8）。

当考虑在巴西各地出现的主要无脊椎动物和大型藻类分类单元时，已知物种总数与在线数据库中可用的COI序列数量之间仍存在显著差距（图7）。除了少数例外——如Decapoda、Rhodophyta和Sipuncula——大多数无脊椎动物和大型藻类群体的相应COI序列覆盖率通常低于50%（图7）。

在这项研究中，我们使用metabarcoding报告了与rhodolith床相关的超过1800个ESV，包括无脊椎动物和大型藻类。当整合形态学和分子方法时，记录了超过450个潜在物种。根据我们的结果，在研究的rhodolith床中检测到的物种约占目前所有已知海洋物种的0.2–1%（根据Census of Marine Life；O'dor, R., 2004; OBIS, 2024）。由于这些估计仅基于南大西洋两个浅水地点的个体rhodolith结节提取的DNA，因此主要反映了直接与它们相关的生物多样性，这可能是对受益于rhodolith栖息地的海洋生物真实多样性的保守低估。

在这种情况下，增加对rhodolith研究的财政投资对于获得可靠的全球生物多样性估计至关重要，并进一步支持将rhodolith床视为具有全球重要性的、潜在巨多样性的栖息地的观点。作为参考，其他目前被认为是巨多样性的生态系统的全球生物多样性估计——例如亚马逊雨林（容纳了地球上大约10%的所有已知物种；Zapata-Ríos et al., 2021）和珊瑚礁（估计支持约25%的海洋生物多样性；Sobha et al., 2023）——只有在数十年的投资和协调努力之后才成为可能。相比之下，对于rhodolith栖息地，类似的大规模评估仍然缺乏。鉴于rhodolith床在全球各个纬度和海洋盆地中的分布——与这些生态系统的更受地理限制的热带范围形成对比，它们拥有高物种丰富度、多样的生态位和功能多样性潜力。

因此，rhodolith床需要来自多个决策领域的利益相关者的更多关注，包括海洋保护、渔业管理、科学研究和沿海规划（Tuya et al., 2023）。此外，应用多标记metabarcoding方法和开发更全面、更精细的巴西海洋分类单元参考条形码数据库可能会揭示更高的生物多样性水平。然而，这样的进步依赖于对科学研究的持续财政投资，而这在全球范围内仍然不足，特别是在全球南方（Tuya et al., 2023; Herrera et al., 2024; Iacaruso et al., 2025）。

我们的metabarcoding分析揭示了AB和QG地点与rhodolith床相关的超过1800个ESV，β多样性模式主要由物种更替驱动，表明地理上相距较远的床之间存在显著的物种替换。这些结果突显了空间异质性和地理距离在构建rhodolith相关多样性中的作用。鉴于rhodolith床的全球分布范围，地理上相距较远的地点很可能拥有不同的动物和植物组合，这些组合不仅在丰富度驱动的嵌套性上有所不同（通常与环境过滤下的物种丢失相关），而且主要通过物种替换来区分（另见Longo et al., 2025和Lino et al., 2024的进一步讨论）。因此，更广泛的空间调查可能会揭示更大的分类独特性。由于许多rhodolith床的采样仍然不足，生物多样性积累曲线——特别是对于巴西来说——远未达到稳定状态（Tuya et al., 2023; Schubert et al., 2024），扩大和协调的采样工作可能会大幅提高当前对rhodolith相关生物多样性的估计。

在这种情况下，metabarcoding特别有效，平均检测到的宏观藻类和无脊椎动物分类单元是形态学分析在更广泛分类分辨率（即目或纲级别）下的1.4倍。对于无脊椎动物，方法之间的差异主要由嵌套性驱动，表明通过形态学识别的分类单元大部分包含在metabarcoding恢复的多样性中。相比之下，对于大型藻类，每种方法检测到的目部分不同，尽管方法之间的β多样性较低。尽管如此，更替仍然分别占无脊椎动物和大型藻类方法之间总体β多样性的大约44%和58%，表明两种方法在目级别上有显著的互补性。

