《Bioresource Technology》：Combination of adaptive laboratory evolution and metabolic engineering on Vibrio natriegens for efficient production of 3-hydroxypropionic acid from ethanol
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刘晓珍|江兰英|尚彦哲|蔡思宏|王玉英|罗园川|吴慧上海生物制造技术创新协同中心，中国轻工业联合会生物基材料工程重点实验室，华东理工大学生物技术学院，中国上海梅龙路130号，200237摘要乙醇是一种非食品碳源，通过合成气发酵获得，具有作为生产各种高附加值化学品的微生物过程的原料
刘晓珍|江兰英|尚彦哲|蔡思宏|王玉英|罗园川|吴慧
上海生物制造技术创新协同中心，中国轻工业联合会生物基材料工程重点实验室，华东理工大学生物技术学院，中国上海梅龙路130号，200237
摘要
乙醇是一种非食品碳源，通过合成气发酵获得，具有作为生产各种高附加值化学品的微生物过程的原料的潜力。Vibrio natriegens是一种近年来开发的新类型底盘细胞，用于生物技术和合成生物学。它具有非常快的生长速率和广泛的底物谱，但其利用乙醇的能力有限，且耐受性较差。适应性实验室进化（ALE）是一种研究工业菌株抗性表型、生产活性和遗传稳定性的强大工具，被广泛用于筛选具有进一步改进特性的工程菌株。在这项研究中，我们开发了一种能够在乙醇中生长并产生3-羟基丙酸（3-HP）的Vibrio natriegens。首先，通过适应性实验室进化筛选获得了能够从乙醇产生3-HP的菌株。随后，通过优化3-HP生物合成途径中的启动子、合理设计背景菌株以及添加适当浓度的cerulenin，显著提高了工程菌株的3-HP生物合成能力。最终，在摇瓶培养中3-HP的最大浓度达到了3.10克/升，产率为0.382克/克。在1升生物反应器发酵中，3-HP的浓度达到了9.94克/升，产率为0.258克/克。研究结果表明，来自合成气的乙醇作为使用工程Vibrio natriegens在综合碳基工业生物技术中生产高价值生化产品的优秀碳原料具有巨大潜力。
引言
近年来，包括木糖、粗甘油、乙醇、乙酸、甲烷、甲醇和合成气在内的可再生和非食品碳源逐渐成为工业生物技术领域的替代碳源（Gui等人，2024年；Sun等人，2020年；Zhang等人，2020年）。乙醇是一种来自合成气的非食品碳源，可用于制造饮料、香精和燃料。它在化学、食品、医疗和农业领域有广泛的应用（Hans等人，2021年）。与葡萄糖和乙酸相比，乙醇分解并代谢为乙酰辅酶A具有出色的原子经济性（Sun等人，2020年）。在先前的研究中，乙醇已被用作底物，在大肠杆菌和铜绿假单胞菌的基因工程菌株中合成乙酰辅酶A衍生物，如己酸酯、3-羟基丙酸和聚羟基丁酸（Lu等人，2022年；Nguyen等人，2022年；Yin等人，2017年）。
3-HP是一种有前景的C3生物平台化学品，可用于生产多种化学衍生物，如丙烯酸、1,3-丙二醇、马来酸等。它在涂料、聚合物和尿布制造行业中有着广泛的应用（Wang等人，2023年）。建立具有3-HP生产能力的微生物细胞工厂需要合适的生物合成途径、优化的宿主细胞和高质量的原料。在各种生产3-HP的生物合成路线中，马来酰辅酶A途径是最直接的路线（Rathnasingh等人，2012年）。利用微生物将C2化合物（如乙酸和乙醇）转化为3-HP具有绿色和可持续的优势（补充材料）。然而，仍存在一些问题，如代谢效率低和耐受性差。未来的研究可以专注于通过系统代谢工程和适应性实验室进化来重塑菌株的代谢网络，以优化碳流分配和能量效率（Zhang等人，2025b）。同时，结合酶工程和动态控制策略，优化了速度限制步骤并减少了有毒中间体的积累，从而系统地提高了C2化合物和3-HP的转化效率（Chen等人，2014年；Kang等人，2025年；Liang等人，2019年；Liu等人，2016年）。
