用于snATAC-seq中多重检测的半参数经验贝叶斯方法，结合概率多组学整合技术

《PLOS Computational Biology》：Semi-parametric empirical bayes method for multiplet detection in snATAC-seq with probabilistic multi-omic integration

　　摘要：在单细胞测序过程中，当多个细胞被捕获在同一个液滴中时，就会产生多重体（multiplets），这会生成混合的分子谱型，从而可能干扰后续的分析。在单核ATAC-seq（snATAC-seq）数据中检测多重体尤其具有挑战性，因为染色质可及性测量的数据稀疏且分布不均。此外，结合多种特征和数据模式的计算方法对于多重体的检测非常有用。我们提出了SEBULA，这是一种用于snATAC-seq数据中多重体检测的半参数经验贝叶斯框架。SEBULA直接利用snATAC-seq数据的片段级信息来建模单细胞背景。这种方法避免了对合成双体的依赖，并生成了可以控制假发现率（false discovery rate, FDR）的分类概率。我们进一步扩展了SEBULA，以整合来自其他特征和模式的互补证据，例如同时测量的基因表达谱型。通过模拟和七个基于哈希的真实值的多模态数据集的测试，SEBULA显示出比现有snATAC-seq方法更高的灵敏度和特异性。这种证据整合框架在保持计算效率的同时，性能可与最先进的多组学方法相媲美。

作者总结：单细胞测序通过允许研究人员同时观察数千个单个细胞的基因活动，彻底改变了生物学研究。然而，当两个或更多细胞意外地被困在同一个反应液滴中时，常见的技术伪影就会出现。这些“多重体”会产生模糊的混合信号，可能导致研究人员得出错误的生物学结论。在测量染色质可及性（即DNA的开放程度）的数据中，检测这些伪影尤其困难，因为这类数据通常既稀疏又噪声较大。我们开发了SEBULA，这是一种旨在解决这一问题的新计算工具。与依赖模拟数据来猜测多重体外观的现有方法不同，SEBULA直接从观测数据中学习真实单细胞的特征，因此能够更准确地发现其他工具可能遗漏的微妙多重体信号。此外，SEBULA适用于最新的多模态技术，这些技术可以同时测量不同类型的生物学信息。它能够结合来自多个来源的证据（如基因活动和DNA结构），以确认一个液滴中包含一个细胞还是多个细胞。通过提供一种更可靠的方法来识别和去除多重体，SEBULA有助于提高单细胞研究中后续分析的可靠性。

引言：单细胞测序技术通过测量单细胞水平的分子特征，极大地改变了我们表征细胞异质性的能力。然而，一个持续存在的技术挑战是多重体的形成，即两个或更多细胞或细胞核被共同封装在一个液滴中，并作为一个单元进行处理[1–3]。由于多重体会生成不符合真实生物学状态的混合转录组和表观基因组谱型，它们可能在许多后续分析中产生虚假信号，包括聚类、差异表达、轨迹推断和等位基因特异性可及性[3–5]。根据封装的细胞是否来自不同的转录状态或相同的（或高度相似的）转录状态，多重体可以被分类为异型或多型。虽然异型多重体在后续分析中会引入严重的伪影，但在某些标准的单细胞工作流程中，多型双体有时被认为相对无害[4]。尽管如此，它们仍可能对特定的后续分析产生不利影响。例如，在涉及等位基因偏倚和谱系追踪的研究中，过滤多型多重体至关重要，因为聚合的片段计数可能会扭曲每个细胞的等位基因特异性或谱系信号[5]。此外，这两种类型的多重体都可能改变转录丢失模式，从而影响转录组推断方法[6]。随着单细胞实验在通量和复杂性方面的持续扩展，准确检测和去除多重体已成为单细胞分析流程中的关键质量控制步骤，有助于确保后续生物学结论的可靠性。互补的实验和基于基因型的方法，如Cell Hashing[7]、MULTI-seq[8]和demuxlet[9]，可以识别样本间的多重体，并为双体检测提供正交的基准。