利用BioOrthogonal非典型氨基酸标记技术，基于亲和力选择性恢复具有代谢活性的微生物细胞

《Current Research in Biotechnology》：Affinity-based recovery of metabolically active microbial cells using BioOrthogonal Non-Canonical amino acid tagging

　　梦克里斯·阿梅坎（Yumechris Amekan）| 莎拉·福雷斯特（Sarah Forrester）| 安娜贝尔·坎斯代尔（Annabel Cansdale）| 马尔詹·W·范德沃德（Marjan W. van der Woude）| 凯利·R·雷德克（Kelly R. Redeker）| 詹姆斯·P·J·钟（James P.J. Chong）
印度尼西亚日惹加查马达大学（Universitas Gadjah Mada）农业学院农业微生物学系，邮编55281

**摘要**
选择性识别具有翻译活性的细胞仍然是将微生物功能与种群动态联系起来的关键挑战。生物正交非典型氨基酸标记技术（BONCAT）能够对活细胞中新合成的蛋白质进行脉冲标记，从而提供翻译活性的时间分辨数据。虽然BONCAT通常与荧光标记和荧光激活细胞分选（FACS）结合使用，但对其高精度仪器和透明基质的依赖限制了其应用范围。在这里，我们提出了一种完全基于台式设备的工作流程，将BONCAT与基于磁亲和力的细胞分离技术（BONCAT–ABCS）相结合，无需特殊仪器即可从混合培养物中富集具有翻译活性的大肠杆菌亚群。通过使用以葡萄糖和乳糖为碳源的交替生长模型以及两种近似同源的菌株（MV1300（Lac-）和MV1717（Lac+）），我们利用AHA脉冲标记、点击化学以及针对菌株特异性染色体标记的绝对定量PCR，在五个时间点对BONCAT标记和未标记的组分进行了分析。结果表明，BONCAT标记的组分在基因拷贝数和富集倍数方面显著高于未标记对照组（富集倍数高达6.9倍；p<0.001，ANOVA结合Tukey’s HSD检验），回收效率在12%到21%之间，背景捕获率低于4%。BONCAT-ABCS能够分辨出交替生长过程中的生理差异，在乳糖代谢期间选择性富集Lac+细胞，而Lac-细胞则保持翻译不活跃状态。重要的是，这种富集反映了基于活性的种群变化，而非罕见细胞的扩增，突显了BONCAT–ABCS在批量代谢分析、工程微生物系统、微生物组研究以及生物过程监测中的适用性。

**引言**
活跃的微生物细胞会根据底物可用性和环境变化调节其蛋白质合成和基因表达。特别是翻译活性，作为微生物种群代谢响应的动态和即时指标。翻译过程发生在毫秒级的时间尺度上（Livingston等人，2023年），这使得能够检测到转录或基因组测量无法捕捉到的快速生理转变。为了检测这种活性，Dieterich等人（Dieterich等人，2006年）引入了生物正交非典型氨基酸标记技术（BONCAT），该技术已成为微生物细胞生物学和生态学中的变革性工具，为研究人员提供了一种在复杂生物系统中选择性分离和研究代谢活跃细胞的方法。

BONCAT通过将非典型氨基酸类似物——L-叠氮同型丙氨酸（AHA）或L-同型丙炔甘氨酸（HPG）作为生长培养基中甲硫氨酸的替代品，使研究人员能够在活细胞中选择性标记新合成的蛋白质。这些类似物在翻译过程中被整合到新生蛋白质中。尽管BONCAT标记在短脉冲条件下通常耐受性良好（Hatzenpichler等人，2016年；Hatzenpichler等人，2020年；Steward等人，2020年），但最近的研究表明，非典型氨基酸可能在长时间暴露下对菌株和环境条件产生依赖性生理效应（Landor等人，2023年）。因此，通常采用短脉冲标记以减少干扰。随后，通过铜催化的点击化学反应将带有叠氮或炔基的蛋白质与荧光或亲和标记物结合，以便后续对代谢活跃细胞进行可视化和分析（Dieterich等人，2006年；Hatzenpichler等人，2016年；Pezzi等人，2018年）。在完整的细胞中，只有表面暴露或分泌的BONCAT标记蛋白质可以直接被点击化学试剂检测到。对于细胞内定位的BONCAT标记蛋白质，通常需要在探针进入前进行受控的膜通透化处理（Dieterich等人，2006年；Hatzenpichler和Orphan，2015年）。

