通过温和的两阶段流式乙醇溶剂处理方法对使用过的马黛茶进行整体分离

《Industrial Crops and Products》：Holistic fractionation of spent yerba mate via a mild, two-stage flow-through ethanosolv process

　　萨尔瓦多·贝尔特兰-洛伦斯（Salvador Bertran-Llorens）、周文（Wen Zhou）、豪尔赫·希门尼斯-亚诺斯（Jorge Jiménez-Llanos）、格特-扬·W·欧弗林克（Gert-Jan W. Euverink）、豪尔赫·伦科雷特（Jorge Rencoret）、彼得·J·德乌斯（Peter J. Deuss）、马丁·A·帕拉佐洛（Martín A. Palazzolo）

格罗宁根大学工程与技术研究所（ENTEG），荷兰格罗宁根尼延博尔赫3号（Nijenborgh 3），邮编9747 AG

摘要：
生物精炼厂利用木质纤维素生物质的潜力，以替代化石碳用于化工行业。本研究以马黛茶（yerba mate）消费后产生的富含多酚（27.4%重量）的木质纤维素废弃物为原料，通过分馏方法提取有价值的化学产品。对富含多酚的组分进行HSQC核磁共振（NMR）表征后发现，即使经过工业处理和消耗后，马黛茶中的木质素聚合物仍保持较高的β-O-4键含量（每100个C9单元有51个β-O-4键）和S/G比（1.4）。在单一流式反应器中，首先使用乙醇去除可提取物，然后通过温和的酸催化乙醇溶剂法提取木质素。该过程获得了19.3%重量可提取物和68%的初始多酚组分。回收的多酚组分中的木质素芳基醚结构得到了良好保留，表现为每100个C9单元仍保留有51个β-O-4键。含有单体乙基糖苷结构的提取水相碳水化合物组分通过专用方法进行了定量分析，质量平衡达到94%。最后，利用乙醇溶剂法处理后的富含葡聚糖的残渣，通过嗜热细菌Tepidimonas taiwanensis LMG 22826成功生产出了聚羟基丁酸酯（PHB），产率为每克单糖37毫克。

