四个PpMYB基因以协同的方式调控香豆素生物合成途径的转录过程

《Industrial Crops and Products》：Four PpMYB genes govern alternative transcription of the coumarin biosynthesis branch in a synergistic manner

　　金卓瑶|廖然然|刘玉贤|韩邦星|宋成
西安徽大学，庐安237012，中国

**摘要**
R2R3型MYB转录因子（TFs）在调节植物次生代谢中起着关键作用。然而，药用工业作物Peucedanum praeruptorum Dunn中香豆素生物合成的转录调控机制仍不清楚。在这里，我们研究了P. praeruptorum中的四个MYB基因及其与十一个香豆素生物合成基因在体内和体外的相互作用。AlphaFold3和分子对接初步预测了香豆素生物合成基因与主要MYB TFs之间的潜在相互作用。亚细胞定位显示所有PpMYB基因都定位于细胞核中，而关键生物合成酶则分布在内质网、质膜、叶绿体和细胞质中。酵母单杂交实验揭示了四个MYB TFs与目标基因之间的物理相互作用。电泳迁移率实验进一步证实了PpMYB3与S8H、PpMYB69与F6H、PpMYB82与F6H以及PpMYB103与S8H之间的强结合。双荧光素酶报告基因实验表明，PpMYB103显著抑制了S8H的转录，而PpMYB3和PpMYB82通过结合其启动子激活了PT-6的表达。HPLC-MS分析显示，转基因拟南芥品系中的香豆素含量存在显著差异，并观察到了不同的积累模式，所有转基因品系中的总香豆素含量均较高。qRT-PCR结果显示，PpMYB3过表达上调了F6H、COSY-1和BMT的表达，但下调了COSY-2、PT-6、PS和UGT-1的表达。PpMYB69过表达降低了COSY-2、PT-6、PS和UGT-1的表达水平。PpMYB82过表达增强了大多数测试基因的表达，除了UGT-1。本研究建立了PpMYBs调控香豆素生物合成的综合网络，为P. praeruptorum及相关工业药用作物的品质改良和分子育种提供了有价值的基因靶标。

**1. 引言**
Peucedanum praeruptorum Dunn是一种多年生、雌雄同株的开花植物，属于伞形科Peucedanum属（Song等人，2024年）。自其在《本草经集注》中首次被记录为药用物质以来，这种草药已有约1800年的使用历史（Wang等人，2024年）。P. praeruptorum的药用部分是未抽薹幼苗的干燥根，具有降气、化痰、散风和清热的功效（Song等人，2021年；Wang等人，2024年）。香豆素是P. praeruptorum的主要活性成分。2025版《中国药典》明确指出praeruptorin A和praeruptorin B是其质量评估的关键指标（Song等人，2014年；Chen等人，2019年；Song等人，2015年；中国药典委员会，2025年）。香豆素因其显著的药理活性而受到广泛关注。其生物合成起源于莽草酸途径的下游分支：L-苯丙氨酸在苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）的催化下转化为关键前体肉桂酸。肉桂酸随后经历羟基化、分子内缩合和环化等步骤形成香豆素骨架（Zhao等人，2019年；Rodrigues和Rodrigues，2021年）。在植物中，香豆素主要分布在伞形科、豆科和芸香科等少数被子植物科中，其中伞形科含有多种结构的香豆素（Wang等人，2022年）。迄今为止，多项研究已经阐明了特定香豆素化合物（如伞形花内酯、斯コポレチン和黄毒素）的生物合成途径（Qian等人，2019年；Li等人，2022年）。多组学技术的进步促进了代谢合成机制的解析。最近的一项研究报道从拟南芥中分离出一种香豆素合成酶，该酶可催化2,4-二羟基肉桂酰-CoA转化为伞形花内酯，填补了香豆素生物合成途径中的一个关键空白（Vanholme等人，2019年）。通过转录组学和代谢组学分析结合系统发育分析，阐明了P. praeruptorum中线性呋喃香豆素和角状吡喃香豆素的合成机制。34种伞形科植物的基因组和转录组研究表明，该科结构多样性的进化过程由三个基因的不同复制机制决定：香豆酰-CoA 2′-羟化酶（C2'H）、C-戊基转移酶（C-PT）和环化酶（Huang等人，2024年）。鉴定出两种新型CYP450环化酶，它们具有不同的催化活性，导致香豆素衍生物的线性/角状结构差异（Zhao等人，2024年）。通过对某些伞形科植物的基因组、转录组和代谢组综合分析，确定了参与简单香豆素合成和调控的关键基因，包括PAL、4CL、COMT、COSY和F6H，并绘制了简单香豆素的生物合成途径（Han等人，2022年）。我们之前对P. praeruptorum基因组的组装显示，全基因组复制和串联复制推动了参与香豆素和萜类化合物合成的基因的扩张（Song等人，2024年）。这些研究为参与香豆素生物合成的基因的功能验证奠定了基础。