分子分析在检测固定生物如海绵、海鞘和苔藓虫方面特别有效，这些生物在两个rhodolith床中都非常典型，但在本研究中无法通过形态学方法识别。由于样本保存和处理过程中诊断特征的丢失以及隐秘物种的频繁出现，这些分类单元的鉴定和量化非常具有挑战性（Cahill et al., 2018; Camillo et al., 2018）。因此，rhodolith相关大型动物的生物多样性评估经常排除这些生物（例如，Hinojosa-Arango and Riosmena-Rodríguez, 2004; Otero-Ferrer et al., 2019; Veras et al., 2020; Stelzer et al., 2021; Pérez-Peris et al., 2023; Roos et al., 2024; Macedo et al., 2025；但参见Trejo et al., 2021; Solano-Barquero et al., 2022; Pierri et al., 2024; Tamega et al., 2024a）。在这些生物中，多孔动物成为我们metabarcoding数据集中第二丰富的分类单元群体，并被认为是rhodolith栖息地的关键组成部分（Avila et al., 2013; Moura et al., 2016; Longo et al., 2020）。它们对栖息地稳定性和结构复杂性有重要贡献，作为rhodolith栖息地级联中的重要次级促进者（Avila et al., 2013; Pereira-Filho et al., 2015; Bulleri et al., 2025）。因此，将固定生物纳入生物多样性监测对于准确描述被rhodolith覆盖的沿海环境至关重要。这项研究首次尝试检测和描述西南大西洋两个关键rhodolith床中的固定生物多样性，记录了三种新的海绵：Pione vastica、Protosuberites denhartogi（之前在其他地方的rhodolith上也有记录；Longo et al., 2020）和Hooperia anfractuosa，后者是大西洋的首次记录。