引言：
生物精炼厂作为传统石油基精炼厂的可持续替代方案，受到了广泛关注（Chandel等人，2018年）。这些设施能够利用木质纤维素生物质（LCB）等可再生原料，生产生物基化学品、生物燃料、生物聚合物和生物塑料等有价值的产品（Sanderson，2011年）。从小麦秸秆、甘蔗渣和稻草等原料中提取的木质纤维素残渣通常由纤维素（30–45%重量）、半纤维素（17–25%）和木质素（15–35%）组成，具体组成因植物种类、年龄以及环境和农艺条件而异（Rencoret等人，2023年）。马黛茶（Ilex paraguariensis）在南美洲是一种广泛饮用的饮品（Gullón等人，2018年；Sola等人，2025年），在阿根廷、乌拉圭、巴拉圭和巴西的人均年消费量分别为5–6公斤、8–10公斤和2–3公斤（Gawron-Gzella等人，2021年）。尽管马黛茶使用广泛，但其废弃后的残渣（SYM）通常由叶片、木质茎和细小颗粒混合而成，饮用后通常被丢弃（da Silveira等人，2014年）。马黛茶中的非结构部分含有酚类和黄酮类化合物等，这些化合物在多种应用中具有很高的价值（Gullón等人，2018年；Sola等人，2025年）。以往关于这种废弃物利用的研究主要集中在提取抗氧化化合物或葡萄糖（Deladino等人，2013年；Gullón等人，2018年；Menezes等人，2023年），或制备生物吸附材料（Quintas等人，2019年）等方面。Grande等人早期使用类似有机溶剂的方法（以草酸为催化剂，在水/2-甲基四氢呋喃双相系统中，温度为140°C）将冲泡后的马黛茶叶片分馏为富含木糖、葡萄糖和木质素的组分（Grande等人，2015年）。然而，对于SYM的全面表征和综合利用尚未得到充分探索，尤其是其木质素含量及其性质在文献中尚未详细研究。为了提高生物精炼厂的盈利能力，需要对其所有组分进行详细表征以实现最大化利用（Cao等人，2018年；Chio等人，2019年；Ragauskas等人，2014年）。目前大多数木质纤维素处理方法侧重于纤维素的回收，通常使用浓碱溶液和高温条件，这些条件虽然可以去除其他生物质组分，但会导致半纤维素和木质素的降解和缩合（Abu-Omar等人，2021年；Renders等人，2017年）。此类过程中使用的苛刻条件会破坏木质素中的主要β-O-4醚键结构，生成难以进一步利用的活性片段（Phongpreecha等人，2017年）。此外，半纤维素衍生的糖类通常会脱水生成糠醛等化合物，甚至进一步转化为腐殖质，从而增加处理难度。一种提高木质素价值的方法是通过“木质素优先”策略对木质纤维素进行分馏（Abu-Omar等人，2021年）。这种方法包括采用温和的有机溶剂方法，其中醇类作为木质素溶剂，因其较高的提取效率和良好的木质素结构保护效果而备受关注（Bertran-Llorens等人，2024a；Lancefield等人，2017年；Thoresen等人，2020年；Zijlstra等人，2020年；Zijlstra等人，2021年）。这可以通过在分馏过程中用戊醇、甘油、丁香酚或醛类化合物对活性苄基阳离子进行α-烷氧基化来实现，从而稳定β-O-4键结构并提高生成片段的溶剂溶解性（Li等人，2024年；Madadi等人，2025c；Song等人，2025年；Zheng等人，2025年；Zijlstra等人，2020年）。最近的研究表明，流式系统在提高木质素提取效率和保持木质素结构方面效果显著（G. Brandner等人，2021年；Preko Appiah等人，2026年；Smit等人，2024年；Zijlstra等人，2019a；Zijlstra等人，2021年）。有机溶剂过程通常需要预处理，例如使用索氏提取器去除可提取物，这会增加溶剂消耗和环境影响（Agwu等人，2024年；De Santi等人，2020年；Smit等人，2022年）。然而，最近的研究表明，在流式系统中，无需去除桦木中的可提取物即可实现高效脱木质素（Preko Appiah等人，2026年）。但在这种情况下，可提取物既未被利用也未计入整个过程的质量平衡。理想的“木质素优先”方法还应能够利用含糖组分，生产高附加值产品，以确保生物质充分利用。在温和的醇类分馏过程中，半纤维素衍生的碳水化合物以单体烷基糖苷的形式回收，可以单独分离（Lancefield等人，2017年）。然而，在大多数“木质素优先”过程中，改性糖类未被利用，因为其定量复杂且通常需要耗时的衍生化步骤才能进行气相色谱分析（Nicola?等人，2024年）。此外，由于缺乏合适的商业标准，定量往往不完整，阻碍了质量平衡的确定。因此，需要一种简单可靠的烷氧基糖定量方法。此外，还需要从纤维素组分中获取有价值的产品，例如通过发酵生产聚羟基烷酸酯（PHA），这是一种可持续且可生物降解的塑料替代品（Ghosh等人，2021年；Meereboer等人，2020年；Nanda等人，2022年；W. Clarke等人，2024年）。然而，PHA的成本效益生产仍是一个挑战（Bertran-Llorens等人，2024b；Zhou等人，2023年）。为解决这一问题，生物合成途径应采用更便宜的碳源，并开发出更耐用的微生物。来自“木质素优先”策略的含糖组分提供了相对低成本且易于获取的碳源，特别适合与嗜热细菌进行高价值生物转化。例如，嗜热细菌Tepidimonas taiwanensis LMG 22826已被证明可以从生物质废弃物中生产PHA（Kourilova等人，2021年）。本研究探讨了马黛茶废弃物作为丰富的碳源的利用，对其进行了全面表征，以便采用针对性的整体处理方法（图1）。开发了两阶段乙醇提取工艺，以分离有价值的可提取物和酚类成分（包括木质素和半纤维素衍生的单糖），同时提高纤维素残渣的利用率。所有生成的组分都进行了深入表征，以评估其价值潜力。特别是对烷基糖苷的定量及其转化为非烷氧基糖苷的过程进行了详细研究。最后，利用富含纤维素的残渣，通过T. taiwanensis LMG 22826菌株实现了聚羟基丁酸酯（PHB）的生物合成。

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图1. 用于马黛茶废弃物分馏的两阶段乙醇溶剂过程的示意图，以及本研究获得的产品流。

2. 材料与方法
2.1. 材料
马黛茶（Taragüi，常规混合品种）从Unmate有限公司（波兰）采购，传统上与葫芦、秸秆和热水一起饮用。饮用后，马黛茶在60°C下干燥18小时，然后用刀片研磨机研磨至500–1000微米的颗粒大小。处理后的马黛茶存放在室温下的干燥柜中待进一步使用。除非另有说明，所有化学试剂和标准品均从Sigma Aldrich购买。无水乙醇（99%）来自J.T.Baker（Avantor）。细菌生长培养基成分、盐类和其他试剂分别从Merck（肯尼尔沃思，新泽西州，美国）、Difco（贝克顿迪金森公司，富兰克林湖，新泽西州，美国）、Biosolve Chimie（迪尤兹，法国）、贝克顿迪金森公司（富兰克林湖，新泽西州，美国）和BOOM（梅佩尔，荷兰）采购。

2.2. 两阶段流式乙醇溶剂过程
按照我们小组之前的方法，在100毫升流式反应器中进行了两阶段乙醇溶剂过程，同时增加了预处理步骤以去除可提取物（Zijlstra等人，2019a）。将16克研磨后的马黛茶加入反应器，然后加入乙醇。当反应器内部温度达到60°C时，设置泵以3毫升/分钟的恒定流速提取生物质3小时，并定期取样。提取物样品在40°C下减压干燥并避光保存。记录回收的可提取物总重量，样品冷藏待分析。去除可提取物后，去除反应器中的剩余乙醇，并向反应器中泵入乙醇/水（8:2，v:v）混合物和0.18 M H2SO4，产生7巴的压力。压力稳定后开始加热，直至反应器温度达到120°C。随后以2毫升/分钟的恒定流速向装有生物质的反应器中泵入液体。第二步的提取液用浓NaOH中和后，在旋转蒸发器中蒸馏。干燥后的残渣重新悬浮在30毫升丙酮中，然后逐滴加入400毫升酸化水（pH 2）。通过过滤分离出絮凝的木质素，得到富含碳水化合物的液体（烷基单糖组分）和沉淀的木质素固体。剩余的富含葡聚糖的残渣从反应器中取出，在50°C的真空烤箱中干燥过夜。样品密封保存，用于NREL表征和酶法糖化。