**2. 方法**
**2.1. 植物材料及生长条件**
P. praeruptorum的植物材料来自西安徽大学的药用植物园（中国安徽庐安）。2023年8月至11月期间，采集了整株植物用于基因组DNA提取。提取总RNA并进行反转录，以获得后续载体构建的模板。N. benthamiana植物在24°C、18/6小时光照/黑暗周期的植物生长室中生长，直到长出5-6片真叶，用于瞬时表达实验。宽型（Col-0）和过表达PpMYB基因的转基因拟南芥在添加或未添加35 mg/L潮霉素的1/2 MS培养基中发芽。将含有目标基因的载体质粒引入根癌农杆菌后，在28°C下培养2天。选取一个单菌落并在添加卡那霉素和庆大霉素的LB液体培养基中扩增。收获细菌细胞后，将其悬浮在含有5%蔗糖和0.02% Silwet L-77的溶液中，调整OD600至0.8。将拟南芥的花序浸入细菌悬浮液中1.5分钟，然后取出并在黑暗条件下培养24小时，之后转移到正常光照条件下（Jin等人，2021年）。一周后重复浸渍处理，收获T0代种子。用75%乙醇消毒后，将种子播种在含有卡那霉素的1/2 MS培养基上，进行抗性筛选，得到T1代转基因植物（图1）。然后将转基因幼苗移植并在土壤混合物（泥炭藓：珍珠岩：蛭石：植物灰 = 1:1:6:1，v/v）中生长，培养条件为24°C、55%相对湿度和16小时光照/8小时黑暗周期。

**2.2. 通过AlphaFold3和分子对接预测相互作用**
使用PlantCARE数据库（https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/5261）预测下游目标基因的顺式作用元件，并筛选含有MYB样结合位点及其两侧约25 bp区域的核苷酸序列以进行后续分析。使用Swiss-Model平台（https://swissmodel.expasy.org/）构建目标蛋白的三维结构，使用DNA Sequence to Structure工具（http://scfbio-iitd.res.in/software/drugdesign/bdna.jsp）预测DNA双链结构。然后使用HDOCK服务器（http://hdock.phys.hust.edu.cn）进行蛋白质-DNA分子对接模拟。接下来，将从对接结果中提取的特征蛋白质数据输入AI-PPI模型进行初步筛选，以获得蛋白质注释、相互作用得分和模型质量得分。最后，根据AFold3算法（Jia等人，2025年）对潜在复合物结构进行精细筛选和评估。相互作用的标准如下：置信度得分≥0.7表示结合；0.5≤置信度得分<0.7表示潜在结合；置信度得分<0.5表示无结合。

