用于现场快速检测对虾（Litopenaeus vannamei）养殖水中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的直接LAMP方法

《PLOS One》：Direct LAMP for on-site rapid detection of Vibrio parahaemolyticus in shrimp (Litopenaeus vannamei) aquaculture water

　　摘要：在水产养殖环境中，通过环介导等温扩增（LAMP）技术对病原体进行有效的现场监测仍然具有挑战性，因为这需要在现场环境中进行不切实际且耗时的DNA提取。本研究评估了一种无需DNA提取的方法，即直接LAMP（dLAMP），并特别考虑了来自实际复杂水产养殖水体的关键物理化学抑制剂的影响。从Litopenaeus vannamei养殖系统中收集了8个具有代表性的水样，这些水样的盐度（7.61‰–32.88‰）、pH值（6.98–8.41）、化学需氧量（COD：6.00–12.25 mg/L）、可溶性活性磷酸盐（SRP：0.13–1.24 mg/L）、溶解无机氮（DIN：0.67–3.09 mg/L）和总悬浮固体（TSS：133–737 mg/L）范围广泛。煮沸后的养殖水样直接作为DNA模板，用于检测含有tlh基因的Vibrio parahaemolyticus。虽然pH值、COD、SRP、DIN和TSS对扩增效率的影响可以忽略不计，但较高的盐度显著降低了检测灵敏度。通过使用去离子水将盐度调整至≤10.00‰可以有效缓解这种抑制作用。在优化条件下，10 μL煮沸后的养殖水样足以实现可靠的检测，同时不牺牲灵敏度和特异性。检测限确定为10^2 CFU/mL（检测概率为67%）。使用DNA染料GeneFinder?可视化扩增产物，整个工作流程（包括采样、盐度调整（如需要）、煮沸、冷却和等温孵育）不超过1小时。这种dLAMP方法除了便携式加热器外不需要任何特殊设备，显示出在护理点应用中的巨大潜力，并能够实现水产养殖水中病原体的实际现场监测。

引言：Litopenaeus vannamei（也称为太平洋白虾）是全球虾类养殖中的主导物种，占养殖产量的大部分[1,2]。然而，该物种极易受到水传播病原体的影响，这些病原体经常导致严重的产量损失和经济损失[2]。因此，在水产养殖环境中有效监测病原体对于实施及时和有针对性的疾病控制策略至关重要[3]。传统的基于培养的方法，如经典平板计数法，仍然是水产养殖环境中病原体检测的金标准[4,5]。然而，这些方法需要超过20小时的培养时间，不适合快速检测。即使是基于电子微生物生长分析仪的方法，虽然可以在养殖设施现场直接定量Vibrio harveyi病原体，通常也需要超过4小时[6]。为了应对迫切的病原体监测需求，研究人员最近开发了多种快速检测技术[7]。例如，基于基因扩增的技术，包括聚合酶链反应（PCR）、定量PCR（qPCR）和环介导等温扩增（LAMP），已成为绕过培养步骤、实现快速病原体检测的有前景的工具[8]，从而提高了监测效率。其中，LAMP以其高灵敏度、特异性和最低的设备要求而脱颖而出[9]。与PCR和qPCR相比，LAMP对共存杂质（如非目标DNA、细胞碎片、血液和食品成分）的耐受性也更强[10]。多项研究表明，可以使用煮沸后的微生物悬浮液直接作为LAMP检测的DNA模板，而无需进行DNA提取。例如，Sriworarat等人[11]报告称煮沸后的Leishmania siamensis样本的上清液可以作为LAMP的DNA模板。Sayad等人[12]发现加热后的Salmonella悬浮液的上清液可以直接用作LAMP的DNA模板。Tian等人[13]进一步证实，加热释放的细菌DNA可以直接用于LAMP反应系统。毫无疑问，消除细菌分离、纯化、细胞裂解和DNA提取等步骤显著加快了检测过程，使直接LAMP（dLAMP）成为护理点应用的有前景的工具[7,8,14]。如果煮沸后的养殖水可以直接加入LAMP反应混合物中作为检测目标病原体的DNA模板，这种方法将为现场微生物安全监测提供非常有前景的策略。然而，之前的dLAMP研究主要是在简单的实验室基质（如纯水、缓冲液或培养基）中进行的[12,13,15]。当目标病原体存在于生物样本或食品等复杂基质中时，煮沸处理后通常需要离心以收集上清液作为DNA模板[11,12,16]。与简单的实验室基质不同，尤其是Litopenaeus vannamei池塘中的养殖水通常具有复杂的物理化学特性，包括可变的盐度、pH值、有机物和悬浮固体[17]。理论上，复杂的离子相互作用可能对Bst DNA聚合酶构成独特挑战，而简化的实验室模型无法复制这些挑战。然而，当煮沸后的养殖水直接用作DNA模板时，这些复杂的物理化学因素是否会影响基于LAMP的检测尚未系统研究。在本研究中，从八个Litopenaeus vannamei养殖系统中收集了代表性水样，并系统地表征了它们的物理化学性质，包括盐度、pH值、化学需氧量（COD）、可溶性活性磷酸盐（SRP）、溶解无机氮（DIN）和总悬浮固体（TSS）。使用热不稳定的溶血素（tlh）基因作为Vibrio parahaemolyticus的特异性标记物，开发了一种dLAMP检测方法来针对性地检测这种病原体。纯提取的基因组DNA和通过煮沸方法制备的粗DNA混合物也被用作LAMP检测的模板。本研究的主要目的是明确来自养殖水的物理化学因素对dLAMP检测的影响，并进一步开发一种实用且可在现场部署的方法，以便快速筛查养殖水中的病原体。