在典型应用中，BONCAT与荧光标记结合使用，随后通过荧光激活细胞分选（FACS）来分离具有翻译活性的细胞（BONCAT-FACS），通常再通过高通量测序（BONCAT-FACS-Seq）来研究与活性相关的分类学或功能特征。BONCAT-FACS已成功应用于多种生态系统，包括淡水（Hatzenpichler等人，2014年）、海洋（Lindivat等人，2020年；Michels等人，2021年；Martinez-Varela等人，2021年；Birnstiel等人，2022年）、土壤（Couradeau等人，2019年）、人体肠道微生物群（Valentini等人，2020年；Taguer等人，2021年）、厌氧氨氧化菌群（Chen等人，2021年）、盐沼（Marlow等人，2021年）、活性污泥（Du和Behrens，2021年；Madill等人，2021年）以及煤层（McKay等人，2022年；Schweitzer等人，2022年）。尽管BONCAT-FACS非常强大，但它依赖于许多实验室不具备的仪器和生物安全基础设施，这成为其更广泛应用的障碍。将其应用于土壤或污泥等复杂环境基质时，还会遇到自荧光和颗粒干扰等问题，这些因素会降低BONCAT标记细胞的检测能力。为了解决这些问题，我们开发了一种不依赖FACS的方法，将BONCAT与基于磁亲和力的细胞分离技术（ABCS）相结合，使用标准台式设备富集具有翻译活性的微生物细胞。在这种BONCAT–ABCS工作流程中，AHA标记的表面蛋白质通过点击化学反应被生物素化，并使用NeutrAvidin?包被的磁珠捕获（Link和Tirrell，2003年），从而无需流式细胞术或先进基础设施即可富集代谢活跃细胞。由于只有表面暴露的BONCAT标记蛋白质可以被亲和结合，因此富集效果主要限于新合成蛋白质中存在于细胞表面的部分，这部分蛋白质约占细菌蛋白质组的5-10%（Booth，1980年）。这种方法适用于缺乏细胞计量能力的实验室，以及专注于群体水平分析的应用。

BONCAT在用户可控的短时间窗口内（几分钟到几小时）进行标记，从而实现代谢活性的时间分辨快照。这种时间分辨率在研究微生物对动态环境变化的响应时特别有价值，例如营养物质的转变。然而，由于甲硫氨酸类似物会被无差别地整合到所有新合成的蛋白质中，因此所得到的蛋白质池不仅包括与感兴趣的环境刺激直接相关的蛋白质，还包括参与基本细胞维持的丰富管家蛋白（如核糖体蛋白、伴侣蛋白、中心代谢酶）以及其他与目标过程无关的蛋白质（Lindivat等人，2021年）。这种背景干扰可能会稀释信号特异性并使解释复杂化。为了减轻这一问题，我们采用短脉冲AHA标记来偏向于对刺激最敏感的蛋白质，并使用针对菌株特异性标记的绝对定量PCR来验证富集效果并量化翻译活性。

在这项研究中，我们展示了BONCAT–ABCS作为一种简单、可扩展的基于亲和力的富集方法，用于富集具有翻译活性的微生物亚群。作为概念验证，我们将BONCAT–ABCS应用于一种涉及乳糖代谢差异的近似同源大肠杆菌菌株的受控交替生长模型。该系统能够定量评估富集效果、回收效率和背景捕获情况，证明了BONCAT–ABCS在群体水平上分辨与活性相关差异的能力。

**方法**
**大肠杆菌菌株和培养条件**
使用了E. coli MV1300（MG1655 Δ lacZYA；卡那霉素抗性）和E. coli MV1717（MG1655 lac+；氯霉素抗性）菌株。通过在MacConkey琼脂上观察（补充图S1A）确认了它们之间的差异：MV1717（Lac+）形成粉红色菌落，而MV1300（Lac-）形成白色菌落。抗生素抗性（MV1717对氯霉素，MV1300对卡那霉素）被用作菌株特异性标记（补充图S1B–C）。将菌株划线接种在含有30 μg/mL卡那霉素（MV1300）或34 μg/mL氯霉素（MV1717）的Luria-Bertani（LB）琼脂上，并在37°C下过夜培养。每种菌株的一个菌落被接种到含有相应抗生素的25 mL Falcon试管中的25 mL LB培养基中，并在37°C下以120 rpm的轨道摇床速度培养过夜（18小时）。培养至600 nm处的光密度（OD600）达到1.4，相当于约1.1 × 10^9个细胞/mL。通过离心（1940 × g，37°C，15分钟）收获每个试管中的生物量，用10 mL预热（37°C）的过滤灭菌PBS洗涤两次，然后重新悬浮在5 mL 1x吗啉丙磺酸（MOPS；pH 7.2）最小培养基（M2106，Teknova，CA；Neidhardt等人，1974年）中。然后将两种菌株以1:1的比例（v/v）混合，得到总共10 mL的混合菌株接种液，并测量其OD600值。该混合接种液用于接种3 L生物反应器进行大肠杆菌葡萄糖-乳糖交替生长实验（图1）。