metabarcoding在检测小型和中型动物分类单元方面也更为高效，包括线虫、纽形动物、介形虫、轮虫、扁形动物和海洋螨虫（主要是蛛形纲）。这些生物在有机物再矿化和海洋食物网中起着关键作用（Nascimento et al., 2012; Pascal et al., 2019），然而rhodolith栖息地中的中型动物多样性仍然研究不足（但参见Neto et al., 2021; Rebecchi et al., 2022; di Montanara et al., 2025; Santos et al., 2025）。最近的研究表明， metabarcoding技术——尤其是使用18S rRNA标记——能够有效地捕捉红藻礁床中的中型底栖生物多样性，尽管分辨率较低，但能够恢复更广泛的分类学覆盖范围（Coppo等人，2024年），这一模式也得到了我们基于COI的metabarcoding结果的证实。我们特别强调了纽形动物Cephalotrichella sp.和Micrura sp.的存在，这是西南大西洋的新记录；同时发现了原产于印度-太平洋地区的无体动物Convolutriloba longifissura，该物种最近被认定为可能入侵加勒比海域的物种，并对本地珊瑚育苗场造成了影响（Hawthorn等人，2025年，预印本）。值得注意的是，metabarcoding数据中还检测到了一些较大的底栖大型动物，这些动物并不直接与单个红藻结节相关（例如较大的十足类、棘皮动物和海绵），以及主要是或部分是浮游性的生物——包括各种头足类、桡足类和刺胞动物。这些发现至少部分反映了这些生物在红藻礁床周围环境中的存在（这一空间维度在我们的无脊椎动物多样性形态学分析中并未考虑，我们的分析主要集中在附生和隐居底栖生物群落上）。例如，在当前样本中鉴定出的桡足类Clausocalanus furcatus和Temora stylifera是Abrolhos珊瑚礁上浮游动物群落的已知组成部分（Figueirêdo等人，2018年）。此外，直接和间接证据都表明在巴西海岸其他地区的红藻礁生境中也存在章鱼物种（Batista和Leite，2016年；Sales等人，2019年；Tamega等人，2024a年）。尽管在我们的数据集中没有检测到章鱼，但在最终分析中发现了11种属于Oegopsida和Spiida目的头足类物种。因此，metabarcoding调查可以揭示那些受益于红藻礁床但与单个结节没有直接关联的无脊椎动物群体，而这些群体在传统的形态学生物多样性评估中常常被忽视。特别是刺胞动物，它们的生命周期通常包括浮游的水母阶段和底栖的息肉阶段。因此，它们在metabarcoding数据中的出现可能反映了它们存在于周围水域中，或者它们的底栖息肉形态较小、隐蔽且难以通过形态学方法识别（Sun等人，2025年）。对于Campanularia hincksii、Clytia gracilis和Zancleopsis dichotoma等水螅类来说，情况可能也是如此，这些物种之前已被发现与海绵、海鞘、珊瑚-藻类堆积物以及附着在软体动物和甲壳动物上的生物相关联（Marques等人，1999年；Kelmo和Attrill，2003年；Miranda等人，2011年；Maggioni等人，2021年）。具有环热带分布的Alatina alata通常以水母形态生活在较深的水域，但在繁殖期间会迁移到浅水珊瑚礁区域（Lawley等人，2016年；Morrissey等人，2020年）。尽管在我们的数据集中没有检测到章鱼，但在最终分析中发现了11种属于Oegopsida和Spiida目的头足类物种。因此，metabarcoding调查可以揭示那些受益于红藻礁床但与单个结节没有直接关联的无脊椎动物群体，而这些群体在传统的形态学生物多样性评估中经常被忽视。刺胞动物尤其如此，因为它们的生命周期通常包括浮游的水母阶段和底栖的息肉阶段。因此，它们在metabarcoding数据中的出现可能反映了它们存在于周围水域中，或者它们的底栖息肉形态较小、隐蔽且难以通过形态学方法识别。对于Campanularia hincksii、Clytia gracilis和Zancleopsis dichotoma等水螅类来说，情况可能也是如此，这些物种之前已被发现与海绵、海鞘、珊瑚-藻类堆积物以及附着在软体动物和甲壳动物上的生物相关联（Marques等人，1999年；Kelmo和Attrill，2003年；Miranda等人，2011年；Maggioni等人，2021年）。具有环热带分布的Alatina alata通常以水母形态生活在较深的水域，但在繁殖期间会迁移到浅水珊瑚礁区域（Lawley等人，2016年；Morrissey等人，2020年）。尽管在我们的数据集中没有检测到章鱼，但在最终分析中发现了11种属于Oegopsida和Spiida目的头足类物种。因此，metabarcoding调查可以揭示那些受益于红藻礁床但与单个结节没有直接关联的无脊椎动物群体，而这些群体在传统的形态学生物多样性评估中常常被忽视。刺胞动物尤其如此，因为它们的生命周期通常包括浮游的水母阶段和底栖的息肉阶段。因此，它们在metabarcoding数据中的出现可能反映了它们存在于周围水域中，或者它们的底栖息肉形态较小、隐蔽且难以通过形态学方法识别。对于Campanularia hincksii、Clytia gracilis和Zancleopsis dichotoma等水螅类来说，情况可能也是如此，这些物种之前已被发现与海绵、海鞘、珊瑚-藻类堆积物以及附着在软体动物和甲壳动物上的生物相关联（Marques等人，1999年；Kelmo和Attrill，2003年；Miranda等人，2011年；Maggioni等人，2021年）。具有环热带分布的Alatina alata通常以水母形态生活在较深的水域，但在繁殖期间会迁移到浅水珊瑚礁区域（Lawley等人，2016年；Morrissey等人，2020年）。尽管在我们的数据集中没有检测到章鱼，但在最终分析中发现了11种属于Oegopsida和Spiida目的头足类物种。因此，metabarcoding调查可以揭示那些受益于红藻礁床但与单个结节没有直接关联的无脊椎动物群体，而这些群体在传统的形态学生物多样性评估中常常被忽视。即使这些隐蔽的息肉形态在环境中的数量通常较低，但对于Scyphozoan Nausithoe maculata来说并非如此。这种Stephanoscyphistomae虽然在巴西的珊瑚碎屑和残骸中被记录到（Morandini和da Silveira，1999年），但尚未有报道指出它与红藻礁有关——尽管它在某些红藻礁床上的分布非常普遍（未发表的数据）。它之前未被记录的原因可能是由于难以分离和量化这些小型且脆弱的生物，这些生物高度附着在结节之间的空隙中（PASL，个人通讯）。因此，metabarcoding分析在检测这种常见但被忽视的物种方面证明是有效的，这种物种在其所占据的生境的物理结构和生态动态中可能发挥重要作用（Uriz等人，1992年）。