材料与方法：
细菌菌株和化学品：标准细菌菌株V. parahaemolyticus ATCC 17802、V. parahaemolyticus ATCC 33847、V. parahaemolyticus ATCC 27969、Escherichia coli ATCC 43888、Escherichia coli ATCC 35150、Enterobacter aerogenes BNCC 360397、Staphylococcus aureus ATCC 25923、Lactobacillus bulgaricus BNCC 187941、Salmonella Typhimurium CMCC(B) 50115、Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853、Listeria monocytogenes ATCC 15313、Vibrio vulnificus BNCC 186281、Vibrio vulnificus ATCC 27562、Vibrio alginolyticus ATCC 33787、Vibrio harveyi ATCC BAA-1117、Vibrio anguillarum ATCC 19264、Vibrio tubiashii ATCC 19109、Vibrio cholerae ATCC 51395和Vibrio fluvialis ATCC 33809购自BIOBW Biotechnology Co., Ltd.（北京，中国）。按照先前描述的方案[6,18]进行培养，并进行了一些修改。简要来说，V. parahaemolyticus被接种到2216E琼脂上，并在36°C下恒温振荡培养过夜（RADOBIO Scientific Co., Ltd., 上海，中国）。然后选择活性菌株并转移到新鲜的TCBS（硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖）培养基中。经过约12小时的二次培养达到对数中期后，通过离心收集细胞。使用5810R Eppendorf离心机在4°C下以5000 × g离心15分钟以分离V. parahaemolyticus细胞。沉淀的生物量重新悬浮以形成不同浓度的细菌悬浮液。细胞浓度通过菌落形成单位（CFU）计数法或光密度（OD）法进行测量[19]。除非另有说明，其他细菌菌株均在Luria-Bertani（LB）培养基中培养。所有培养基，包括2216E琼脂、TCBS琼脂、LB培养基和TCBS培养基，均购自Hope Bio-Technology Co., Ltd.（青岛，中国）。基因组DNA的提取和纯化使用Bacteria Genomic DNA Extraction Kit（Tiangen Biotech Co., Ltd., 北京，中国）进行。荧光DNA染料GeneFinder?购自Biov Co., Ltd.（厦门，中国）。电泳试剂，包括加载缓冲液、琼脂糖、DNA染料GelGreen和DL2000 DNA标记物，购自Takara Co., Ltd.（大连，中国）。酶和生化试剂，如脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、甜菜碱、硫酸镁（MgSO?）和Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，购自New England Biolabs（NEB；Ipswich，MA，美国）。针对V. parahaemolyticus的tlh基因的引物由Sangon Biotech（上海）有限公司定制合成[20]；其序列见表1。所有其他常规化学品（如氯化钠[NaCl]、盐酸[HCl]、氢氧化钠[NaOH]、磷酸二钠[Na?HPO?]、硝酸铵[NH?NO?]和腐殖酸）均为分析级，由Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（上海，中国）提供。