**图1. BONCAT-ABCS（生物正交非典型氨基酸标记结合基于亲和力的细胞分离）工作流程，用于在混合大肠杆菌菌株的葡萄糖-乳糖交替生长过程中标记和富集具有翻译活性的细胞。** 两种菌株分别培养18小时至OD600约为1.4（相当于约1.1 × 10^9个细胞/mL），然后根据OD值以1:1（v/v）比例混合后开始实验。在交替生长开始前、期间和结束后，从指数生长的培养物中收集BONCAT标记样本。AHA标记的细胞通过铜催化的点击化学反应与生物素-炔基结合，并使用磁NeutrAvidin?珠进行富集，从而实现基于亲和力的细胞分离（ABCS）。同时处理的未标记对照组用于评估非特异性珠子结合。从分离的细胞中提取DNA进行定量PCR分析，以确定被标记和富集的活性大肠杆菌菌株的比例。另外，将部分样本接种在MacConkey琼脂上进行培养，以区分和计数乳糖发酵菌株和非乳糖发酵菌株。

**交替生长实验**
使用3 L玻璃高压灭菌生物反应器（Applikon Bio）进行大肠杆菌混合菌株的交替生长实验（图1）。温度维持在37°C（±0.3°C）。使用Bio Controller ADI 1010记录并监测pH值，并通过添加2 M NaOH手动维持在7.2 ± 0.05。通过调整搅拌速度（270–500 rpm）和固定1 L/min的空气流速（Traxler等人，2006年），保持溶解氧浓度高于20%饱和度。使用混合接种的大肠杆菌MV1300（Lac-）和MV1717（Lac+）菌株接种3 L发酵器，其中含有1 L 1x MOPS最小培养基（pH 7.2；M2106，Teknova，CA；Neidhardt等人，1974年），并添加0.58 g/L葡萄糖和1.5 g/L乳糖作为唯一碳源。在交替生长开始前和结束后每30分钟收集2 mL样本，在生长过程中每10分钟收集一次样本（Bate等人，2023年；Mostovenko等人，2011年），以监测细胞密度。这些时间点提供了不同翻译状态下的定量数据，从而可以计算回收效率、非特异性背景结合和富集因子（EF）。通过Thermo Spectronic Biomate 3 UV–Visible分光光度计测量OD600值，该仪器以未接种培养基为空白对照进行校准。当OD600 > 0.4时，根据稀释后的样本重新测量OD600值。将细胞样本接种在MacConkey琼脂上（Merck），并在37°C下倒置培养过夜，以区分和计数可存活的乳糖发酵（MV1717，Lac+，粉红色菌落）和非乳糖发酵（MV1300，Lac-，白色菌落）大肠杆菌菌株。在交替生长开始前、期间和结束后三个不同时间点进行平板计数。同时，将1 mL培养物离心（10,000 × g，5分钟），并将所得生物量储存在-20°C下用于基因组DNA提取和定量PCR（qPCR）分析。上清液保留并储存在4°C下，使用酶法试剂盒（CBA086，Sigma-Aldrich用于葡萄糖；K624，BioVision用于乳糖）测量葡萄糖和乳糖浓度。

**BONCAT标记和固定**
对于BONCAT和非BONCAT-ABCS处理，将5 mL培养液无菌转移到15 mL Falcon试管中。BONCAT样本中加入L-叠氮同型丙氨酸（AHA；Click Chemistry Tools，USA），溶解在0.2 μm过滤灭菌的超纯水中，最终浓度为1 mM；而非BONCAT对照组则加入等体积的无菌超纯水。所有样本在37°C下旋转振荡培养15分钟，然后以10,000 × g离心15分钟，4°C。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在3 mL乙醇:PBS溶液中（1:1，v/v），然后立即固定在-20°C下进行进一步处理。固定是为了在后续的点击化学和亲和捕获过程中保持细胞结构并稳定BONCAT标记蛋白质。使用乙醇固定是因为基于酒精的固定剂主要通过蛋白质沉淀而不是共价交联来发挥作用，这有助于保持标记蛋白质的可检测性（Battifora和Kopinski，1986年；Rahman等人，2022年；Chen等人，2025年）。

**点击化学和BONCAT可视化**
对于BONCAT标记，在固定前将对数生长期的大肠杆菌培养物与1 mM L-叠氮同型丙氨酸（AHA）一起培养15分钟（37°C）。这个短脉冲时间大约相当于营养丰富条件下的加倍时间的一半，旨在最小化蛋白质组的扰动，同时捕获活跃的翻译事件（Bagert等人，2014年；Landor等人，2023年）。点击标记按照之前描述的方法（Hatzenpichler和Orphan，2015年）使用Click-&-Go?细胞反应缓冲液套件（Click Chemistry Tools，USA）进行。点击反应混合物根据制造商的说明制备，并添加了3 μM Alexa Fluor? 488-alkyne（用于荧光可视化）或3 μM biotin-alkyne（用于磁分离）。对于荧光显微镜观察，固定后的AHA标记生物质在超纯水中稀释10倍后涂抹在特氟龙涂层的玻璃载玻片上。样品在46°C下干燥3分钟，然后依次用50%、80%和96%的乙醇脱水3分钟，最后在室温下风干。这种脱水和干燥过程增强了膜的通透性，使点击试剂能够接触到细胞内的BONCAT标记蛋白质。将含有Alexa Fluor? 488-alkyne的20 μL点击反应混合物滴在清洁后的盖玻片上，倒置后放在固定好的样品上（Leizeaga等人，2017年）。载玻片与点击反应混合物一起孵育（≥30分钟，室温，黑暗潮湿的环境）（Mostovenko等人，2011年），用PBS洗涤三次，再进行第二次脱水处理，风干后通过共聚焦显微镜成像（Zeiss LSM 710）（见补充图S2）。