4.1.2. 大型藻类的生物多样性
大型藻类物种中也普遍存在异形生命周期。因此，基于形态学的手段往往难以检测或区分微观和/或隐蔽的形态和生命阶段，导致对某些物种完整生命周期的理解存在空白（Peters等人，2015年；Kowalska等人，2019年）。红藻礁作为种子库，容纳了各种大型藻类的休眠阶段（Fredericq等人，2014年；Krayesky-Self等人，2017年）。在这种情况下，metabarcoding已成为揭示这些隐藏多样性的宝贵工具（Fredericq等人，2019年；van der Reis等人，2024年）。此外，DNA条形码技术对于区分亲缘关系密切且形态相似的物种至关重要，从而提高了生物多样性调查的分辨率（Kowalska等人，2019年）。因此，我们的metabarcoding数据相比仅基于形态学的先前信息，额外发现了52个物种记录，支持了这种方法扩展我们对红藻礁床上大型藻类生物多样性认识的潜力。这里呈现的数据提供了关于大型藻类分布的宝贵见解。例如，一些之前仅在巴西海岸其他地点已知分布的物种——Dictyota mayae、Gracilaria suzanneae和Halymenia cearensis——在这里首次在AB地区被记录到。同样，Hooperia cf. divaricata也是巴西南部的新记录。在AB和QG的红藻礁床中，还记录到了一种新的Colpomenia物种，这不是C. sinuosa，后者是巴西已知分布最广的物种。我们的样本一致被归类为C. claytoniae，其最近已知的分布是在南非。此外，通过本研究中的metabarcoding分析鉴定出的其他几种物种也是西南大西洋的新记录。例如，Monosporus cf. indicus的记录将该物种的分布范围从加勒比海扩展到了AB地区（巴西东北部）。同样，之前仅在北大西洋报道的小型丝状褐藻Discosporangium cf. mesarthrocarpum也在Abrolhos被发现，可能以隐蔽的形式生长在红藻结节内。Dictyota cf. ceylanica在AB地区的记录也是西南大西洋的新记录。虽然该物种之前已在加勒比海水域被报道（Vieira等人，2021年），但我们的序列与那些作者报告的印度洋样本100%一致。从AB地区报道的Laurenciella sp.与任何已描述的物种都不匹配，包括目前仅在巴西水域报道的L. marilzeae。然而，其他尚未描述的Laurenciella物种已在巴西被报道（Cassano等人，2012年），尽管没有可用的COI序列进行比较。此外，还有两种大型藻类首次在大西洋被记录：红色藻类Neoizziella asiatica之前仅在中美洲的太平洋沿岸被发现，以及Dissimularia属。我们从AB地区获得的Dissimularia sp.序列无法归类到该属目前已知的四个物种——D. dactylocarpa、D. umbraticola、D. withallii和D. tauensis——这些物种都局限于太平洋盆地（Kraft和Saunders，2014年）。这一结果表明西南大西洋可能存在一个独特的、尚未描述的物种。同样，我们的数据集中还指示了其他潜在的新物种。例如，属于红色丝状藻类的Tepoztequiella sp.序列无法归类到已描述的两种物种T. muriamans或T. rhizoidea中。Kapraunia sp.的序列既不与之前在巴西报道的K. silviae匹配，也不与来自加勒比海的K. schneideri或任何其他远缘物种匹配。同样，我们检测到了丝状褐藻Spermatochnus sp.，也无法归类到目前在该属中唯一已知的物种Spermatochnus paradoxus。总的来说，这些发现突显了红藻礁床可能隐藏着大量的多样性，包括知之甚少的物种和潜在的新海洋大型藻类物种，这些物种无疑将从包括多种标记在内的更具体分析以及形态学研究中受益。这里报告的高多样性值，加上多个未描述的大型藻类物种的迹象，强调了迫切需要增加全球投资以更好地了解大部分未被探索的海洋生物多样性（Lelièvre等人，2025年）。小型无脊椎动物和大型藻类是发现新物种潜力较大的群体（Appeltans等人，2012年）。要获取这些隐藏的多样性，需要跨生境的协调科学活动、继续培训专家分类学家，以及组织和数字化生物收藏（Britz等人，2020年；Nachman等人，2023年；Rogers等人，2023年），特别是在全球南方的低收入和中等收入国家。这些努力将使这些地区能够更好地评估和管理其海洋资源，并为全球生物多样性知识做出贡献（Rogers等人，2023年；Lelièvre等人，2025年）。此外，这些努力对于建立必要的条形码参考数据库至关重要，以充分发挥metabarcoding在生物多样性探索中的潜力。