下载：PNG（大图）| TIFF（原始图）
表1. 用于通过LAMP特异性识别V. parahaemolyticus的tlh基因的引物。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0348231.t001

养殖水样的采集和预处理：从不同的养殖场和工厂收集了8个养殖水样。采样地点见表2。采样地点的地理坐标（纬度和经度）使用手持GNSS接收器（i70，CHC Navigation，上海，中国）在现场测量。使用聚乙烯采样器在水面下约20厘米处采集水样，并储存在琥珀色玻璃瓶中。为了建立评估物理化学因素对dLAMP检测抑制作用的严格基准，必须消除可能影响定量准确性的任何生物背景噪声。原始养殖水中的V. parahaemolyticus和细胞外DNA会导致细菌浓度的过高估计，从而使检测灵敏度的定量评估无效。除非另有说明，样品在121°C下灭菌30分钟以消除天然微生物[18]，然后进行10分钟的紫外线照射（120 mJ/cm2）以降解细胞外DNA[21]。处理后的样品分别标记为TS1至TS8，随后在室温下避光保存。使用前，样品需涡旋以重新悬浮任何沉淀的颗粒物。

下载：PNG（大图）| TIFF（原始图）
表2. 养殖水样的采集地点。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0348231.t002

养殖水样的物理化学性质测量：在测量其物理和化学性质之前，这些处理后的水样TS1至TS8需要涡旋以重新悬浮沉淀的颗粒物。每个样品的盐度和pH值在室温下使用556手持多参数仪器（YSI Incorporated，Yellow Springs，美国）进行测量。COD根据中国环境保护部的标准协议（HJ 828–2017）进行测量。SRP、铵（NH??-N）、亚硝酸盐（NO??-N）和硝酸盐（NO??-N）浓度分别采用钼蓝法、靛酚蓝法、α-萘胺法和紫外分光光度法测定[22]。DIN计算为NH??-N、NO??-N和NO??-N的总和。TSS按照Das等人的方法测定[23]。简要来说，1.0 L样品通过预称重的0.7 μm玻璃微纤维过滤器（GF/F，47 mm；Whatman）过滤，然后使用MS204/A电子天平（METTLER TOLEDO）测定干质量。

LAMP的DNA模板制备：提取的基因组DNA：根据制造商的说明，使用Bacteria Genomic DNA Extraction Kit提取和纯化V. parahaemolyticus的基因组DNA。提取的DNA浓度使用紫外分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）进行定量，并通过测量260 nm和280 nm处的吸光度比值来评估纯度[24]。随后，纯化的基因组DNA分装并储存在-20°C。除非另有说明，储存时间不超过2个月。这种溶解在水中的纯化基因组DNA被称为“提取的基因组DNA”。粗DNA混合物：粗DNA的制备采用Sun等人[16]的方法，并进行了一些修改。简要来说，细菌细胞在超纯水中以10^7、10^6、10^5、10^4、10^3、10^2和10^1 CFU/mL的浓度重新悬浮，然后在100°C下加热5分钟，并立即在冰水浴中冷却。所得悬浮液被称为粗DNA。对于养殖水中的粗DNA制备，使用无细菌和无DNA的水样（TS1–TS8）代替超纯水。在用作LAMP检测的模板之前，这些粗DNA混合物通过手动摇动而不是离心进行均质化[16]。为了研究养殖水中的盐度对LAMP检测的影响，在TS2样品中添加NaCl以达到10.00‰、13.00‰、16.00‰、19.00‰、21.00‰和24.00‰的盐度（标记为修改后的TS2样品）。类似地，使用HCl调整TS7样品的pH值，而腐殖酸、冻干的海洋沉积物粉末、Na?HPO?和NH?NO?分别用于调整预处理养殖水样品中的COD、TSS、SRP和DIN浓度。随后，使用上述煮沸方法在调整后的养殖水中制备粗DNA。