对于磁捕获实验，点击标记是在悬浮液中进行，无需固定载玻片、脱水步骤或干燥过程。在这种条件下，细胞的整体结构得以保留，生物素结合主要发生在表面可及的BONCAT标记蛋白质上，从而在保持细胞完整性的同时实现亲和捕获。

基于亲和力的细胞分离（BONCAT–ABCS）：
将每个固定样品（BONCAT和非BONCAT）的250 μL通过离心（16,100 × g，5分钟，室温）沉淀。沉淀物重新悬浮在250 μL 80%乙醇中并孵育3分钟（室温）。然后向每个悬浮液中加入1.2 mL 96%乙醇，混合并孵育3分钟（室温），再次沉淀。沉淀物用250 μL 1x PBS洗涤后，通过短暂涡旋（3秒）重新悬浮在含有生物素炔基的500 μL点击反应混合物中。样品在室温下旋转混合30分钟。点击反应后，用800 μL PBS洗涤细胞，然后重新悬浮在含有20%甘油的800 μL 1x PBS中（涡旋5秒）。向每个样品中加入10 μL NeutrAvidin?包被的磁珠（78152104010150，GE Healthcare），并在4°C下旋转混合30分钟。磁珠在磁力架上浓缩5分钟。磁捕获后，保留与磁珠结合的部分进行分析。上清液代表未结合的细胞，不单独进行定量，因为富集效果是相对于未标记和BONCAT对照组来评估的。磁珠的浓度（每800 μL反应液10 μL；约1.25% v/v）是根据制造商提供的NeutrAvidin包被磁珠的结合能力（每毫克3,500–4,500 pmol生物素；相当于每10 μL体积约2.1–2.7 × 10^14个结合位点）来选择的，确保在所用条件下结合位点不会饱和。然后使用BONCAT标记的（或非BONCAT对照组的模拟标记）富集后的生物质进行DNA提取。一个相同的非BONCAT对照组用于量化分离过程中的非特异性结合。

DNA提取和定量：
使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit按照制造商的协议提取大肠杆菌菌株的基因组DNA，并进行以下修改：样品（最多5 × 10^6个细胞）在16,100 × g下离心5分钟；对于BONCAT亲和捕获的样品，细胞直接与NeutrAvidin包被的磁珠结合，无需分离步骤即可直接进行DNA提取。最大输入量5 × 10^6个细胞对应于Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit协议中推荐的输入限制；加入Buffer AE后，在室温下孵育2分钟后进行洗脱。所有类型的样品（包括未分离的样品、BONCAT标记的亲和捕获细胞（BONCAT+-ABCS）和非BONCAT标记的细胞（BONCAT?-ABCS）都使用相同的提取协议进行DNA提取，以便直接比较不同组分的数量。使用Qubit 3.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）量化DNA浓度，并将样品储存在-80°C待进一步分析。随后对所有三种类型的样品进行定量PCR（qPCR）以评估染色体DNA拷贝数。

PCR和qPCR：
使用表1中列出的引物扩增菌株特异性和管家基因靶标。使用终点PCR确认引物的特异性，并在QuantStudio? 3实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上使用SYBR化学试剂进行qPCR。使用基于基因组DNA的标准曲线进行基因拷贝数的绝对定量，效率和R2值在最佳范围内（详见补充方法中的完整反应条件和验证细节）。

表1. 用于扩增管家基因（rpsQ；本研究）以及卡那霉素抗性（aph(3′)-II nptII；(Ullmann等人，2019)）和氯霉素抗性（catA1；(Pholwat等人，2019)）的目标基因的引物序列。
| 基因 | 引物序列（5′至3′） | 解链温度（Tm）°C | 预期扩增子长度（bp） |
|--------------|-------------|------------|-----------------|
| rpsQ | GCACTGACATGACGAGAACA | 62.0 | 50.0 |
| | AACCAGCGTCCAGGATTTAG | 62.0 | 50.0 |
| nptII | GATCTCCTGTCATCTCACCTTGCT | 62.0 | 50.0 |
| | TCGCTCGATGCGATGTTTC | 58.7 | 52.6 |
| catA1 | GCCAATCCCTGGGTGAGTTT | 60.3 | 55.0 |
| | ACCTTGTCGCCTTGCGTATAA | 60.1 | 47.6 |