4.2. 基于COI的metabarcoding的局限性
尽管metabarcoding在红藻礁床中揭示了显著的多样性，传统的形态学鉴定方法在捕捉更广泛的栖息地生物多样性方面也显示出互补潜力。这种互补性已在不同的底栖海洋群落中观察到（例如，Cahill等人，2018年；Keck等人，2022年；Varrella等人，2025年），并在本研究中的红藻礁床得到了证实。metabarcoding特别擅长检测稀有、隐蔽或形态上难以区分的物种，并能为通常需要专门鉴定或多种技术的复杂群体提供高水平的分类学分辨率（Cowart等人，2015年；Deiner等人，2017年）。例如，在红藻门（Rhodophyta）中，通过分子方法鉴定出的几种物种在传统调查中缺乏相应的分类学分辨率匹配，尽管一些低分辨率的记录（例如属或科水平）可能对应于它们（见补充材料1，表S5）。即使是通过metabarcoding检测到的物种较少，也产生了值得注意的独特记录，包括多毛类Parougia albomaculata和腹足类Dolabrifera edmundsi在巴西的潜在首次出现（补充材料1，表S3）。同时，许多物种仅通过传统分类学方法被检测到，无论是目级（例如Tanaidacea、Cumacea）还是属/种级（见补充材料1，表S5–8）。这些物种在metabarcoding结果中的缺失部分可以解释为我们用于比较的形态学鉴定基于更多的样本，包括更广泛的结节特征，并且某些情况下涵盖了不同的年份（尽管是在同一季节）。因此，metabarcoding在特定时间和地点捕获的生物多样性快照可能无法反映通过传统方法识别的全部物种范围（Cowart等人，2015年）。扩增和测序过程中的问题——如引物选择、扩增循环次数、依赖单一分子标记以及特定分类群的偏差——也会影响metabarcoding结果的质量和有效性，从而导致对多样性和群落组成的估计更准确或不准确（Cowart等人，2015年；Leray和Knowlton，2015年；Aylagas等人，2016年）。尽管PCR循环次数常被视为偏差的来源，但不同研究表明其影响较低或不显著（Sipos等人，2007年；Krehenwinkel等人，2017年；Vierna等人，2017年），特别是在使用退化引物时（Krehenwinkel等人，2017年）。在这种方法学背景下，标记选择在确定分类学恢复方面起着核心作用。在可用的标记中，COI被广泛使用并推荐用于实现高级动物和大型藻类的高分类学分辨率，尤其是在物种水平（Hebert等人，2003年；Aylagas等人，2016年；van der Reis等人，2024年）。使用COI进行分类学分配已被证明比18S更可靠，特别是对于后生动物和红藻门，使其非常适合生成准确的分类学清单并揭示隐藏的生物多样性（Wangensteen等人，2018a；Wangensteen等人，2018b）。尽管COI通常具有更高的分类学分辨率（Lobo等人，2017年；Wangensteen等人，2018a），但结合使用额外的遗传标记和多个COI引物集可以扩大可检测物种的范围（Hajibabaei等人，2019年；Leite等人，2021年；Varrella等人，2025年），并可能有助于填补我们在metabarcoding结果中观察到的一些空白。例如，Fredericq等人（2019年）使用16S标记进行宏条形码分析时，在墨西哥湾检测到了一组与红藻相关的绿藻，而这些绿藻并未在我们基于COI的巴西红藻分析中被发现（尽管传统方法鉴定出了37种Ulvophyceae）。由于存在内含子，不建议使用COI标记来研究绿藻，而像tufA这样的其他标记可能更适合捕捉其多样性（Saunders和Kucera，2010年；Borer等人，2025年）。至于褐藻，虽然传统方法仅鉴定出27种，但Borer等人（2025年）利用基于rbcL的宏条形码技术检测到了更多种类。