2.3. 可提取物的表征
咖啡因的检测采用HPLC仪（Hewlett Packard 1100系列）和DAD检测器（275纳米波长）进行。使用的柱子为ZORBAX Eclipse XDB-C18 250×4.6毫米5微米，操作条件为60°C，流动相为80%/20%的水-乙腈混合物，含1.5%冰醋酸。

2.4. 生物质表征
生物质及其有机溶剂处理后的固体组分（富含纤维素的残渣和木质素）的表征遵循美国国家可再生能源实验室（NREL）的协议（Sluiter等人，2012年）。水相半纤维素组分在120°C下用4%重量H2SO4水解1小时以去除寡糖和乙醇。反应后，样品通过0.22微米孔径过滤器过滤并稀释40倍。使用Dionex Ultimate 6000系统（Thermo Scientific，桑尼维尔，加州，美国）配备CarboPac PA-1柱（2毫米×250毫米内径）和CarboPac PA-1保护柱（2毫米×50毫米内径）及PAD检测器进行HPAEC-PAD分析（Thermo Scientific，桑尼维尔，加州，美国）。单糖的洗脱采用多步梯度法，流速为0.25毫升/分钟，洗脱液分别为：A：0.1 M NaOH；B：1 M NaOAc在0.1 M NaOH中；C：0.2 M NaOH；D：milliQ水。所有分析的单糖在前20分钟内以16% A、84% D的比例洗脱，随后5分钟内以45% A、5% B的比例洗脱，最后5分钟内以60% A、40% B的比例洗脱。第二个系统是使用Agilent 1200泵的HPLC，配备了Bio-Rad有机酸柱（Aminex HPX-87H）、折射率检测器和紫外检测器（210 nm）。HPLC柱在60°C下运行，流动相为5 mM H2SO4水溶液，流速为0.55 mL/min。进样体积设置为5 μL。通过分析已知浓度的标准溶液获得的校准曲线来确定产品混合物中各化合物的浓度。水分使用PCE-MA 110水分仪进行测量。

2.5 SYM乙醇溶解木质素的化学表征
分离出的乙醇溶解木质素的分子量通过凝胶渗透色谱（GPC）分析确定。分析是在Hewlett Packard 1100系列THF-GPC上进行的，该仪器使用聚苯乙烯标准品进行了校准。木质素样品（10 mg）溶解在THF中，并加入甲苯作为流动标记物。分析前，样品用0.45 μm PTFE注射过滤器过滤。分析使用PSS WinGPC UniChrom软件进行。

2.6 SYM的全细胞和木质素提取
SYM分别用乙醇或乙醇和乙酸在Soxhlet装置中提取4小时，然后在Fritsch GmbH（Idar-Oberstein，德国）的行星球磨机中研磨，该研磨机配备有250 mL ZrO2罐和ZrO2球（5 × 15 mm，10 × 5 mm）。使用450 rpm的旋转程序，交替进行10分钟的研磨和15分钟的暂停，有效研磨时间为8小时。按照Rosado等人（2023年）描述的方案，从20克研磨后的生物质中提取物质。首先使用25 mL/g的二氧烷/水（9:1，v/v）在搅拌下提取三次，每次提取12小时，然后在4°C下以13000 × g离心25分钟进行固液分离。所得的液体提取物在40°C下减压干燥得到原始木质素。这种木质素随后重新悬浮在20 mL/g的乙酸/水（9:1，v/v）中，并滴加到800 mL的冷蒸馏水中沉淀。木质素通过离心回收，残渣冻干至干燥。然后使用25 mL/g的1,2-二氯乙烷/乙醇（2:1，v/v）纯化木质素，各组分在4°C下以50 × g离心5分钟进行分离。液体再滴加到225 mL/g的冷乙醚中，通过离心回收沉淀的木质素。这一过程也用石油醚重复进行，最终的木质素在氮气下干燥。

从SYM中提取的木质素组分的HSQC谱是在600 MHz Bruker Biospin（BASIC PROBHD，Rheinstetten，德国）仪器上获得的。为此，将60 mg样品溶解在0.6 mL的DMSO-d6中。NMR参数和峰的归属根据del Rio等人（2012年）的方法设置。

2.7 模型烷基单糖混合物的制备
分别将16 g的D-木糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖和D-半乳糖加入流式反应器中，然后泵入8:2（v:v）的乙醇/水混合物和0.18 M H2SO4，直到充满反应器并开始加热。当温度达到120°C且压力达到7 bar时，反应在2 g/min的流速下进行2小时。提取的液体在中和后在40°C下减压干燥并避光保存，样品在-20°C下保存直至使用。