BONCAT–ABCS性能评估：
BONCAT标记定义了本研究中的翻译活性；因此，使用三个标准亲和力细胞富集系统的定量指标来评估BONCAT–ABCS的性能：
- BONCAT标记细胞的回收效率，定义为在BONCAT+ABCS组分中回收的总细胞比例：
RecoveryBONCAT = CBONCATCbulk × 100
其中CBONCAT是BONCAT-ABCS组分中的染色体拷贝浓度，CBulk是未分离的bulk样品中的染色体拷贝浓度。
- 富集因子（EF），定义为亲和分离后回收的BONCAT标记与非BONCAT标记染色体拷贝的比例：
EF = CBONCATCnonBONCAT
该指标反映了活跃翻译细胞相对于未标记细胞的特异性捕获效率。
- 非BONCAT标记细胞的回收效率，定义为：
RecoverynonBONCAT = CnonBONCATCbulk × 100
该值代表非特异性背景结合，类似于亲和捕获步骤的假阳性率。

这些指标共同表征了BONCAT–ABCS在活性细胞产量、富集特异性和非特异性磁珠结合方面的性能。

统计分析：
数据使用R v4.3.1进行分析。统计显著性通过单因素ANOVA后跟Tukey的事后检验来确定。p值定义如下：p < 0.05（*），p < 0.01（**），p < 0.001（***）。所有值表示技术重复的平均值±标准偏差，除非另有说明，CFU计数为n = 3，qPCR测量为n = 6。

结果和讨论：
- 大肠杆菌中BONCAT荧光标记的视觉确认：
共聚焦显微镜显示AHA处理过的细胞具有明显的绿色荧光（见图S2），与明场图像中观察到的细胞共定位。未标记的对照组显示出最小的背景信号。荧光信号可以在单细胞分辨率下检测到，表明在所施加的脉冲条件下成功结合了AHA和CuAAC。
- 二倍体生长转变揭示了菌株特异性的生长和染色体动态：
我们将BONCAT-ABCS应用于一个涉及两个近似同源的大肠杆菌菌株MV1300（Lac-）和MV1717（Lac+）的二倍体生长模型：培养物在含有0.58 g/L葡萄糖和1.5 g/L乳糖的MOPS最小培养基中生长（见图2A）。最初，两种菌株在葡萄糖上生长相似，但只有E. coli（Lac+）由于其功能性lac操纵子而在葡萄糖耗尽后恢复生长。在OD600约为0.5时（约4 × 10^8个细胞/mL）出现约20–30分钟的生长平台期，标志着二倍体转变（Mostovenko等人，2011年，Brown，2020年），之后E. coli（Lac+）进入第二个指数期，在750分钟时OD600达到约2。相比之下，E. coli（Lac-）由于无法代谢乳糖而停滞。在MacConkey琼脂上的CFU分析证实了这种差异：两种菌株在480分钟前具有相似的活力，但在600分钟时，E. coli（Lac+）达到6.92 × 10^8 CFU/mL——比E. coli（Lac-）（2.36 × 10^8 CFU/mL）高出3倍以上（p < 0.001，ANOVA与Tukey's HSD）。
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图2. 在葡萄糖和乳糖上生长的两种混合大肠杆菌菌株的二倍体生长动态和生理反应。(A) 在添加葡萄糖和乳糖的最小培养基中，监测大肠杆菌菌株的生长和底物消耗情况。光学密度（OD600，黑色曲线，左y轴），葡萄糖（红色曲线）和乳糖（蓝色曲线）浓度（右y轴）随时间的变化。二倍体转变期由垂直虚线标示，棕色箭头表示采样时间点。(B) 在四个时间点（420分钟（二倍体转变前），470–490分钟（二倍体转变期间）和600分钟（二倍体转变后）的大肠杆菌（Lac-）和E. coli（Lac+）的菌落形成单位（CFU/mL）。通过MacConkey琼脂的差异平板法区分lac-和lac+菌落。数据表示三次技术重复的平均值±标准偏差（n = 3）。(C) 通过qPCR分析在同一时间点每种菌株的染色体拷贝数。数据表示六次技术重复的平均值±标准偏差（n = 6）。统计显著性通过单因素ANOVA后跟Tukey的事后检验来确定：p < 0.05（*），p < 0.01（**），p < 0.001（***）。完整的qPCR数据集见补充表S1。
- 通过针对catA1（E. coli（Lac+）和nptII（E. coli（Lac-）的绝对qPCR分析染色体拷贝数，归一化到rpsQ，揭示了动态复制模式（见图2C）。E. coli（Lac+）在420分钟（2.02 ± 0.22）和600分钟（2.41 ± 0.36）时显示出较高的染色体拷贝数，反映了活跃的复制。在二倍体滞后期（470–490分钟），两种菌株的拷贝数降至约1.4–1.9个/细胞，这与代谢重编程期间的暂时复制停滞一致（Akerlund等人，1995年，Morigen和A.及Skarstad, K.，2003年）。原始qPCR数据，包括Cq值和所有重复次数的计算染色体拷贝数，见补充表S1。
- 两种菌株之间观察到的翻译活性差异与经典的二倍体调控一致。在MV1717（Lac+）中，乳糖的摄取和代谢在葡萄糖耗尽后通过诱导lac操纵子而恢复，通过增加cAMP–CRP活性缓解了分解代谢物的抑制。这种转录转变重新激活了翻译，解释了600分钟时染色体复制增加和BONCAT信号增强的现象。相比之下，MV1300（Lac-）缺乏功能性lacZYA基因，因此无法代谢乳糖；葡萄糖耗尽迫使细胞进入低活性维持状态，表现为染色体拷贝数减少和BONCAT富集降低。