然而，这些方法需要额外的实验步骤和成本，不能回顾性地应用于未标记的数据集，并且通常无法检测样本内的（同一供体的）多重体。因此，直接基于单细胞分子谱型的计算策略对于全面的多重体检测仍然至关重要。目前计算多重体检测的范式是基于人工双体模拟的。例如Scrublet[10]、scds[11]、DoubletFinder[6]、Solo[12]和scDblFinder[13]等方法通过在低维空间中对分子谱型进行求和或平均来生成人工双体，然后识别靠近这些模拟谱型的真实细胞。这种框架在转录组数据中表现良好，尤其是在检测异型多重体方面[6,10]。然而，基于模拟的方法的成功在很大程度上依赖于人工混合物能够充分近似真实多重体的分布这一假设。实际上，由于技术和生物学因素，真实的多重体可能偏离简单的加性行为[14]。更重要的是，仅从RNA谱型中检测多型多重体特别困难[6]。为了解决这一限制，如ArchR[15]和scDblFinder[13]等方法将基于模拟的策略扩展到了单核ATAC-seq（snATAC-seq）。然而，snATAC-seq数据为这种基于模拟的范式带来了额外的挑战：染色质可及性数据稀疏，通常反映离散的可及性状态（例如，0表示闭合的染色质，1表示一个亲本染色体上的开放状态，2表示两个亲本染色体上的开放状态），并且信号分散且覆盖度低。相比之下，AMULET[5]引入了一种基于模型的方法，该方法利用片段级信息，在检测异型和多型双体方面表现良好。然而，AMULET假设了一个均匀的单细胞群体，而实际的snATAC-seq数据通常表现出异质的测序深度、变化的样本组成和过度分散。最近，如DOGMA-seq[16]、CITE-seq[17]、TEA-seq[18]、SNARE-seq[19]和SHARE-seq[20]等多组学平台实现了对数千个单个细胞的基因表达、染色质可及性和蛋白质丰度的同时测量[21]。这些数据为多重体检测提供了互补的证据：一个多重体在一个模式中可能显得不明显，但在另一个模式中显示出强烈的信号。这激发了结合模式特定证据的整合策略。计算方法如COMPOSITE[14]和OmniDoublet[22]在联合建模多种数据模式的证据以检测多重体方面显示出巨大潜力。尽管如此，直接结合现有模式特定证据的替代推理方法仍然具有吸引力，因为它们在计算上高效，并且能够适应多种数据类型和实验设计。在本文中，我们介绍了SEBULA（用于单核ATAC-seq中多重体检测的半参数经验贝叶斯方法），这是一种基于读取的、专注于ATAC的计算框架。SEBULA使用来自snATAC-seq数据的片段级高覆盖度位点计数（HCLC）统计信息，并通过采用半参数经验贝叶斯框架来学习单细胞和多重体的分布，从而避免了对人工双体模拟或强参数假设的依赖。在此基础上，我们进一步引入了一种整合策略，将SEBULA的基于染色质的证据与其他特征或数据模式的互补信号结合在一个已建立的机器学习框架中。SEBULA作为开源软件包在https://github.com/Yuntian0716/SEBULA上免费提供。

结果：概述：SEBULA实现了一个用于snATAC-seq数据中多重体检测的半参数概率模型（图1）。遵循与AMULET类似的预处理策略，我们生成了一个多读取位点的二进制矩阵，其中行对应于在至少一个细胞中有多个重叠读取的基因组位点（即高覆盖度位点），列代表单个细胞核。从这个矩阵中，我们计算每个细胞的高覆盖度位点计数（HCLC），作为SEBULA的输入。直观地说，HCLC值异常高的细胞更有可能是多重体。

下载：PNG（较大图像）| TIFF（原始图像）