许多基因改造的生物体，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、谷氨酸棒状杆菌和铜绿假单胞菌，已被工程化以从多种原料中生产3-HP（Chang等人，2021年；Chen等人，2017年；Kim等人，2020年；Nguyen-Vo等人，2022年；Thi Nguyen等人，2021年）。V. natriegens是一种近年来为生物技术和合成生物学开发的新型细菌（Xu等人，2022年）。V. natriegens具有极快的生长速率，其广泛的底物谱和快速的底物吸收能力至关重要。研究表明，V. natriegens可以在含有数十种常见碳源的最低盐浓度培养基上生长，包括葡萄糖、甘油、棉子糖和苯乙酸（Hoffart等人，2017年；Thoma和Blombach，2021年；Woo等人，2024年）。基于V. natriegens的优良生物学特性，多种天然产物和蛋白质在V. natriegens中实现了高效生物合成（Lee等人，2024年；Sun等人，2024年；Tian等人，2023年；Wu等人，2023年）。然而，在有氧条件下，它不能使用高浓度的乙醇作为唯一的碳源进行生长。适应性实验室进化（ALE）是一种通过人为干预和控制微生物生长环境，并从进化群体中选择具有优良特性的个体来实现的微生物进化方法（Lee & Kim，2020年）。ALE为微生物提供了广泛的应用性和实际效用，从而能够识别新的机制并优化表型特征（Long和Antoniewicz，2018年；Peng等人，2025年；Xu等人，2023年）。我们为V. natriegens>提供了乙醇胁迫环境，并通过ALE有效改善了其在乙醇底物上的生长。
在这项研究中，使用了V. natriegens ATCC 14048（一种名为Vna的野生型菌株）作为起始菌株。通过ALE获得了能够在乙醇中培养的V. natriegens>。随后，将3-HP生物合成途径整合到进化菌株中，采用代谢工程策略提高3-HP的产量。主要策略包括筛选生产菌株、调节质粒启动子、重新编程代谢途径系统以及抑制脂肪酸合成。因此，最终的工程V. natriegens菌株在摇瓶培养和1升生物反应器分批发酵中的3-HP产量分别为3.10克/升和9.94克/升。
部分片段
菌株、质粒和引物
使用Vibrio natriegens ATCC 14048（名为Vna的野生型菌株）作为起始菌株。细菌菌株、质粒和引物序列的完整列表见补充材料。
培养基和培养条件
菌株在5毫升LB3培养基中过夜培养，以准备后续实验步骤。ALE培养基使用了含有不同浓度乙醇的M9基本盐培养基，NaCl浓度提高到15克/升。发酵培养基为
Vibrio natriegens ATCC 14048（野生型菌株Vna）可以在有氧条件下利用各种碳源生长并生产高价值化合物；然而，其乙醇耐受性和代谢能力尚未得到充分研究。为了解决这个问题，我们最初在含有10克/升乙醇的M9培养基中，于30°C和220转/分钟的速度下在250毫升摇瓶中培养Vna，以评估其在乙醇存在下的生长表现。大约80小时的培养后，Vna菌株表现出
结论
总之，采用适应性实验室进化和代谢工程相结合的策略构建了一种能够利用乙醇生产3-HP的V. natriegens菌株。结果显示，这些工程菌株在摇瓶试验中的3-HP产量为3.10克/升，并在1升生物反应器分批培养条件下产量提高到9.94克/升。这一3-HP合成的代谢工程成就不仅取得了良好的结果，也为未来的发展奠定了基础
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资助
本工作得到了国家重点研发计划（2022YFC2105400）、上海市科学技术委员会（24HC2820800）、中央高校基本科研业务费（DUT24RC(3)029）以及教育部工业发酵微生物学重点实验室项目和中国天津工业微生物学重点实验室（2024KF01）的支持。
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