- qPCR特异性和效率的验证：
为了确保在不同菌株和实验条件下的染色体定量准确，我们首先确认了本研究中使用的qPCR测定的特异性和扩增效率。为了实现菌株特异性的翻译活性定量，我们采用了针对菌株特异性抗性基因nptII（E. coli（Lac-）和catA1（E. coli（Lac+）的绝对qPCR，并归一化到单拷贝管家基因rpsQ。这种方法能够精确估计每个细胞的染色体拷贝数，并区分混合群体中的不同菌株。在定量分析之前，对所有引物组进行了验证。所有引物组产生了单一的特异性扩增子，并在六个对数动态范围内表现出强线性（R2 > 0.999），扩增效率在可接受范围内（87–97%）。未观察到非特异性扩增。详细的测定验证数据，包括熔解曲线分析、凝胶电泳确认、标准曲线和效率计算，见补充图S3和补充方法中的qPCR测定验证。

- BONCAT–ABCS选择性地富集翻译活跃的亚群：
为了评估BONCAT–ABCS在不同生理状态下的富集效果，我们分析了每个采样时间点收集的三种样品类型：(i) 代表总细胞的未分离样品，(ii) 代表翻译活跃部分的BONCAT标记的亲和捕获细胞（BONCAT+ABCS），以及(iii) 代表背景捕获的非BONCAT标记的亲和组分（nonBONCAT+ABCS）。在这些组分中量化每种菌株的染色体拷贝数，以评估二倍体转变期间的翻译活性和富集动态。
- 在未分离的批量样品中（见图3A），染色体拷贝数显示出反映代谢活性和复制状态的动态变化。对于E. coli（Lac-），在葡萄糖阶段拷贝数最高，为470分钟时的10 ± 0.5 × 10^8个/细胞，到600分钟时由于细胞在葡萄糖耗尽后停止复制而稳步下降至3.3 ± 0.1 × 10^8个/细胞。E. coli（Lac+）在葡萄糖阶段也表现出类似的趋势，但在二倍体转变后如预期地增加：从490分钟时的4.2 ± 0.2 × 10^8个/细胞增加到600分钟时的5.4 ± 0.8 × 10^8个/细胞，强调了在乳糖代谢期间的重新激活。
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图3. 使用BONCAT结合基于亲和力的细胞分离技术在二倍体生长期间量化翻译活跃的大肠杆菌细胞。(A–C) 通过针对菌株特异性抗生素抗性基因的qPCR测量并在效率校正的标准曲线后量化的E. coli菌株MV1300（lac-）和MV1717（lac+）的染色体拷贝数。(A) 未分离的批量样品，(B) 亲和分离后的BONCAT标记（翻译活跃）细胞，以及(C) 分离后的非BONCAT标记（翻译不活跃）细胞。(D) BONCAT标记细胞与非BONCAT标记组分的富集因子，计算为每个时间点BONCAT标记组分中的染色体拷贝数与非BONCAT标记组分中的染色体拷贝数之比。(E–F) 基于染色体拷贝数的亲和分离回收效率，计算为回收的染色体拷贝数相对于批量样品的百分比：(E) BONCAT标记组分，以及(F) 非BONCAT组分。(G–H) 随时间变化的菌株组成，表示为MV1717（lac+）与MV1300（lac-）的比率：(G) 在批量群体中的比率，以及(H) 在BONCAT标记的亲和捕获组分中的比率，显示在乳糖阶段翻译活跃的Lac+细胞有更强的富集。比率1.0（虚线）表示两种菌株的丰度相等。所有数据均以平均值±标准差（n=6）的形式展示。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey事后检验来确定：p<0.05（*），p<0.01（**），p<0.001（***）。经过BONCAT–ABCS富集处理后（图3B），E. coli（Lac+）在600分钟时表现出强烈的翻译活性，染色体拷贝数增加到8.5±3.6×10^7拷贝/毫升，比490分钟时（2.1±0.3×10^7拷贝/毫升）高出4倍以上（p<0.001）。相比之下，E. coli（Lac-）的BONCAT标记部分从420分钟的5.4×10^7拷贝减少到600分钟的3.7×10^7拷贝，反映出其在葡萄糖耗尽后无法恢复翻译功能。这些BONCAT标记的值直接反映了与碳可用性相关的活跃蛋白质翻译情况，尤其是在E. coli（Lac+）中，该菌株在乳糖存在下恢复了代谢活性。在未使用BONCAT+ABCS处理的样本中（图3C），由于缺乏AHA标记，所有时间点和菌株的染色体拷贝数始终保持在较低水平（通常<1.8×10^7拷贝/毫升）。对于E. coli（Lac+），拷贝数范围为9.3×10^6（420分钟）至1.4×10^7（600分钟）；对于E. coli（Lac-），拷贝数范围为1.0×10^7至1.2×10^7。这些结果作为非特异性捕获的对照，证实了BONCAT介导的分离方法的特异性。