2.8 SYM的批量提取
总共13.13 g的回流乙醇提取后的yerba mate在8:2（v/v）的水/乙醇混合物中处理，液固比为20 L/kg，在1 L的反应器（Premex Reactor AG）中进行，反应器配备有由频率驱动器控制的顶置搅拌器（Eurotherm Drivers）。悬浮液在300 rpm下搅拌，同时温度保持在120°C下2小时。冷却后，过滤去除固体纤维素残渣。滤液在酸化水中沉淀，得到富含酚类的组分。该组分在50°C的真空烤箱中过夜干燥，随后用于2D NMR表征。

2.9 富含葡聚糖的有机溶剂残渣的酶法糖化
酶法糖化使用Celliac Ctec II纤维素酶混合物（Sigma-Aldrich）进行。反应在30 mL/g生物量的50 mM醋酸缓冲液中，在pH 5下进行，置于摇床培养箱中以150 rpm和50°C孵育24小时。孵育时间结束后，将酶在95°C下灭活5分钟。然后通过Thermo Scientific Megafuge 40离心机以5000 xg离心15分钟分离固体和液体。

2.10 PHA的生产
Tepidimonas taiwanensis LMG 22826菌株来自BCCM/LMG细菌库（比利时根特）。该菌株最初在含有10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨和5 g/L酵母提取物的Luria-Bertani（LB）培养基中培养。培养物在Erlenmeyer烧瓶中以150 rpm搅拌培养24小时以制备接种物。通过测量600 nm处的光密度（OD???）和测定干重（DCW）来监测细胞生长。生物量通过12000 × g离心10分钟收获，然后在-60°C下使用CHRIST Alpha 1–4 LD plus冻干机（德国）冷冻干燥48小时。

2.10 PHA的生产
用于PHA生产的初级培养基含有0.45 g/L MgSO?·7H?O、1.31 g/L KH?PO?、1.68 g/L Na?HPO?·2H?O和1.5 mL/L的微量元素溶液（根据Vishniac和Santer的方法制备）。葡萄糖（20 g/L）作为唯一的碳源，硫酸铵（(NH?)?SO?，2.2 g/L）作为氮源。初始pH使用5 M KOH或5 M HCl调整至7.0。PHA含量根据甲醇化后的DCW百分比进行定量（根据我们之前的工作）。所得的甲酯通过配备HP-5毛细管柱（30 m × 0.32 mm内径，0.25 μm膜厚度）和火焰离子化检测器（FID）的Agilent 8860系统进行气相色谱（GC）分析。GC温度程序从40°C开始，以5°C/min的速率升高至250°C，并在150°C保持3分钟。商业聚-3-羟基丁酸酯用作外部标准。色谱数据使用OpenLAB软件（Agilent Technologies）处理。

3. 结果与讨论
3.1 废弃yerba mate的组成和木质素结构分析
干燥并研磨的SYM的结构组成通过NREL协议进行顺序酸水解确定（表1）。通过我们的提取程序回收的非结构组分占19.3 wt%（见下文）。乙醇提取的SYM的结构组成也使用NREL方法分析。如表1所示，主要成分是葡聚糖（29.2%）和通常归类为酸不溶性木质素（AIL，27.5%）的残留物。非葡聚糖碳水化合物占总生物量的17.7%。其中主要的碳水化合物是半乳糖醛酸（占所有非葡聚糖单糖的41.2%），它是某些类型果胶的主要骨架。由于非葡萄糖单糖的分布（表1），推断出的果胶类型是鼠李糖半乳醛聚糖-1，这与先前的报告一致。

表1. 废弃yerba mate的组成（以wt%表示）
| 组分 | SYM组成 | 提取物去除后的SYM组成 | 非葡萄糖单糖的分布 |
| --- | --- | --- | --- |
| 鼠李糖 | 1.37 ± 0.1 | 1.67 ± 0.1 | 7.71 |
| 阿拉伯糖 | 3.74 ± 0.4 | 4.56 ± 0.5 | 2.1 |
| 半乳糖 | 1.86 ± 0.2 | 2.27 ± 0.2 | 1.0 |
| 葡萄糖 | 29.19 ± 2.3 | 3.56 ± 2.8 | 1.9 |
| 木糖 | 3.47 ± 0.1 | 4.23 ± 0.1 | 1.9 |
| 半乳糖醛酸 | 7.33 ± 0.1 | 8.94 ± 0.1 | 1.2 |
| 酸溶性木质素（ASL） | 2.36 ± 0.1 | 2.88 ± 0.1 | |
| 酸不溶性残留物（AIR） | 27.47 ± 0.2 | 3.50 ± 0.3 | |
| 灰分 | 2.5 ± 1 | 3.05 ± 1.3 | |
| 乙醇提取物 | 19.3 ± 1.1 | | |
| 其他 | 1.3 ± 0.0 | 3.3 | |

