《Fish & Shellfish Immunology》：A self-assembling ferritin nanoparticle vaccine based on SpyTag/SpyCatcher elicits protective immunity against largemouth bass ranavirus
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Jia-Lun Tang|Xue-Feng Wei|Jun-Yao Xia|Jun-Jie Sheng|Zhao Zhao|Bin Zhu西北农林科技大学深圳研究院，中国广东省深圳市，518000摘要：大口黑鲈鱼虹彩病毒（LMBV）是一种对水产养殖具有危害性的病原体，疫苗接种已成
Jia-Lun Tang|Xue-Feng Wei|Jun-Yao Xia|Jun-Jie Sheng|Zhao Zhao|Bin Zhu
西北农林科技大学深圳研究院，中国广东省深圳市，518000
摘要：
大口黑鲈鱼虹彩病毒（LMBV）是一种对水产养殖具有危害性的病原体，疫苗接种已成为控制感染的有效措施。本研究利用免疫信息学技术预测了LMBV主要衣壳蛋白的抗原肽。经过抗原性、毒性和致敏性筛选后，选定的肽通过SpyTag/SpyCatcher系统与Micropterus salmoides铁蛋白结合，制备出纳米颗粒疫苗（EPI-SCF）。透射电子显微镜的高分辨率超微结构分析和动态光散射表征证实，该纳米疫苗具有球形结构（约14纳米）。接种后第21天，仅含有表位的组（EPI）的血清中特异性抗体水平达到峰值，而EPI-SCF组的血清中特异性抗体水平持续升高至第28天。免疫后1周，EPI-SCF组的ACP、AKP和T-AOC水平显著高于其他实验组（P < 0.01）。免疫后21天，与对照组相比，不同组织中的免疫相关基因（如IL-6、IL-8、CD40、TGF-β、IFN-γ、IFN-α）表达显著上调（P < 0.01）。在病毒感染挑战后14天，接种疫苗的组别相对存活率（RPS）显著高于相同浓度的对照组（EPI：32.00%；EPI-SCF：57.37%；P < 0.01）。尽管本研究评估了疫苗在35天内的保护效果，但长期免疫力（T细胞免疫反应）仍需进一步验证。总体而言，本研究建立了一种基于免疫信息学的新策略，并为LMBV疫苗的开发提供了有价值的参考框架。
引言
大口黑鲈鱼虹彩病毒（LMBV）属于Iridoviridae病毒科Ranavirus属，主要感染大口黑鲈鱼（Micropterus salmoides），已在养殖和野生种群中造成严重的死亡和经济损失[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。该病毒首次从佛罗里达州Weir湖的1991年疫情中分离出来，随后在南卡罗来纳州的1995年Santee-Cooper疫情中也出现了大规模死亡事件[6]、[7]。主要衣壳蛋白（MCP）约占病毒总蛋白的45%[5]。长度为1392 bp的MCP基因编码一种463个氨基酸的蛋白质（分子量约为50 kDa），常用于病毒分类和诊断[8]。研究表明，在酵母表面展示MCP（如EBY100-OMCP系统）可引发强烈的黏膜免疫反应，保护率在52.1%至66.7%之间[4]。
铁蛋白能自组装成由24个亚单位组成的空心笼状结构，直径通常为12-20纳米，非常适合展示多价抗原。铁蛋白纳米颗粒具有良好的热稳定性，能抵抗极端pH值和化学变性。它们还可以在室温下储存，便于疫苗分发[9]、[10]。这类基于铁蛋白的制剂有望减少冷链需求，在某些情况下可制成干粉或喷雾剂，便于运输和储存[11]、[12]、[13]。每个铁蛋白纳米颗粒上的24个抗原位点模拟了病毒表面的多价性，有效增强了B细胞受体（BCR）的聚集，从而显著提高了中和抗体反应。研究显示，与常规疫苗相比，这类疫苗在小鼠模型中的中和滴度高出2-10倍[14]、[15]。通过基因融合或化学偶联，研究人员可以在病毒表面展示流感HA和SARS-CoV-2刺突蛋白，并结合多种病原体的表位来开发多价或广谱疫苗[9]、[16]。