图1. SEBULA框架概述。(A) 多重体的形成。在基于液滴的平台上，单个细胞或细胞核与条形码珠子一起被封装在油滴中。理想情况下，每个液滴包含一个细胞（单细胞），但有些液滴捕获了多个细胞（多重体）或保持为空。多重体会生成混合的分子谱型，这可能会混淆后续的分析。现代单细胞检测方法，包括单细胞RNA测序、单核ATAC测序、CITE-seq以及DOGMA-seq等多模态平台，可以测量互补的分子层，包括转录组、染色质可及性和表面蛋白质丰度（由BioRender创建。Tsoi, A. L. (2026) https://BioRender.com/xrpr281）。(B) 计算工作流程。SEBULA分为三个阶段。在第一阶段（预处理）中，使用片段级染色质可及性数据来计算高覆盖度位点计数（HCLC）。HCLC值非常低的细胞被截断以稳定估计，并对剩余的HCLC数据应用Box-Cox变换。在第二阶段，使用非参数经验贝叶斯框架对变换后的HCLC分布进行建模，以估计单细胞分布并基于ATAC-seq证据得出多重体状态的后验概率。在第三阶段，当有其他数据特征和模式的证据可用时，SEBULA整合特定于特征的概率证据，并根据所有可用测量结果得出多重体状态的综合后验概率。

SEBULA的关键创新在于其半参数程序，可以直接从观测数据中估计单细胞和多重体的HCLC分布。带有真实多重体注释的真实snATAC-seq数据集表明，常用的计数数据参数族（如AMULET使用的泊松分布和负二项分布）对经验HCLC数据的拟合效果较差（图2）。基于这些经验观察，我们认为有效的多重体检测应优先区分具有中等至高HCLC值的多重体和单细胞，因为HCLC值极低的细胞很可能是单细胞，因此对多重体检测提供的信息有限。为此，我们采用了类似于非参数经验贝叶斯（NPEB）推理中的零假设策略[23]，专注于准确描述单细胞分布的右尾行为。具体来说，排除HCLC值非常低的细胞（由用户指定的阈值定义），并将剩余的计数使用Box-Cox变换转换为连续域。然后估计变换后的值的经验密度f(x)，并将其建模为单细胞和多重体分布的混合：其中x表示变换后的计数，分别表示单细胞和多重体的比例。

遵循零假设的原则，我们做出了两个关键假设：(i) 单细胞的数量远多于多重体；(ii) 经验分布的众数附近的细胞主要是单细胞。利用这些假设，我们在f(x)的众数附近应用非参数密度估计来推断单细胞分布f0(x)并估计其混合比例（方法）。随后推导出多重体分布f1(x)及其混合比例。利用这些分布估计，通过贝叶斯规则计算一个细胞是多重体的后验概率：(1) 这些估计还使得在多重体检测中实现局部和贝叶斯FDR控制程序成为可能。具体来说，在将所有HCLC ≥ t的细胞分类为多重体的决策规则下，相应的估计假发现率（FDR）由(2)给出。FDR和lfdr计算的详细程序在S1文本的第2节中提供。从HCLC中量化多重体证据的概率尺度允许与其他概率信号无缝集成，无论是来自snATAC-seq数据中的其他特征，还是来自scRNA-seq等互补模式。因此，SEBULA可以与其他生成概率输出的多重体检测工具（包括scDblFinder和COMPOSITE）结合使用，进一步提高灵敏度和特异性。这种集成遵循贝叶斯顺序更新的原则[24]。具体来说，HCLC数据的贝叶斯因子可以直接从给定snATAC-seq HCLC数据的后验概率(1)中获得。通过将来自其他特征数据y的后验概率视为基于特征的先验，我们构建了一个朴素贝叶斯分类器，整合了来自两个来源的证据。这产生了更新后的分类后验：（3）整合步骤作用于特定模态的分数，不需要对高维特征空间进行联合建模。此外，上述程序可以修改为整合以p值或z分数形式存在的证据。详细信息在方法部分和S1文本的第3节中提供。使用模拟的人工双胞胎数据进行评估我们生成了合成的snATAC-seq数据，以检验仅使用HCLC衍生信息的SEBULA和AMULET的性能。从Xu等人[16]的真实DOGMA-seq数据集开始，我们提取了scATAC-seq模态并移除了所有标注的多胞胎细胞。然后通过随机配对剩余的15,788个单细胞来创建人工双胞胎。