为了量化富集效果，我们计算了富集因子（EF），即BONCAT标记染色体拷贝数与非BONCAT标记染色体拷贝数的比率（图3D）。E. coli（Lac-）在葡萄糖活跃生长的420分钟时达到最高的EF值（5.41±1.19），随后在490分钟时由于进入代谢停滞期而下降至2.02±0.46。E. coli（Lac+）在600分钟时达到最高的EF值（6.86±1.32），这与乳糖驱动的翻译重新激活一致。这些时间特异性的EF模式反映了整体样本和BONCAT标记部分中的生理状态，验证了BONCAT–ABCS的敏感性。回收效率反映了在磁分离过程中翻译活跃细胞被保留的程度。图3E显示，E. coli（Lac-）的BONCAT标记细胞回收率在420分钟时最高（19.74±1.83%），到490分钟时下降至5.58±0.36%，然后在600分钟时再次适度上升至12.46±3.76%。对于E. coli（Lac+），BONCAT标记细胞的回收率在420分钟时达到峰值（21.40±1.94%），并在600分钟时再次达到峰值（18.78±5.75%），反映了其两个活跃生长阶段。同时，非BONCAT标记细胞的回收率在所有时间点均低于4%（图3F），进一步证实了BONCAT标记和磁捕获的特异性。

综上所述，这些结果表明BONCAT–ABCS能够可靠地、按菌株区分地、时间敏感地富集翻译活跃的亚群，从而实现后续的定量和功能表征。为了进一步评估对代谢差异的敏感性，我们计算了E. coli（Lac+）和E. coli（Lac-）在整个样本和BONCAT标记部分中的染色体拷贝数比率。在整体样本中（图3G），E. coli（Lac+）/E. coli（Lac-）的比率在420至490分钟期间接近1.0（0.79–1.00），表明在葡萄糖阶段生长相似，并且在双相转变期间代谢暂停。然而，在600分钟时，比率急剧上升至1.65±0.28，表明E. coli（Lac+）由于乳糖代谢而具有生长优势。在BONCAT标记部分中，这种差异更加明显。在600分钟时，E. coli（Lac+）/E. coli（Lac-）的比率达到2.63±1.11，显示出对翻译活跃的E. coli（Lac+）细胞的优先富集。在较早的时间点，比率在420至490分钟期间接近1.0，有轻微波动（例如，420分钟时为0.96±0.16，470分钟时为1.07±0.16，490分钟时为0.90±0.17），这与葡萄糖支持下的平衡生长一致。这些按菌株区分的比率动态突显了BONCAT–ABCS基于翻译活性区分几乎同源菌株之间生理差异的能力。评估基于活性的富集方法时，一个重要的考虑因素是工作流程在捕获翻译活跃细胞方面相对于非活跃细胞的效率。传统的真阳性率和假阴性率指标需要在单细胞水平上进行独立的二元分类。在基于BONCAT的系统中，翻译活性是通过标记窗口期间的AHA掺入来操作的，且该工作流程中没有正交的单细胞活性检测方法。尽管如此，为了便于与基于分选的方法进行比较，我们使用我们的双相模型作为功能上的真实值来估计按菌株区分的回收率。