此外，DNA提取和扩增问题可能会影响某些分类单元的检测结果，导致它们在基于宏条形码的生物多样性评估中被低估。例如，尽管软体动物和端足类是与红藻床相关的主要群体之一（Navarro-Mayoral等人，2020年；Cesar等人，2024年；Longo等人，2025年），但通过宏条形码技术仅检测到5种软体动物，而没有检测到任何端足类。这些结果与通过传统方法鉴定出的77种软体动物和35种端足类形成了鲜明对比（补充材料1，表S6、8）。其他研究者也报告了类似的情况，即软体动物的检测率较低（Lejzerowicz等人，2015年；Leray和Knowlton，2015年；Cahill等人，2018年）。对于软体动物来说，它们富含黏液的特性可能会干扰DNA提取（Huelsken等人，2011年；Adema，2021年）。此外，宏条形码技术中低检测率通常与那些具有更硬结构的生物相关（Derycke等人，2021年），这适用于大多数甲壳类和软体动物。另一种可能是，巴西软体动物和端足类在COI序列数据库中的覆盖率较低（腹足类物种的覆盖率为18.5%，双壳类为19%，多板纲为16.2%，端足类为24.5%），这可能是导致这些分类单元代表性不足的原因。对于分布在欧洲的生物，软体动物和甲壳类的条形码覆盖缺口估计为47%或更高（Weigand等人，2019年；Leite等人，2020年），这仍然比巴西观察到的缺口要好得多。同样，其他在宏条形码结果中未出现但在传统方法中检测到的分类单元也显示出COI序列覆盖率的显著不足：例如，Tanaidacea仅有14%，Isopoda为16.1%，而分布在巴西的绿色大型藻类（Ulvophyceae）仅有5.8%拥有可用的COI条形码。在分析的43个分类单元中，只有六个类别的巴西物种COI覆盖率超过50%：十足类（955种中的57.2%）、红藻门（532种中的53.2%）、水母纲（16种中的81.25%）、立方水母纲（4种中的100%）、头足类（91种中的80.2%）和管水母纲（39种中的59%）。总体而言，本研究中分析的巴西大型藻类物种中仅有40.8%和23%的无脊椎动物物种在参考数据库中拥有可用的COI序列。因此，巴西物种缺乏可用条形码的现象支持了这样一种假设：宏条形码未能检测到的大部分多样性是由于分类鉴定步骤中的限制，主要是由于参考数据库不完整（Cowart等人，2015年；Leray和Knowlton，2015年；Aylagas等人，2016年）。这一解释与越来越多的文献一致，这些文献强调了建立稳健、精心维护且全面的参考条形码数据库的必要性（例如，Cowart等人，2015年；van der Loos和Nijland，2021年；Lavrador等人，2024年）。实现这一目标需要地方性努力，以扩充包含多种栖息地和地区生物多样性的现有数据库，从而充分发挥宏条形码技术的潜力（Lobo等人，2017年；Wangensteen等人，2018a）。在当前参考数据库存在较大缺口的情况下，采用更为保守的分类鉴定方法（特别是在更细的分类级别）是必要的，以减少误鉴定的情况。然而，这种方法不可避免地会导致物种级别的分辨率降低，这从最终分类列表中无法可靠鉴定的ESVs的高比例可以看出。因此，我们强调应继续进行形态学评估，因为它们继续提供关于红藻生物多样性的独特和补充信息。我们的研究突显了巴西物种COI条形码覆盖率的极低，这可能反映了条形码技术和eDNA/社区DNA宏条形码研究在地理分布和资金支持方面的重大偏差。大多数相关研究——包括比较分子方法和传统方法的研究——主要集中在全球北方，特别是在欧洲和北美沿岸（Keck等人，2022年；Iacaruso等人，2025年）。相比之下，尽管全球南方拥有地球上许多最濒危的生物多样性，但该地区的代表性仍然严重不足（Keck等人，2022年；Iacaruso等人，2025年）。