为了评估各种实际场景下的性能，我们构建了多个数据集，其中人工双胞胎的比例从5%到25%不等。对于每个模拟数据集，处理后的HCLC值被作为输入提供给SEBULA和AMULET。我们使用接收者操作特征（ROC）曲线和F1分数在所有模拟数据集上评估了每种方法的敏感性和特异性。在所有条件下，SEBULA的表现都明显优于AMULET（图3和S1）。值得注意的是，随着双胞胎比例的增加，AMULET的性能下降，这可能是由于它依赖于全局平均值来近似单细胞分布。相比之下，SEBULA在不同双胞胎比例下表现稳健，这反映在一致较高的AUC值上（S1图）。下载：PNG（更大图像）TIFF（原始图像）图3。使用模拟双胞胎数据集对SEBULA和AMULET的性能评估。在所有面板中，箱形图按模拟数据集中的双胞胎比例（5%–25%）进行分层。每个箱形图总结了每种条件下20次重复模拟的结果。（A）最佳F1分数。（B）在0.2的FDR控制水平下评估的F1分数。（C）估计的单细胞比例。（https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013653.g003）SEBULA和AMULET都可以使用方程（2）和内置的q值方法分别估计假发现率（FDR）以确定多胞胎分类阈值。在20%的FDR控制水平下，图3B显示SEBULA的分类性能明显优于AMULET，如F1分数所示。此外，SEBULA在所有数据集中提供了相当准确的多胞胎比例估计（图3C），表明SEBULA的半参数模型具有良好的校准特性。这些多胞胎比例估计也可以作为snATAC-seq数据的有用质量控制（QC）指标。作为比较，我们还实现并评估了另一种负二项混合模型（NBMM），在该模型中，单细胞的HCLC分布通过负二项分布明确建模（S1文本的第1节）。然而，当应用于模拟的人工双胞胎数据集时，NBMM产生的分类概率校准不佳：在所有模拟设置中，估计的单细胞比例和大多数细胞的个体后验概率都集中在1附近（即几乎可以确定是单细胞）（S2图）。我们认为这表明负二项假设不适合用于真实数据中的单细胞分布建模。虽然负二项分布解决了AMULET使用的泊松模型的一些限制（例如无法适应过度分散或零膨胀），但它对较大的HCLC值过于宽容，因此无法有效区分多胞胎和单细胞。从另一个角度来看，这个实验进一步突出了SEBULA在准确建模真实数据中的单细胞和多胞胎分布方面的关键优势。

在由DOGMA-seq实验生成的七个三模态单细胞数据集中应用SEBULA，并将其性能与最先进的多胞胎检测方法进行了基准测试。DOGMA-seq同时分析单细胞中的转录组（scRNA-seq）、染色质可及性（scATAC-seq）和细胞表面蛋白表达（通过抗体衍生的标签，或ADTs）。我们收集了七个来自人类外周血T细胞实验的基准数据集，包括一个来自Xu等人[16]的数据集（GSE200417）和六个来自Hu等人[14]的数据集。在所有情况下，都使用细胞哈希[7]获得了高置信度的多胞胎分类二进制标签，并将其作为评估的基准。在仅依赖scATAC-seq模态的方法中，SEBULA在F1分数方面始终优于AMULET和ArchR，并且与scDblFinder的表现相当（图4）。值得注意的是，ArchR和scDblFinder都使用计算机生成的双胞胎进行分类，并利用了scATAC-seq数据的多个特征，但不包括HCLC。SEBULA和AMULET之间的性能差距证实了我们合成数据模拟的发现。我们进一步假设基准数据集富含同型多胞胎，在这种情况下HCLC统计量特别有信息量。这可能解释了SEBULA相对于ArchR以及在某些情况下相对于scDblFinder的优势。下载：PNG（更大图像）TIFF（原始图像）图4。使用七个DOGMA-seq数据集对SEBULA与现有多胞胎检测方法进行基准测试。