LAMP系统和产品分析：LAMP反应按照Benjakul等人[20]的报告的方案进行，并进行了一些修改。每100微升的反应混合物包含以下成分：F3和B3引物各0.2微摩尔，LoopF和LoopB引物各0.4微摩尔，FIP和BIP引物各1.6微摩尔，dNTPs 1.6毫摩尔，甜菜碱0.8毫摩尔，MgSO? 5毫摩尔，以及Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶1.6单位。在本研究中，使用了10微升提取的基因组DNA溶液以及粗DNA混合物（水、养殖水或调整后的养殖水）作为LAMP测定的DNA模板。除非另有说明，否则提取的基因组DNA和灭菌的纯水分别作为阳性对照和阴性对照。所有反应都在热循环仪（Biorad，Temecula，美国）中于62°C下孵育40分钟。扩增产物（即扩增子）通过2%琼脂糖凝胶的电泳进行分析，使用成像系统（MF-ChemiBis 3.2，DNR Bio-Imaging Systems，以色列）和电泳装置（DY-6，Xinghua Apparatus Ltd.，中国）。此外，如先前报道的[25,26]，还使用荧光DNA染料GeneFinder?对产物进行了可视化。

**敏感性**
将重新悬浮的副溶血性弧菌细胞（10^7 CFU/mL）分成两份。一份按照上述协议提取基因组DNA。另一份在养殖水中或调整后的养殖水中煮沸以制备粗DNA。使用无核酸酶的水对提取的基因组DNA进行十倍系列稀释。同样，使用TS1、TS2、TS3和其他调整后的养殖水基质对粗DNA进行十倍系列稀释。随后，将每个稀释系列的10微升加入LAMP反应混合物中作为DNA模板。所有LAMP测定都在上述相同的条件下进行。

**特异性**
当使用养殖水或调整后的养殖水（盐度≤10.00‰）中的粗DNA作为LAMP测定的DNA模板时，通过八种非弧菌菌株（例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）和十种弧菌菌株（例如副溶血性弧菌、哈维弧菌）来评估特异性。所有细菌菌株都在肉汤培养基中培养，并通过离心从肉汤中收集[27]。这些细菌细胞用无菌水洗涤三次。然后将沉淀的生物量转移到TS1、TS2、TS3和其他调整后的养殖水中以制备接种样品。随后，使用上述煮沸方法使用这些接种样品在养殖水中和调整后的养殖水中制备粗DNA。

**统计分析**
除非另有说明，所有试验均重复三次。数据使用IBM SPSS Statistics（版本21）进行统计分析，并以重复次的平均值或平均值±标准差（SD）表示。使用OriginPro 2022（OriginLab Corporation，Northampton，MA，美国）中的统计工具包计算皮尔逊相关矩阵。在皮尔逊相关分析之前，分别使用散点图和Shapiro-Wilk检验验证线性和正态性假设。

**结果**
图1a显示了使用提取的基因组DNA作为模板的LAMP产物的电泳谱。在阴性对照（第1泳道）中未检测到扩增子。相比之下，第2泳道到第8泳道显示了可重复的梯状条带图案[11,20]，表明通过形成不同长度的扩增子成功进行了扩增。同时，如预期，在加入2微升DNA染料GeneFinder?后，这些液体混合物的颜色从橙色变为绿色[25,26]。

图1b展示了使用粗DNA混合物作为模板的dLAMP产物的凝胶电泳和可视化结果。阴性对照（第1泳道）未显示梯状条带图案。与此观察一致，在加入DNA结合染料GeneFinder?后，相应的dLAMP混合物也没有变为绿色。相比之下，第2泳道到第8泳道显示了可重复的梯状电泳谱。同时，在加入GeneFinder?后，这些反应混合物的颜色从橙色变为绿色，进一步证实了扩增的成功。使用细菌基因组DNA提取试剂盒从10^7 CFU的副溶血性弧菌中提取基因组DNA。将10微升纯化的基因组DNA溶液分别加入1毫升的TS1到TS8中。随后，将这些含有DNA的样品的10微升部分作为LAMP测定的模板。图1c显示了扩增子的电泳谱和可视化结果。当使用含有DNA的TS2和TS3样品作为模板时，观察到可重复的梯状扩增模式。相应地，在加入GeneFinder?后，PCR管中的反应混合物的颜色从橙色变为绿色，表明扩增成功。相比之下，使用其他含有DNA的样品（TS1、TS4–TS8）作为模板的LAMP反应未产生梯状扩增子。相应地，在加入GeneFinder?后没有颜色变化，表明LAMP反应失败。在大多数实际养殖水样本中，dLAMP测定未能产生阳性信号。这一发现使我们假设来自复杂养殖基质的某些物理化学成分对Bst DNA聚合酶具有强烈的抑制作用。因此，系统地评估了包括盐度、pH值和有机负荷在内的各种因素，以确定导致这种干扰的具体抑制剂。向100毫升的TS1到TS8中分别加入200微升的水培养细菌悬浮液（10^7 CFU/mL），最终浓度为10^4 CFU/mL。随后，将这些含有细菌的样品煮沸，然后迅速冷却，以制备粗DNA混合物。将每种混合物的10微升部分加入LAMP系统中作为DNA模板。如图1d所示，当使用含有DNA的TS2和TS3样品作为模板时，扩增成功。我们越来越怀疑dLAMP反应的抑制作用可能来源于TS1和TS4–TS8中固有的一个或多个物理化学因素。