从乙醇提取后的SYM中计算出的每种单糖的量除以SYM中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸的总和。不含乙醇提取物的SYM显示出通常在NREL协议中称为酸不溶性木质素（AIL）的高含量（Sluiter等人，2012），占结构组分的33.5 wt%。这一高AIL含量得到了关于yerba mate树皮和叶子以及SYM的先前文献的支持（Júnior等人，2020；Pagliosa等人，2010），并且比典型的草本木质纤维素废弃物（如玉米芯、小麦秸秆、甘蔗渣和芒草，通常在15–20%范围内）和硬木（如山毛榉木，大约30%）的AIL含量更高（Bertran-Llorens等人，2024b）。然而，需要注意的是，NREL中描述的AIL仅提供了木质素含量的粗略估计，因为其他酸不溶性化合物如脂质、蛋白质和多酚也可能对其含量有所贡献（van Erven等人，2025）。因此，在这项工作中，我们决定将这一组分称为酸不溶性残留物（AIR）。为了更好地了解组成并表征SYM木质素的存在，进行深入的结构分析是必要的，因为据我们所知，文献中尚未发现针对SYM的此类分析。这些信息对于评估这种生物质在以木质素为主的全方位生物精炼方法中的潜力至关重要。

为了获得更深入的结构见解，对未消费前的yerba mate和SYM（即从包装中取出后和消费后的状态）获得了全细胞壁NMR谱。谱图清楚地显示了木质素组分的特征信号，包括对羟基苯基（H）、愈创木酰（G）和丁香酚基（S）单元、甲氧基以及单元间的连接。此外，还检测到强信号，对应于提取物如咖啡酸衍生物（例如氯原酸）、咖啡因、三萜皂苷（主要来自熊果酸，少量来自橄榄酸）和芸香苷（图2）。值得注意的是，这些提取物衍生的信号在饮用过程后显著减少，这与先前的报告一致。最后，值得注意的是，与我们的先前报告相反，没有检测到阿比丁（Palazzolo等人，2025）。

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图2. 未消费前yerba mate（A）和废弃yerba mate（B）的全细胞壁HSQC NMR谱的芳香/不饱和区域。完整谱图见图S1和S2。底部显示了主要识别的亚结构，包括对羟基苯基木质素单元（H）、愈创木酰木质素单元（G）、丁香酚基木质素单元（S）、咖啡酰酯衍生物（CA）、咖啡因（Caf）、芸香苷（R）和蛋白质残渣（苯丙氨酸，Ph；酪氨酸，Ty）。这些结构用颜色编码以匹配相应的HSQC NMR信号。

为了更深入地了解酚类组分，使用1,4-二氧烷对乙醇提取的SYM进行了研磨木材提取方法，并通过HSQC NMR进行分析（图3A）。由于甲基半乳糖醛酸和半乳糖醛酸的信号与β-O-4α的信号重叠，因此对光谱的解释具有挑战性（Dartora等人，2013年；do Nascimento等人，2017年）。为了减少提取物和坚韧碳水化合物的干扰，未含有乙醇提取物的SYM经过了额外的冰醋酸索氏提取。在去除额外提取物后，对MWL进行了HSQC核磁共振（NMR）分析，从而能够更好地分析木质素结构（图3B）。通过使用全细胞凝胶态NMR和不同样品状态下的中性二氧烷提取进行详细表征，发现SYM中的木质素属于香叶基/愈创木基（S/G）类型，其中S单元占主导地位（S/G比为1.47）。正如预期的那样，最主要的连接方式是β-O-4，每100个C9单元中有50个β-O-4连接，而β-β和β-5键分别有12个和6个连接（图3B）。光谱显示了主要对应于咖啡酸酯衍生物的信号，包括绿原酸，这是马黛茶的主要成分（Butiuk等人，2021年），其丰度为每100个C9单元250个单位。需要注意的是，像咖啡酸酯衍生物这样的自由基团比核心木质素单元（H、G和S）更具流动性，这导致在标准HSQC NMR测量中它们被相对高估。因此，从SYM中分离出的木质素中观察到的咖啡酸酯衍生物的较高丰度可能是由于这种效应造成的。未检测到阿魏酸或对香豆酸（Kim等人，2017年）。HSQC NMR分析显示，经过乙醇和醋酸提取去除提取物后，从SYM中分离出的类木质素组分的光谱更加清晰，碳水化合物信号减少。此外，结果证实这一过程不足以完全去除生物质中的提取物，尽管醋酸完全去除了芸香苷，并显著减少了78%的咖啡酸酯衍生物（从每100个芳香木质素单元250个单位减少到54个单位），但仍然存在相当数量的咖啡酸和咖啡酸酯。此外，对应于蛋白质残基的信号变得更强烈，表明其他化学物质的去除增加了它们的浓度。