箱形图显示了在七个DOGMA-seq数据集中评估的每种多胞胎检测方法的F1分数。所有数据集中的多胞胎标签都是通过细胞哈希得出的。SEBULA-MI表示SEBULA从多组学整合中得到的结果。AMULET(ATAC)、ArchR(ATAC)、SEBULA(ATAC)和scDblFinder(ATAC)表示仅使用ATAC-seq数据应用的方法，而scDblFinder(RNA)表示仅使用RNA-seq数据应用的方法。SEBULA-MI(ATAC)*表示SEBULA将其ATAC-seq分析与scDblFinder的ATAC-seq分析的证据结合起来。COMPOSITE(RNA+ATAC)*表示同时应用于RNA-seq和ATAC-seq数据的COMPOSITE。SEBULA(RNA+ATAC)*表示SEBULA将其ATAC-seq分析与scDblFinder的RNA-seq分析的证据结合起来。每个点代表一个数据集的结果；箱形图覆盖了四分位数范围，中位数用水平线标记， whiskers延伸到四分位数范围的1.5倍。（https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1013653.g004）接下来，我们应用方程（3）中的方案来整合来自scDblFinder和SEBULA的ATAC-seq模态下的分类概率，有效地结合了scDblFinder利用的ATAC-seq特征的证据和HCLC统计量的证据。这种证据集成在所有基准数据集的ATAC-seq模态中取得了最佳的整体性能（图4）。随后，我们通过结合scDblFinder的基于scRNA-seq的推理和SEBULA的基于ATAC-seq的推理来扩展跨数据模态的证据整合，再次使用方程（3）来计算每个细胞的分类概率。值得注意的是，仅基于scRNA-seq的推理在多胞胎检测方面实现了比基于scATAC-seq的推理更高的敏感性和特异性。尽管如此，整合两种模态的证据比单独使用任何一种模态都带来了显著改进，这突显了多模态数据的互补价值。值得注意的是，集成分类器的性能与COMPOSITE相当（在某些情况下甚至略好），COMPOSITE是一种专门为跨模态多胞胎检测设计的最先进方法。最后，我们使用代表性的基准数据集评估了SEBULA相对于ArchR和scDblFinder（ATAC）的计算效率（S1文本的第4节）。SEBULA在多胞胎检测方面的运行时间明显更短，内存使用量也更低（S3图）。鉴于SEBULA中的HCLC数据、混合模型拟合和后验计算在计算上较为轻量。这些结果表明，SEBULA为大规模单细胞数据集提供了一种高效的替代方案。

讨论SEBULA实现了一种高效且稳健的计算模型，用于使用scATAC-seq数据中的片段级信息检测多胞胎。与竞争方法相比，它在广泛的模拟和真实数据分析中展示了改进的敏感性和特异性。SEBULA的概率输出可以与其他来自不同特征和模态的证据无缝集成，从而实现更有效的多胞胎检测。对于snATAC-seq数据，SEBULA专注于一个特征HCLC，我们证明了它对于区分多胞胎和单细胞具有很高的信息量。我们在这个背景下的主要贡献是在经验贝叶斯框架内对单细胞分布进行半参数建模。由于snATAC-seq实验的复杂性和HCLC统计量的构建（涉及对基因组位点的显式审查），我们发现标准参数分布族无法充分拟合经验单细胞数据。SEBULA中的半参数策略假设低HCLC值主要由单细胞主导。通过应用Box-Cox变换，有效地将HCLC计数数据标准化，我们期望正态密度可以充分描述低HCLC范围内的单细胞分布，这是由于中心极限定理。这种策略在我们的模拟和真实数据应用中都证明是有效的。与AMULET使用的基于人工双胞胎模拟的替代非参数方法（例如从观察到的细胞构建的合成杂交体中学习经验多胞胎分布）相比，SEBULA所依赖的假设更为宽松且实际。