**处理过的养殖水的物理化学性质**
盐度、pH值、COD、TSS、SRP和DIN是养殖凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）中常规关注的物理化学参数[28]。表3列出了八个处理过的养殖水样本（TS1至TS8）的这些参数。盐度范围为7.61‰–32.88‰。pH值在6.98到8.41之间波动。COD的变化范围为6.00 mg/L到12.25 mg/L。TSS的浓度在133 mg/L到737 mg/L之间。SRP的变化范围为133.62–1240.23 μg/L。DIN的浓度范围为665.91到3091.67 μg/L。这些数据完全符合凡纳滨对虾养殖的水质要求[17,28]。

**皮尔逊相关矩阵分析**
TS1到TS8之间的盐度、pH值、COD、TSS、SRP和DIN参数存在变化。为了识别LAMP反应的潜在抑制因素，使用皮尔逊相关分析来评估这些物理化学参数与反应失败率之间的关系。皮尔逊相关系数矩阵定义为两个变量的协方差除以它们标准差的乘积[29]，显示盐度与LAMP反应失败之间存在强正相关（r = 1.0；图2）。相比之下，pH值、COD、TSS、SRP和DIN与反应失败的相关性可以忽略不计（r ≤ 0.4）。这些结果表明，盐度升高可能会抑制LAMP反应。值得注意的是，尽管观察到了r = 1.0的皮尔逊相关系数，但这一结果应谨慎解释。鉴于样本量有限（n = 8），这种完美相关性可能无法完全反映复杂养殖环境的固有变异性，需要更多样本进行进一步验证以确认这些发现。

**盐度对LAMP的影响**
在TS1到TS8中，TS2的盐度最低。向六个TS2样本的等体积（1:1 v/v）中加入不同量的NaCl，制备盐度分别为10.00‰、13.00‰、16.00‰、19.00‰、21.00‰和24.00‰的修改样本。将副溶血性弧菌的基因组DNA加入TS2样本和制备的修改样本中，使每个样本中的最终DNA浓度达到5 pg/mL。同时，将副溶血性弧菌加入另一组TS2样本和盐度修改样本中，达到10^5 CFU/mL。随后，这组样本经过煮沸裂解以制备粗DNA混合物。这些提取的基因组DNA和含有DNA的TS2及修改样本作为LAMP反应的模板。使用凝胶电泳和DNA染料GeneFinder?检测到的扩增子。图3a显示了使用含有DNA的TS2和含有基因组DNA的修改TS2样本作为模板的LAMP结果。当TS2和修改TS2样本的盐度分别为7.61‰、10.00‰、13.00‰、16.00‰和19.00‰时，观察到可重复的梯状扩增模式。相应地，在加入DNA染料GeneFinder?后，PCR管中的反应混合物的颜色从橙色变为绿色，表明扩增成功。相反，当修改TS2样本的盐度分别为21.00‰和24.00‰时，未观察到梯状扩增模式；并且在加入GeneFinder?后没有颜色变化，表明扩增失败。图3b显示了使用含有粗DNA的TS2和修改TS2样本作为模板的类似结果。与上述发现一致，在盐度≤19.00‰的修改TS2中LAMP反应成功进行，但在盐度为21.00‰和24.00‰时失败。

此外，将TS1、TS4到TS8与去离子水以等体积（1:1 v/v）混合以降低盐度。将副溶血性弧菌加入这些稀释样本中，使最终浓度达到10^5 CFU/mL。随后，使用煮沸方法制备这些修改后的养殖水样本中的粗DNA。将每种混合物的10微升部分作为LAMP测定的模板。凝胶电泳分析的结果表明所有反应都成功扩增。