4.3. 结论性评论

这项工作首次尝试使用结合基于COI的宏条形码技术和传统方法的综合方法来描述南大西洋红藻床的生物多样性。尽管存在单标记宏条形码技术的局限性、参考数据库不完整以及其他方法学限制，我们的结果仍揭示了多个分类单元中极高的生物多样性，突显了红藻床的生态重要性以及它们所蕴含的尚未充分探索的海洋多样性。这些发现强调了协调科学努力的紧迫性，以扩展分类学专业知识，加强生物标本收藏，并创建精心维护的条形码参考库，特别是针对小型无脊椎动物和隐秘的大型藻类。鉴于这里指出的几个潜在的新记录和候选新物种需要进一步确认，我们强烈鼓励未来开展针对红藻相关物种的新条形码序列生成工作，并呼吁开展大规模的国际研究计划——特别是那些支持全球南方综合生物多样性评估的项目——以充分发挥宏条形码技术在理解和保护全球红藻生态系统方面的潜力。

**作者贡献声明**

Pedro A.S. Longo：撰写——原始草稿、方法论、正式分析、概念化。
Gustavo M. Mori：撰写——审稿与编辑、验证、方法论。
Cintia P. Targueta：撰写——审稿与编辑、方法论、正式分析。
Mariana P. de C. Telles：撰写——审稿与编辑、验证、方法论、正式分析。
Cinthya Simone Gomes Santos：撰写——审稿与编辑、方法论、正式分析。
Flávio Dias Passos：撰写——审稿与编辑、方法论、正式分析。
André R. Senna：撰写——审稿与编辑、方法论、正式分析。
Guilherme H. Pereira-Filho：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。

**资金来源**

GHPF感谢圣保罗研究基金会（FAPESP）的2016/14017–0和2024/18865–2项目支持，以及巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）的个人资助。CPT在整个研究过程中得到了INCT EECBio项目的支持。最后，我们感谢国家生态、进化和生物多样性保护研究所（INCT-EECBio）的遗传学和生物多样性实验室的支持，该实验室由CNPq（项目编号465610/2014–5 / 409197/2024–6）、FAPEG（项目编号201810267000023）和CNPq（项目编号409197/2024–6）资助。