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图3. 从SYM中分离出的类木质素组分的HSQC NMR光谱中的连接（δC/δH 50–90/2.5–5.5，上）和芳香区域（δC/δH 90–150/6–7.6，下）在A）去除乙醇提取物后和B）去除乙醇和醋酸提取物后，在DMSO-d6中的情况。在底部显示了主要鉴定的木质素和多酚亚结构，包括β-O-4′烷基-芳基醚（A）、β-5′苯基香豆烷（B）、β-β′树脂醇（C）、愈创木基木质素单元（G）、香叶基木质素单元（S）、咖啡酰酯衍生物（CA）、芸香苷（R）、半乳糖醛酸（Gal）、皂苷（SU和SO）以及蛋白质残基（苯丙氨酸，Ph；酪氨酸，Ty）。鉴定的结构根据其相应的HSQC NMR信号进行了颜色编码。连接区域中的灰色信号主要对应于未指定的碳水化合物。

总体而言，对SYM的分析表明，这种生物质仍然富含提取物，含有复杂的果胶碳水化合物组分（从光谱的非异构区域中半乳糖醛酸的强烈信号可以推断出来（图3，S1和S2）），并且具有高量的AIR成分，该成分由多种富含酚类的化合物与木质素组成。这种木质素具有高比例的β-O-4连接，表明在消费和SYM加工过程中，如各种提取物的去除，保留了大量的天然木质素芳基醚结构。这些特征使得SYM成为一种有趣的生物质候选者，可以采用整体木质素优先的方法进行加工。

3.2. 两步乙醇流式提取
尽管马黛茶传统上是用热水提取用于饮用的，但如上所述，它仍然保留了大量的生物活性分子。这些化合物在各种应用中具有巨大的潜力，包括作为饲料添加剂，以及在抗炎、抗氧化甚至抗癌治疗中（Akash等人，2024年；Gupta等人，2022年；Huang等人，2023年；Satari等人，2021年）。为了回收这些有价值的成分，使用相同的流式反应器实施了基于乙醇的提取，以便后续进行乙醇溶剂化过程。这些提取物的复杂性显而易见，因为即使在乙醇提取后，它们的信号仍然可以在NMR光谱中被检测到。尽管如此，由于它们的高价值以及为了减少它们对木质素表征的干扰，在标准乙醇溶剂化处理之前加入了一个乙醇提取步骤。

在室温和60°C下对SYM进行了乙醇流式提取（图4A）。该过程在室温下获得了初始SYM的13.3%，在60°C下获得了19.3%，其中80%是在第一小时内提取的。在整个提取过程中监测了提取物中的咖啡因浓度，作为比较流式提取过程中温度影响的基准，尽管如图4B所示，这仅代表了提取物中的一部分成分。这种咖啡因的监测显示，在60°C下观察到了更高的效率，总咖啡因含量达到了25.2毫克/克生物质。这些结果表明，通过将两个通常空间分离的单元操作结合在一个使用相同溶剂的流式提取系统中，可以方便地生成有价值的早期提取物流。

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图4. A) 在流式反应器中，随着时间的推移从SYM中去除的提取物在室温或60°C下的情况。累积提取物是整个提取时间内所有点的总和。B) 在120分钟内获得的提取物流中的咖啡因含量（之后超出检测限）。

在去除提取物且不从流式反应器中取出生物质后，开始了有机溶剂木质素提取。本研究采用的条件是我们之前研究中确定的最佳参数组合：乙醇/水比例为8:2（v:v），H2SO4浓度为0.18 M，在120°C下保持2小时，洗脱液流速为2克/分钟（Bertran-Llorens等人，2024a；Zijlstra等人，2019a）。回收的富含酚类的固体的产量，经过糖杂质和水分校正后，相当于SYM中AIR的58.5%。这相当于去除提取物后剩余AIR含量的68%，显著高于通过MWL提取获得的产量（6 wt%）。这意味着在无提取物的生物质中去除了75%的AIR，相当于初始生物质中AIR含量的79%。

尽管AIR的去除率很高，但富含酚类的组分的HSQC NMR显示相对较弱的木质素信号和大量小酚类化合物的存在（图S3）。同样需要注意的是，由于自由和小酚类化合物（如咖啡酰酯衍生物）的分子流动性较高，它们在HSQC NMR光谱中显得被过度代表。从SYM中提取的木质素显示S含量相对于MWL有所增加，S/G比为1.7。最重要的是，乙醇溶剂化木质素中的β-O-4含量几乎完全保留。乙醇溶剂化木质素中的总β-O-4含量为每100个C9单元51个，其中40个被乙醇修饰（图S3）。最后，乙醇溶剂化木质素的分子量为2800 ± 0.1 Da，分子量为780 ± 26 Da（图S4），通过GPC确定。正如1000 Da以下化合物的高丰度和HSQC分析所证明的，有机溶剂残留物组分含有较小的多元醇片段。