**敏感性**
将副溶血性弧菌加入TS2和盐度修改的TS2（盐度分别为10.00‰、13.00‰、16.00‰、19.00‰）中，使最终浓度分别为100 CFU/mL、101 CFU/mL、102 CFU/mL、103 CFU/mL、104 CFU/mL和105 CFU/mL。所有接种样本都经过煮沸后立即冷却。随后，将含有粗DNA的样本的10微升部分作为dLAMP测定的模板。使用DNA染料GeneFinder?对扩增子进行可视化。结果详细列在表4中。凝胶电泳和视觉表征显示，非弧菌属菌株（n=8）的检测具有100%的特异性，未观察到假阳性或假阴性反应（图4）。同样，所有八种弧菌属菌株（不包括副溶血性弧菌）也未产生错误结果。相比之下，所有测试的副溶血性弧菌菌株（ATCC 17802、ATCC 33847和ATCC 27969）均被成功检测到。下载：PNG（较大图像）| TIFF（原始图像）图4. 使用三种副溶血性弧菌菌株、其他八种弧菌属菌株和八种非弧菌菌株对LAMP检测方法的特异性进行验证。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0348231.g004

范名纳贝鱼（Litopenaeus vannamei）的水产养殖从业者非常希望方便地监测培养水中的病原菌，如副溶血性弧菌[3]。如果煮沸的水产养殖水样可以直接作为LAMP检测的DNA模板，从而避免繁琐的细菌细胞分离、DNA提取和纯化步骤，这种方法可能为开发高效的现场检测技术提供可行的途径[30]。然而，已有文献记载，实际和模拟样本中的一些复杂物质会对dLAMP反应产生显著的抑制作用[31-33]。通常，范名纳贝鱼的培养水具有复杂的物理化学性质（详见表3）。因此，在开发实用的现场监测技术之前，必须解决一些关键问题：向LAMP反应混合物中加入一定体积（例如10 μL）的含有DNA的水产养殖水是否会干扰酶催化的DNA扩增？如果会，程度如何？这种加入是否会影响通过凝胶电泳和视觉检测方法对扩增结果的解释（尤其是后者）？如果会，程度如何？阐明这些效应对于推进可现场部署的病原菌检测系统至关重要。

当使用提取的基因组DNA溶液作为模板时，获得了目标扩增子，表明扩增成功。结果与先前的报告[20]一致，从而验证了该生化反应系统用于特异性识别耐热溶血素副溶血性弧菌的可靠性。当细菌悬浮液煮沸适当时间（例如5分钟[16]）时，DNA会从受损细胞中释放[15,16]。细胞裂解同时产生细胞碎片、变性蛋白质、RNA、脂质、脂多糖以及各种其他有机和无机化合物。当这些混合物直接用作LAMP反应的DNA模板时，获得了目标扩增子，并通过凝胶电泳和可视化方法进行了表征。这一结果证实了先前的研究[10]，即LAMP检测对共存的杂质（如细胞碎片、血清和其他有机及无机成分）具有比PCR更强的耐受性。因此，煮沸的细菌悬浮液[11]及其上清液可以直接用作LAMP检测的DNA模板。此外，这也表明这些杂质的存在不会干扰使用凝胶电泳或DNA染料GeneFinder?对扩增子的表征。使用提取试剂盒获得的纯化基因组DNA和使用煮沸方法获得的粗DNA分别被引入TS1至TS8。当使用10 μL的这些加标样品作为LAMP检测的DNA模板时，除了TS2和TS3外，所有样品的扩增都失败了，这一点通过凝胶电泳或DNA染料染色得到了确认。这一现象表明，来自复杂水产养殖水的某些物理化学因素显著抑制了LAMP反应。以往关于dLAMP检测的研究主要使用悬浮在简单实验室培养基（如水、缓冲液、培养基）中的细菌进行[12,13,15]。有证据表明，煮沸的细菌悬浮液及其上清液可以直接用作LAMP检测的DNA模板[12,13]。然而，我们发现并非所有煮沸的水产养殖水都可以直接用作LAMP检测的DNA模板；其适用性取决于水本身的物理化学性质。通过凝胶电泳和可视化方法获得的表征结果一致，表明来自水产养殖水的复杂物理化学因素并未显著影响扩增子的检测。