**2.3. DNA和RNA提取及cDNA合成**
使用Plant Genomic DNA Kit（TIANGEN，北京）从P praeruptorum中提取基因组DNA（gDNA）。用Nanodrop分光光度计测量DNA浓度，并调整至100–200 ng/μL。使用Polysaccharide Polyphenol Plant RNA Extraction Kit（Coolaber，北京）分离总RNA。使用HiScript? III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) kit（Vazyme，南京）进行反转录。反应混合物在无RNase的试管中制备，并通过移液轻轻混合，然后在42°C下孵育2分钟（表S1）。逆转录混合液随后直接加入反应管中（表S2）。反应在以下条件下进行：37°C下加热15分钟，然后85°C下加热5秒以合成cDNA。2.4. 目标片段的PCR扩增通过参考基因组测序数据获得MYB序列。使用Primer 5.0软件设计了特异性引物。转录因子和候选基因的引物序列分别列在表S3和S4中。以cDNA为模板，使用高保真Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶（Vazyme，南京）通过PCR扩增并克隆目标基因CDS。PCR反应混合物和热循环程序分别列在表S5和S6中。2.5. 细胞内定位验证将PpMYB3、PpMYB69、PpMYB82、PpMYB103（不含终止密码子）的编码序列通过同源重组克隆到pCAMBIA1300-GFP载体中。构建的质粒被提取并储存以备后续使用。进行转化时，将1微升质粒加入10微升根癌农杆菌感受态细胞中。混合物在微量离心管中轻轻混合并在冰上孵育5分钟。然后将细胞快速冷冻在液氮中5分钟，在37°C水浴中解冻5分钟，再放回冰上5分钟。随后，向试管中加入600微升不含抗生素的LB液体培养基。培养物在28°C下以18,000 g的离心力孵育3小时。细胞通过约45,000 g的离心力收获。去除上清液后，将沉淀物重新悬浮在100微升新鲜培养基中，并涂布在含有50毫克/升卡那霉素和25毫克/升利福平的LB琼脂板上。平板在28°C下倒置孵育2天。然后将单个菌落接种到含有相同抗生素的10毫升LB液体培养基中，并在13,000 g的离心力下孵育1小时。细菌细胞通过2000 g的离心力收集。沉淀物重新悬浮在含有10毫摩尔/升MgCl2和100微摩尔/升乙酰丁香酮的缓冲液中。OD600值调整到大约0.6以便后续渗透。选择具有5-6片叶子的6周大的N. benthamiana植物进行瞬时转化。使用1毫升注射器将细菌悬浮液注入叶片的背脉附近。当大约一半的叶片区域被浸湿时，表明渗透成功。渗透后，植物在低光照条件下放置48小时。在此黑暗处理之后，从渗透区域切下叶片圆盘，避开主要叶脉，准备成像。使用激光扫描共聚焦显微镜观察和拍摄样品。eGFP信号在488纳米激发和510纳米发射下检测，而叶绿体自荧光在640纳米激发和675纳米发射下检测（Song等人，2022年）。2.6. 酵母单杂交载体的构建和转化筛选通过同源重组构建了诱饵和猎物载体。诱饵载体用BbsI线性化以进行反应设置，并纯化凝胶片段（表S7）。使用PEG/LiAc方法（42°C热休克45分钟）将Y1H Gold酵母感受态细胞与质粒转化，然后在适当的落孔平板上选择转化子。通过菌落PCR验证假定的菌落。反应程序设置为98°C下加热15分钟，35个循环，每个循环95°C下加热15秒，55°C下加热30秒，72°C下加热90秒；最后72°C下加热5分钟。产物通过琼脂糖凝胶电泳分析。阳性对照（引物YSH-F/R）产生1771 bp的条带，而诱饵重组体（引物S8Hpro-F/YSH-R）产生1896 bp的条带（表S8）。为了抑制自激活并减少假阳性，进行了Aureobasidin A（AbA）的背景筛选，并将菌落培养过夜。将OD600值调整到0.2并稀释100倍后，将细胞点涂在含有AbA梯度的SD/-Ura平板上（0-1000 ng/mL），以确定3天培养后的最低抑制浓度（Fu等人，2023年）。2.7. 酵母单杂交验证为了验证四种PpMYBs与目标序列之间的相互作用，将p53-AbAi酵母感受态细胞分别与pGADT7-Rec53质粒（阳性对照）、空的pGADT7载体（阴性对照）以及重组的pGADT7-PpMYB3和pGADT7-PpMYB103质粒转化。