SpyTag/SpyCatcher系统可在肽和蛋白质之间形成稳定的异肽键（Asp–Lys），实现抗原与载体蛋白或纳米颗粒的快速特异性共价结合[17]、[18]。该系统在pH 5至8的范围内均保持功能[19]。共价键合提供了卓越的稳定性，即使在SDS变性等苛刻条件下也能有效纯化蛋白质[17]，同时避免了非特异性结合。优化后的变体（如SpyTag002/SpyCatcher002）在各种pH值和温度条件下反应更快、适用范围更广[20]、[21]。通过模块化组装，抗原可以展示在类病毒颗粒（VLPs）或细菌外膜囊泡表面，从而制备出多价疫苗（如针对DEC205的靶向疫苗），显著增强免疫原性[21]、[22]、[23]。在CAR-T细胞疗法中，SpyTag标记的抗体被用来引导T细胞杀死癌细胞，构建模块化免疫突触[24]。该系统在疫苗开发、生物材料、酶工程以及诊断和分子工具领域具有广泛应用，已成为突破合成生物学和生物医学研究中传统化学交联限制的核心工具[25]、[26]、[27]。
本研究利用免疫信息学预测LMBV的表位，构建了两种重组蛋白——EPI（含表位构建体）和SCF（SpyCatcher-铁蛋白支架），并通过SpyTag/SpyCatcher系统将它们连接起来，形成多表位自组装纳米疫苗。将疫苗注射到大口黑鲈鱼体内后，可产生显著的免疫反应，提高其存活率。本研究为大口黑鲈鱼疫苗的开发提供了新的框架。
节选内容
病毒与鱼类
本研究从中国福建省吴都水产养殖场获得了300条健康的大口黑鲈鱼，体长3-4厘米，体重4-5克。所有鱼被饲养在400升的塑料水族箱中，环境温度为24±0.5°C，溶解氧浓度为8.5 mg/L，pH值在7.5-8.5之间，每天喂食两次鱼饲料（福兴生物饲料有限公司生产）。所有实验动物的饲养均遵循西北农林科技大学动物实验委员会的指导原则。
纳米颗粒疫苗的制备
预测的T细胞和B细胞表位汇总在表2中。根据NetCTL和ABCpred生成的预测分数，分别选择了六个T细胞表位和六个B细胞表位。EPI重组质粒包含六个高评分的T/B细胞表位。重组质粒EPI和SCF的示意图分别见图1A和B。EPI和SCF的全长基因分别为963 bp和687 bp，这些基因被克隆到...
讨论
生物信息学方法广泛用于表位鉴定。在线工具分析蛋白质序列的氨基酸组成和理化性质，以预测潜在的线性或构象表位。利用NetCTL筛选出五种高评分的埃博拉病毒CTL表位，并评估了它们的致敏性。在治疗策略中，通过对接目标蛋白的3D结构鉴定治疗性抑制剂，并通过IC50验证结合强度。
结论
本研究开发了一种多表位纳米颗粒疫苗EPI-SCF。这些纳米颗粒通过SpyTag/SpyCatcher蛋白连接酶系统与大口黑鲈鱼的铁蛋白共价结合，并利用免疫信息学预测了MCP的B细胞和T细胞表位。与仅含表位的EPI组相比，EPI-SCF组在大口黑鲈鱼中引发了更强的免疫反应。
作者贡献
Jia-Lun Tang：研究、数据整理、撰写初稿。
Xue-Feng Wei：方法学研究、数据整理、可视化。
Jun-Yao Xia：方法学研究、数据整理。
Jun-Jie Sheng：数据整理、可视化。
Zhao Zhao：数据整理。
Bin Zhu：概念设计、验证、数据整理、项目管理、资金筹集、监督。
数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。
致谢
本研究得到了深圳市科技计划（项目编号ZDCYKCX20250901092859005）和陕西省重点研发计划（项目编号2024NC-YBXM-095）的支持。