利用乳糖阶段（600分钟），此时E. coli（Lac+）具有翻译活性而E. coli（Lac-）保持不活跃，我们计算了BONCAT标记部分中每种菌株的回收比例相对于整体的比例。Lac+的回收率为15.9%，而Lac-的回收率为11.1%。值得注意的是，在这个时间点，70%的BONCAT标记部分由Lac+细胞组成，表明翻译活跃细胞得到了优先富集。在较早的时间点（420–490分钟），两种菌株的回收率相当（5–22%），这与葡萄糖支持下的平衡翻译活性和双相转变期间的短暂代谢暂停一致。完整的按菌株区分的回收率数据见补充表S2。这些动态回收模式表明，BONCAT–ABCS在代谢分化期间选择性地富集活跃细胞，同时保持较低的非特异性捕获。解释这些数据时，需要考虑到BONCAT工作流程固有的生物学限制。只有那些在15分钟AHA脉冲期间合成的蛋白质以及暴露在细胞表面的蛋白质才能参与亲和结合。由于表面蛋白质仅占细菌蛋白质组的约5–10%（Booth, 1980），因此回收效率接近100%既不可预期也不符合生物学事实。因此，BONCAT–ABCS的关键评估标准不是最大捕获量，而是选择性捕获——即是否比未标记或非活跃细胞更频繁地捕获活跃翻译的细胞，这在不同菌株和代谢状态下都是一致的。

与BONCAT–FACS工作流程的比较：荧光激活细胞分选（FACS）结合BONCAT标记（BONCAT–FACS）是目前用于单细胞分辨率下分离翻译活跃微生物细胞的金标准。BONCAT–FACS能够实现高纯度的分离，并已成功应用于各种环境和宿主相关的微生物组，通常与下游测序（BONCAT–FACS–Seq）结合使用，以解析与活性相关的分类或功能特征（Hatzenpichler等人，2014年；Couradeau等人，2019年；Valentini等人，2020年；Leizeaga等人，2017年）。在稀有细胞应用中，据报道富集因子超过50–100倍，尤其是在针对复杂群落中的低丰度活跃群体时（Hatzenpichler等人，2014年；Couradeau等人，2019年）。BONCAT–FACS与本研究开发的BONCAT–ABCS工作流程之间的主要方法学差异总结在表2中。

表2. BONCAT–FACS与BONCAT–ABCS在富集翻译活跃微生物细胞方面的方法学比较
| 特征 | BONCAT–FACS | BONCAT–ABCS（本研究） |
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| 检测原理 | 通过点击化学荧光检测BONCAT标记的蛋白质，随后进行荧光激活细胞分选 | 通过生物素偶联BONCAT标记的蛋白质，随后使用NeutrAvidin包被的磁珠进行捕获 |
| 分离策略 | 基于荧光的单个BONCAT阳性细胞分选 | 从混合群体中磁亲和富集标记细胞 |
| 分辨率 | 单细胞分离 | 群体水平富集 |
| 典型应用规模 | 活性解析的单细胞基因组学和BONCAT-FACS-Seq研究 | 整体生理分析、基于qPCR的定量和活性加权社区分析 |
| 富集能力 | 从复杂微生物群体中高纯度分离BONCAT阳性细胞 | （本研究约为2–7倍） |
| 回收特性 | 回收率取决于门控阈值、荧光信号强度和分选效率；分选过程中的细胞丢失会降低总体产量 | （本研究约为12–21%），非特异性背景捕获低（<4%） |
| 吞吐量 | 受限于流式细胞仪分选速率和样本准备 | 通过磁分离实现高批量吞吐量 |
| 仪器要求 | 具有细胞分选能力的流式细胞仪和训练有素的操作员 | 标准实验室设备和磁分离架 |
| 对环境矩阵的敏感性 | 自荧光、颗粒物或不透明样本可能干扰荧光检测 | 磁富集对荧光干扰或颗粒矩阵的敏感性较低 |
| 操作可行性 | 需要专门的仪器和生物安全基础设施 | 适用于没有流式细胞仪设施的实验室 |

如表2所总结的，BONCAT–ABCS并非设计为单细胞分选方法，也不是FACS的替代品。相反，它提供了一种独立的亲和富集策略，使用标准实验室设备即可实现活性加权细胞的分离。在我们的控制双相模型中，BONCAT–ABCS实现了高达6.9倍的富集因子，回收率在12%到21%之间，背景捕获率低于4%。虽然这些富集程度低于FACS在稀有细胞情况下所能达到的程度，但足以在代谢转变期间生成清晰的、按菌株区分的翻译活性变化。重要的是，BONCAT–ABCS更注重可访问性、可扩展性和与下游群体分析的兼容性，而不是最大纯度。对于批量qPCR、宏基因组学或转录组学等应用——其中适度富集就足以使测序深度偏向活跃部分——高回收率和低非特异性捕获往往更为关键。此外，磁亲和分离避免了流式细胞仪的局限性，包括设备成本、生物安全限制、与门控相关的细胞丢失以及来自自荧光或颗粒矩阵的干扰（Hatzenpichler等人，2020年）。

总之，BONCAT–ABCS和BONCAT–FACS代表了互补的方法，而不是直接的替代品。BONCAT–FACS仍然是高分辨率单细胞分选和稀有活跃细胞分离的首选方法，而BONCAT–ABCS为没有专门仪器的实验室提供了一种实用且易于使用的富集替代方案。