因此，我们观察到即使当多胞胎变得丰富或占主导时，SEBULA仍然保持强劲的性能（S6图）。在类似条件下，通过人工双胞胎模拟学习的分布可能会严重偏斜，从而影响它们检测多胞胎的能力。SEBULA使用朴素贝叶斯框架来整合不同数据特征和模态的证据。这种框架鼓励采用分而治之的策略来适应日益复杂的基因组数据结构：与其尝试同时联合建模所有模态的特征，不如设计针对单个特征的分析模块，然后结合这些模块的证据。SEBULA可以处理以各种形式表示的证据，包括后验概率、似然函数/贝叶斯因子、z分数和p值。作为朴素贝叶斯分类器，SEBULA采用了朴素独立性假设，即特征在单细胞/多胞胎标签条件下是独立的。我们承认这个假设对于真实数据可能过于强烈且不现实。为了评估其在真实数据中的有效性，我们检查了DOGMA-seq数据集中RNA和ATAC模态之间整合特征的经验相关性，发现朴素独立性假设并没有被严重违反（S1文本的第5节和S7图）。此外，人们普遍认为，即使朴素独立性假设不完全满足，朴素贝叶斯分类器产生的分类决策边界仍然可以是最优的[25–27]。SEBULA从真实数据分析中获得的分类性能与这种理解一致。最后，我们承认当前SEBULA实现的局限性，并承诺在未来的工作中进一步改进。首先，尽管SEBULA在HCLC统计量方面效率很高，但从ATAC-seq片段文件中提取HCLC统计量在计算上可能非常昂贵。开发更高效的算法来优化这一预处理步骤的CPU和内存使用，可以大大加速整个SEBULA工作流程。其次，由于我们在这项工作中的主要重点是评估SEBULA的分类性能，因此应进一步关注分类概率的校准（即报告的概率是否与观察到的结果频率一致）。这一点很重要，因为校准良好的概率可以更精确地控制单细胞实验中的数据质量。虽然当前实现展示了一些与校准良好的概率一致的属性，例如，我们模拟数据集中的估计多胞胎比例通常是准确的（S2图），但需要更详细的调查和方法论发展来确保更强的校准保证。

方法预处理和HCLC生成为了生成SEBULA所需的高覆盖率位点计数（HCLC）统计量，我们主要遵循AMULET中建立的预处理程序，该程序包括两个主要阶段。在第一阶段，我们处理包含所有读取对齐和一组可信调用细胞条形码的片段文件。对于每个细胞中的每个常染色体，我们保留插入大小小于900个碱基对的片段。然后，我们使用扫描线算法识别并记录高覆盖率位点（定义为单个细胞内被两个以上片段重叠的基因组区间）。在第二阶段，我们汇总所有细胞中识别的高覆盖率位点，为每个染色体创建一个无冗余的基因组区间集。这是通过使用贪婪区间合并算法实现的。基于这些合并的位点，我们构建了一个二进制矩阵，其中每一行对应一个高覆盖率位点，每一列对应一个细胞。如果细胞包含与相应位点重叠的片段，则矩阵中的条目设置为1，否则设置为0。然后计算每个细胞的HCLC为相应列中条目的总和。HCLC的半参数建模设表示实验中N个细胞条形码的HCLC值。我们首先排除HCLC严格低于预定义阈值的细胞，假设这样的细胞主要是单细胞。在方法部分，我们提供了一个计算程序，用于根据SEBULA模型的整体拟合优度选择最佳的值。然而，我们发现当时，SEBULA的结果通常很稳健，其中Q1表示第25百分位数。我们将过滤后的HCLC值集合表示为，保留的细胞数量表示为NT。对于每个值，我们应用方差稳定化和Box-Cox变换[28]，其中参数是通过最大化Box-Cox对数似然来确定的。SEBULA使用两组分混合分布来建模Box-Cox变换后的HCLC数据，其中f0假设为具有（未知的）均值和方差的正态密度。我们通过泊松样条平滑来估计混合密度f(z)，将截断变量划分为K个等间距的区间（默认K=120）。对于第i个区间，让yi表示在该区间内观察到的计数，ci表示该区间的中心。遵循Efron [23,29,30]的方法，我们将yi视为独立的泊松观测值，并拟合一个具有7阶自然样条基的广义线性模型（GLM）。