Sun等人[16]系统地比较了四种DNA制备方法——煮沸、在1% Triton X-100中煮沸、0.02 M NaOH处理和DNAzol提取——用于LAMP检测。他们的发现表明，煮沸方法的灵敏度优于其他方法。尽管如此，后续研究表明，基于LAMP的细菌检测仍然容易受到复杂基质的干扰[34]。这些抑制剂可能通过抑制聚合酶活性或与目标DNA直接相互作用来降低扩增效率。重要的是，即使聚合酶功能的微小扰动也会显著影响检测的灵敏度和稳健性[35]。Jevtu?evskaja等人[36]观察到，生理相关浓度的BSA、Mg2?、尿素或不同pH条件对Bst DNA聚合酶活性没有抑制作用。NaCl被发现通过酶抑制显著降低了扩增效率。这与Tanner等人的研究结果一致[37]，他们记录了多种Bst聚合酶变体（Bst DNA聚合酶、Large Fragment Bst DNA聚合酶和Bst 2.0 DNA聚合酶）在广泛的pH范围（pH 6.0–10.0）内的耐受性。值得注意的是，迄今为止还没有研究探讨关键环境参数（包括COD、DIN、TSS和SRP）对LAMP反应的影响。鉴于腐殖酸（一种已知的COD成分）可能会干扰LAMP结果[35]，这些未表征因素的潜在干扰值得仔细研究。本研究采用皮尔逊相关分析确定，来自水产养殖废水的盐度升高是LAMP反应的主要抑制因素。相比之下，其他物理化学参数（pH、COD、TSS、SRP和DIN）没有观察到统计学上的显著影响。需要注意的是，虽然八种水产养殖水样本涵盖了广泛的物理化学参数范围，但相对较小的样本量（n=8）可能会限制相关分析的统计功效。未来需要更大样本量的研究来进一步验证这些发现。为了实证验证这一发现，样本TS2通过添加NaCl系统地调整到10.00‰、13.00‰、16.00‰、19.00‰和24.00‰的盐度梯度，同时保持其他参数不变。每个盐度调整后的样本的10 μL样品分别作为提取的基因组DNA或通过煮沸方法获得的粗DNA的载体，用于后续的LAMP检测。电泳分析和视觉检查均确认，在盐度≤19.00‰时DNA扩增成功，而在盐度≥21.00‰时则完全失败。这些结果表明，盐度升高显著抑制了LAMP反应[36]。为了进一步证实这一结论，六个高盐度样本（TS1、TS4–TS8）在使用前用去离子水按1:1稀释。在所有稀释后的样本中都检测到了扩增子，证实盐度是一个关键的抑制因素。此外，还采用了类似的样本调整方法系统地评估了pH（6.98–8.41）、COD（6.00–12.25 mg/L）、SRP（0.13–1.24 mg/L）和DIN（0.67–3.09 mg/L）的影响。结果验证，在测试范围内，这些参数均未对LAMP扩增效果产生可检测的影响。为了确保现场适用性，本实验中省略了离心步骤。尽管颗粒物质可能会引入基质异质性，但我们的结果表明，TSS水平高达737 mg/L并未显著干扰检测。实际上，煮沸后的彻底手动混合有助于保持样本的均匀性，即使在复杂的水质中也能确保可靠的检测。