总体而言，选定的工艺条件足够温和，可以在保留SYM中β-O-4连接的同时实现高量的AIR去除和全纤维素残留物的回收。这一点在将流式提取与在类似条件下进行的批量提取进行比较时尤为明显。使用批量处理将富含酚类的残留物的产量降低到初始AIR的60%，纤维素丰富固体的回收率降低到初始生物质的23%。此外，如图S5所示，在批量提取过程中，木质素结构发生了严重改变，使得β-O-4连接的结构特征几乎无法识别。这一观察结果与之前比较流式和批量反应器的报告一致（Anderson等人，2017年；Bertran-Llorens等人，2024b；Bertran-Llorens等人，2024a；G. Brandner等人，2021年；Jang等人，2022年；Preko Appiah等人，2026年；Ragauskas等人，2014年；Renders等人，2019年；Zijlstra等人，2021年）。本研究中获得的富含酚类的组分产量超过了在类似批量条件下核桃、山毛榉木、雪松和杨树中报告的木质素产量，也超过了在其他温和条件（<140°C）下批量系统通常获得的约45%的产量（Bauer等人，2012年；Zhang等人，2016年；Zijlstra等人，2020年）。然而，需要注意的是，我们不仅去除了结构木质素，还去除了其他酚类成分。

3.3. 提取过程中碳水化合物组分的分析
对生物质组成的分析揭示了复杂的碳水化合物组成（表1）。进一步的研究是为了全面确定二次乙醇溶剂化提取步骤中提取液中的碳水化合物产量和组成。众所周知，进行具有相对高酸度的乙醇溶剂化过程会增加化学复杂性，因为单糖会发生烷氧基化（Foltanyi等人，2020年），这一点也在HPLC分析中得到了证实（图S6）。这些单糖混合物的半定量分析已经通过NMR进行了描述（Foltanyi等人，2020年；Zijlstra等人，2021年）。通过对纯木糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖在乙醇溶剂化条件下的模型反应进行了HPLC分析，以表征和量化这些单糖（方案1）。

图1. 乙醇糖形成模型反应及其产生的产物。

HPLC分析显示了三个主要信号：未反应的单糖以及α-和β-烷氧基化衍生物，这与文献数据一致（Ma等人，2019年；Ma等人，2017年）。对于半乳糖观察到了一个例外，它显示了四个信号（图S7）。通过HSQC NMR分析，验证了糖的烷氧基化现象并量化了相对比例（图S8-10）。发现木糖的烷氧基化比例为0.57 mol/ mol未修饰，葡萄糖为1.3 mol/ mol未修饰，阿拉伯糖为0.55 mol/ mol未修饰。α-修饰的单糖更优先形成，木糖、葡萄糖和阿拉伯糖的α/β比例分别为1.4、1.5和1.3，这与之前的丁醇溶剂化过程报告一致（Foltanyi等人，2020年）。然后使用这些摩尔比建立了使用HPLC进行量化的相对响应因子（表S1）。

将产物混合物在稀释酸中水解，以降低化学复杂性并进一步便于量化。根据HPLC分析，模型反应和有机溶剂提取所得混合物中的烷氧基化单糖的水解有效地去除了乙氧基（图S11，图S12）。这种水解步骤允许使用HPAEC追踪碳水化合物，HPAEC可以分离所有碳水化合物，但不允许在PA1柱中分离修饰后的单糖。通过这种方法实现了完全的质量平衡，能够量化超过95%的常见碳水化合物（图5）。

图5. 质量平衡显示了在两步乙醇溶剂化过程中SYM主要组分的命运。单糖通过HPAEC水解后进行量化。“提取物”表示通过中性乙醇提取回收的组分，“水相”表示在随后的高温酸催化乙醇处理中获得的水相流，“木质素”表示从有机溶剂溶液中沉淀后回收的组分，“残留物”表示留在反应器中的固体材料。误差条代表三次独立运行的标准偏差。所有生成流中每种组分的数量列在表S2中。

质量平衡显示，初始非葡萄糖碳水化合物的59%在半纤维素丰富的流中回收，而初始葡萄糖的48%留在乙醇溶剂化葡聚糖丰富的残留物中（图6）。与从核桃壳、小麦秸秆或山毛榉木的乙醇溶剂化过程中通常获得的80–95%相比，SYM中的葡萄糖保留率较低（Foltanyi等人，2020年；Lancefield等人，2017年；Smit等人，2022年；Zijlstra等人，2019a）。这可以归因于几个因素。首先，对类似木质素的成分进行核磁共振（NMR）表征后发现，马黛茶中含有大量糖类，这些糖类以非结构性多醇（例如咖啡酰酯和黄酮类化合物芦丁）以及皂苷的形式存在。这与在提取过程中观察到25%的非葡萄糖糖类和21%的葡萄糖损失是一致的。其次，工业加工对马黛茶结构的影响也不容忽视。马黛茶收获后，会经历三个连续的热处理步骤：（i）快速灼烧步骤（入口温度约为450-650°C），随后是（ii）预干燥步骤（出口温度通常为100-160°C），持续时间为4分钟，最后是（iii）干燥步骤（温度通常为100-120°C，持续3-4小时）（Sola等人，2025年）。此外，马黛茶还会受到冲泡过程的影响，即通过80-90°C的水进行多次浓缩提取，直到饮料失去风味。总体而言，这些处理过程使得收获的生物质转化为本文描述的生物精炼方案中的原料（SYM）。第三，我们认为果胶与纤维素之间的相互作用较弱（Zykwinska等人，2007年），尤其是当SYM中的果胶主要侧链为阿拉伯半乳聚糖时，这可能也是加工过程中葡聚糖进一步损失的原因之一（Dartora等人，2013年；Gu和Catchmark，2013年）。