具体来说，我们假设其中表示自然样条的第k个基函数。这产生了一个平滑的混合密度估计。在区间中心处的拟合值被标准化，以产生密度的离散近似：通过将区间中心ci与的累积和线性插值，随后获得了累积分布函数（CDF）的平滑估计。我们应用Efron的中心匹配方法[23]来估计变换后HCLC数据中的单倍体密度f0(z)和单倍体比例。这里的关键假设是，在预定义的中心窗口内，绝大多数变换后的HCLC值对应于单倍体细胞。（默认情况下，我们指定的中心窗口覆盖了经验分布的第20到60百分位数。）通过隔离这个范围内的数据，我们按照以下方式对对数子密度进行二次模型拟合：(4)其中表示估计的混合密度达到最大值的直方图区间的中心。假设，对数子密度展开为(5)从(4)的拟合中得到的最小二乘估计值，用于估计单倍体分布的正态密度：然后通过计算每个直方图区间内的单倍体计数的未标准化估计值，其中表示在第i个区间中心ci处的泊松样条模型的拟合计数。最后，通过标准化总的单倍体密度来估计单倍体比例：注意，表示初始过滤后细胞中单倍体的比例。为了报告整个原始文库中单倍体比例的估计值，我们使用优化截断点。在实践中，我们发现过滤掉零和低HCLC值可以显著提高混合分布估计的效率。尽管多倍体分类的最终结果通常对阈值的具体选择具有鲁棒性，但我们提出了一种简单的计算程序来帮助选择优化SEBULA性能的阈值。所提出的程序使用交叉熵损失来评估特定范围内的变换后HCLC值与估计的正态分布之间的拟合优度。具体来说，在过滤数据并拟合混合模型后，我们定义并计算相应值的交叉熵。交叉熵衡量拟合的正态分布与数据经验分布之间的差异；较低的值表示更好的拟合。因此，选择最小化交叉熵的阈值支持中心匹配假设的有效性。由于混合拟合过程在计算上高效，SEBULA可以快速评估一系列设置下的交叉熵值。为了在提高拟合优度和保留足够的数据以稳定估计混合模型之间取得平衡，SEBULA构建了一个的迹线图，并选择肘点作为最佳阈值（S4图）。为了进一步评估SEBULA对截断阈值选择的鲁棒性，我们通过在一个广泛的范围内变化阈值进行了敏感性分析。包括F1分数、AUROC和AUPRC在内的分类性能指标，以及所谓的多倍体率，在实际阈值选择下保持稳定（S5图）。这些结果表明，SEBULA对阈值的中等变化不敏感，所提出的基于交叉熵的选择程序提供了一个合理且稳定的操作点。基于整个程序，我们计算细胞j是多倍体的后验概率。在机器学习实践中，对pj值进行阈值处理是一种标准的分类方法。默认情况下，我们将pj>0.8的细胞分类为多倍体，相当于20%的局部假发现率阈值。或者，我们还实现了一种控制总体假发现率（FDR）的分类程序，主要是为了与AMULET进行比较。注意，估计的密度和诱导出相应的累积分布函数和。对于将所有Box-Cox变换值z≥t的分类为多倍体的决策规则，阈值t处的估计FDR由给出。这种方法允许用户预先指定一个目标FDR水平（例如，20%），然后直接从数据中确定相应的z截止值。为了整合来自HCLC的概率证据与其他数据特征和/或模态的证据，我们采用了一个通用的贝叶斯框架来顺序更新后验多倍体概率。我们将目标细胞的现有后验概率视为重新分析HCLC数据的新先验。然后我们从之前的仅HCLC分析中恢复每个细胞的HCLC似然。具体来说，我们计算HCLC数据的边际似然，即贝叶斯因子，对于细胞j为其中pj是基于HCLC本身的后验多倍体概率，是原始文库中单倍体的估计比例。假设和之间的条件独立性，即(6)结合HCLC证据的更新后验概率由贝叶斯规则给出：(7)注意，(6)中的条件独立性假设是朴素贝叶斯分类器中使用的朴素独立性假设。虽然这个假设在实践中可能不完全成立，但经验证据表明它在一定程度上是有效的（S1文本的第5节），特别是在跨不同模态整合数据时。此外，相同的朴素贝叶斯程序也可以应用于整合p值或z分数形式的证据（见S1文本的第3节）。支持信息 参考文献