不同浓度的副溶血性弧菌细胞被加入盐度调整后的TS2样品（盐度分别为10.00‰、13.00‰、16.00‰和19.00‰）中。煮沸后，这些混合物被用作LAMP检测的DNA模板。视觉分析得出以下观察结果：(1) 在统计预期的水平100 CFU/mL和101 CFU/mL下出现了假阴性结果；(2) 在盐度≥10.00‰时，102 CFU/mL出现了假阴性；(3) 在盐度≥16.00‰时，103 CFU/mL也出现了假阴性；(4) 在盐度≥19.00‰时，104 CFU/mL才出现假阴性；(5) 在所有盐度下，包括19.00‰，都检测到了阳性结果。总体而言，这些数据表明，盐度升高降低了LAMP检测对副溶血性弧菌的灵敏度，这与Jevtu?evskaja等人的研究结果一致[36]。在盐度超过20.00‰的样品中，增加的离子强度可能干扰了Bst DNA聚合酶的链置换活性，导致灵敏度显著降低，假阴性概率增加。然而，在盐度≤10.00‰时，灵敏度未受显著影响。尽管与传统PCR或基于提取DNA的LAMP相比灵敏度较低[38]，但这种dLAMP检测在最佳条件下达到了102 CFU/mL的检测限，其灵敏度与单核细胞增生李斯特菌（LOD=6 CFU/管[39]的LAMP检测相当。根据先前的报告[40]，虾类养殖水中的副溶血性弧菌浓度通常约为102–104 CFU/mL。因此，这种dLAMP方法的灵敏度足以满足水产养殖生产中对这种病原菌的非定量筛查需求。LAMP检测的特异性对其实际应用至关重要。为了评估这种dLAMP检测的特异性，将通过煮沸方法获得的粗DNA加载到载体中，包括TS2（自然盐度：7.61‰）和盐度调整后的TS1、TS3、TS4和TS5（10.00‰）。扩增子的视觉检测仅显示副溶血性弧菌菌株（n=3）为阳性结果，而所有非弧菌菌株（n=8，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌）及其他弧菌物种（n=8）均为阴性结果。无交叉扩增现象，证实了该方法在测试实验条件下的高特异性。如图5所示，dLAMP检测使用煮沸的水产养殖水样作为DNA模板。该简化协议仅包含几个步骤：采样、必要时调整盐度、煮沸和等温孵育。整个过程在1小时内完成，且不需要除便携式加热设备以外的特殊设备，适用于现场检测。虽然该方法能快速检测水产养殖水中的副溶血性弧菌，但仍面临一些挑战。具体来说，水产养殖水中的盐度如何影响dLAMP反应的分子机制尚未完全明了。先前的研究表明，常见的抑制剂（如氯化钙、血红素、胆盐、腐殖酸、免疫球蛋白G、单宁酸和尿素）会系统地延迟扩增子的形成[35]。因此，需要进一步研究以确定水产养殖水中的物理化学因素（特别是盐度）是否影响定量检测的准确性。

尽管成功开发了用于检测水产养殖水中副溶血性弧菌的dLAMP检测方法，但仍需解决几个限制。首先，虽然已经识别并通过简单稀释缓解了高盐度的抑制作用，但盐度调节Bst DNA聚合酶效率和dLAMP动力学的精确分子机制尚未完全阐明。其次，当前协议主要关注定性的视觉终点检测。尽管这种方法适用于快速现场筛查，但其精确定量测量的能力有限。最后，虽然我们评估了几个常见的物理化学因素，但还需要进一步研究极高浓度的有机物或不同水产养殖物种中使用的特定化学添加剂对dLAMP系统的潜在干扰，以确保其更广泛的适用性。

从环境样本中提取和纯化DNA在现场往往不可行且耗时[30]。为了解决这一限制，我们评估了煮沸的水产养殖水作为LAMP检测DNA模板的适用性。来自八个范名纳贝鱼养殖系统的水样显示以下参数范围：盐度（7.61‰–32.88‰）、pH（6.98–8.41）、COD（6.00–12.25 mg/L）、SRP（0.13–1.24 mg/L）、DIN（0.67–3.09 mg/L）和TSS（133–737 mg/L）。当含有副溶血性弧菌的煮沸水样作为LAMP模板时，仅来自水产养殖水的盐度升高对检测灵敏度产生了不可忽视的影响。通过用去离子水将盐度调整至≤10.00‰后，这种dLAMP检测达到了102 CFU/mL的检测限（检测概率为67%），同时保持了高特异性。通过使用DNA染料GeneFinder?进行视觉终点检测，整个分析过程（包括采样、煮沸、冷却和等温孵育）在1小时内完成。该协议不需要除便携式加热设备以外的特殊设备，显示出在现场检测中的巨大潜力，有助于提前预警病原体爆发。然而，应注意的是，这种基于dLAMP的早期预警系统的可靠性取决于盐度的调整。在许多实际高盐度环境中，预先将盐度调节至≤10.00‰是确保最佳检测灵敏度的必要前提。我们未来的工作将重点阐明盐度通过何种分子机制调节LAMP（光激活核酸酶）的效率，并研究来自水产养殖水中的这些物理化学因素（例如盐度）对定量测量的影响模式。支持信息 参考文献