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图6. 两步乙醇溶剂法各阶段残留物的总体组成和质量平衡，以原始SYM原料的质量分数表示。标准偏差是根据三次重复实验计算得出的。

3.4. 富含葡聚糖的残留物转化为PHA
乙醇溶剂法中富含葡聚糖的成分占初始SYM中葡萄糖含量的48%，其利用是实现价值转化的重要因素（图5）。首先，我们探索了将其生物转化为高价值聚合物（如PHA）的方法。该富含葡聚糖的成分首先通过酶法消化，得到含有60%葡萄糖和几乎100%木糖的糖流（图S13）。然后，这种混合物被用作嗜热细菌T. taiwanensis LMG 22826进行PHA生物合成的碳源。我们研究了不同的条件以调整C/N比（图S14）和葡萄糖浓度（图S15），因为这些因素对PHA的生产至关重要（Zhou等人，2023年）。我们观察到T. taiwanensis能够在72小时内代谢所有单糖（图7）。该细菌还表现出对底物的选择性，在24小时内消耗了86%的葡萄糖和49%的木糖。有趣的是，在前24小时内产生了乙酸，并在48小时后完全消耗掉，这表明在PHA生产过程中还发生了次级代谢反应（Zhou等人，2025年）。

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图7. A) Tepidimonas taiwanensis LMG 22826在从SYM两步乙醇溶剂法残留物中酶解得到的碳水化合物流中发酵过程中的葡萄糖、木糖和乙酸浓度。B) 在含有5克/升商业葡萄糖的培养基中，T. taiwanensis在48小时后产生的干细胞质量（DCM）和PHA。PHA的值（mgPHA/g底物）包括作为底物的葡萄糖、木糖和乙酸的初始浓度。

从SYM衍生单糖中生产的PHA产量为使用商业纯葡萄糖时的82%（图7），达到37毫克PHA/克碳水化合物。T. taiwanensis使用商业葡萄糖生产PHA的产量为44.8毫克PHA/克葡萄糖，低于其他作者在类似条件下报告的产量（Andler等人，2024年；Kourilova等人，2021年）。然而，通过NMR分析确认所生产的PHA为聚（3-羟基丁酸）（PHB），这与文献数据一致（Kourilova等人，2021年）。

总体而言，本研究中获得的PHA含量为16.5%（重量百分比），干细胞质量为2.5克/升。这一结果与在甘油上培养的嗜热细菌所达到的PHA含量范围相符（Chavan等人，2021b；Pernicova等人，2020年），尽管低于基于葡萄糖生产所得到的37.15%（Kourilova等人，2020年）。已知乙酸是多种细菌（如Bacillus cereus HY-3或Pseudomonas citronellolis）生产PHA的良好碳源（Kacanski等人，2023年；Wang等人，2019年）。此外，之前也有报道指出T. taiwanensis能够从木糖中产生少量PHA（Kourilova等人，2021年），这也在考虑不同碳源对水解产物的影响时需要考虑。尽管如此，商业葡萄糖与工艺后获得的葡萄糖之间的比较表明，SYM乙醇溶剂法残留物中不含大量的发酵抑制剂，这意味着这种糖化碳水化合物混合物可以直接使用，无需额外的解毒步骤，凸显了该工艺的潜力。通过实验设计（DOE）优化工艺或应用更先进的机器学习方法（Madadi等人，2025b；Madadi等人，2025a），可以进一步提高转化效率。

4. 结论
本研究详细表征了SYM生物聚合物和其他化学成分，以促进其价值转化。成分分析显示，其中含有大量不溶于酸的木质素（AIL），这种成分在此类残留物中通常未被充分利用。虽然AIL通常被认为是木质素成分，但本研究发现它部分由多酚化合物和聚合木质素组成，具有较高的β-O-4含量，主要由丁香基（S）和香豆基（G）单元构成，缺乏阿魏酸和对香豆酸。为了最大化这些成分的价值转化，采用了两步乙醇溶剂法提取，提取率达到了19.3%（重量百分比），木质素脱木素化程度高达79%，其中68%的AIL以有机溶剂沉淀物的形式回收，且木质素的芳基醚结构得到了很好的保留。半纤维素成分也得到了彻底表征，其烷氧基化程度通过HSQC NMR、HPLC和HPAEC分析进行了量化。随后通过水解步骤去除了烷氧基团，从而建立了SYM中复杂碳水化合物成分的完整质量平衡。最后，使用嗜热细菌T. taiwanensis LMG 22826将富含葡萄糖的成分生物转化为有价值的生物产物聚羟基丁酸（PHB），产率为51.1毫克PHA/克葡萄糖。

CRedI作者贡献声明：
Salvador Bertran-Llorens：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。
Wen Zhou：方法学、研究、数据分析。
Gert-Jan W. Euverink：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理。
Jorge Rencoret：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、方法学、研究、数据分析。
Peter J. Deuss：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金筹集、概念化。
Martín A. Palazzolo：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目协调、方法学、研究、资金筹集、数据分析、概念化。
Jorge Jiménez-Llanos：数据分析。