转化产物接种在含有最低抑制浓度的AbA的SD/-Ura-Leu平板和SD/-Ura-Leu/AbA平板上，然后在30°C下孵育4天。从每组中挑选六个克隆，重新悬浮在0.9% NaCl溶液中，并点涂在SD/-Ura-Leu和SD/-Ura-Leu/AbA平板上。在30°C下孵育后观察菌落生长（Yue等人，2017年）。2.8. 电泳迁移率测定（EMSA）为了排除假阳性相互作用，使用生物素标记的电泳迁移率测定（EMSA）评估蛋白质-DNA结合的强度。基于Y1H测定中识别的强相互作用，分析了S8H和PT-6启动子与PpMYB蛋白（PpMYB3、PpMYB82、PpMYB69和PpMYB103）的体外结合。使用PlantCARE预测2000 bp上游序列内的潜在结合位点。相应地合成了生物素化的探针（带有侧翼序列）和未标记的竞争探针（表S9）。纯化的蛋白质与生物素化探针在30°C下孵育30分钟。复合物在6%的天然聚丙烯酰胺凝胶上分离（100 V，0.5 × TBE，4°C），通过湿转移法转移到尼龙膜上（25 V，30分钟），然后进行UV交联。膜用5% BSA在TBS-T中封闭，并与HRP结合的链霉亲和素孵育（37°C，15分钟），然后洗涤并通过化学发光检测。通过与过量未标记的竞争探针的竞争确认结合特异性（Sun等人，2018年）。2.9. 双荧光素酶测定通过同源重组构建了重组载体pGreenII0800-LUC-PpS8Hpro和pGreenII-62SK-PpMYB3，并将其转化到根癌农杆菌GV3101感受态细胞中。激活的细菌培养物以相等比例混合，并共同渗透到6周大的N. benthamiana植物的叶片背表皮中。在低光照下孵育两天后，收集叶片样本并在细胞裂解缓冲液中研磨。离心后收集上清液，并依次加入Firefly荧光素酶底物和Renilla荧光素酶底物。然后使用微孔板读取器测量报告基因和内部对照的荧光信号。每个实验进行了五次生物学重复（Chang等人，2022年）。2.10. 紫杉素含量的测定将野生型和转基因拟南芥样品在37°C下干燥2天，然后研磨成粉末。称量一定量的粉末，然后与1.5毫升甲醇混合过夜浸泡，随后进行超声处理和过滤。精确称量Bergapten、peucedanocoumarin II、praeruptorin A、praeruptorin B、praeruptorin E、xanthotoxin、psoralen、columbianadin和scopoletin标准品，并溶解在10毫升甲醇中。标准品的纯度和制造商信息列在表S10中。使用Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus 95AC18柱（100毫米×2.1毫米，1.8微米），注射体积为2微升，流速为0.25毫升/分钟。柱温设置为30°C。检测波长设置为321纳米。HPLC梯度条件详细说明在表S11中。质谱条件如下：离子源：双气压电喷雾电离（ESI）；扫描模式：正离子模式；离子源温度：320°C；雾化器气体压力：35 psig。2.11. 野生型和过表达拟南芥中紫杉素相关基因的定量分析使用定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析过表达和野生型拟南芥植物中关键紫杉素生物合成基因的表达水平。从植物组织中提取总RNA并逆转录为cDNA。使用Primer Premier 5.0软件设计了特异性引物（表S12）。qRT-PCR在10微升反应体积中进行（表S13）。热循环程序详细列在表S14中。3. 结果3.1. 目标基因与PpMYBs之间相互作用的预测这种预测分析表明，基于置信度得分（表1），11个关键紫杉素生物合成途径基因分别与四种PpMYB转录因子具有潜在的结合能力。PpMYB69与S8H、F6H和BMT的相互作用潜力较高；PpMYB3与COSY-1和OMT-2的相互作用潜力较高；PpMYB82与COMT-3的相互作用潜力较高；PpMYB103与PS和UGT-1的相互作用潜力较高。表1. 蛋白质和目标相互作用的置信度得分。项目PpMYB3PpMYB69PpMYB82PpMYB103结构得分置信度得分结构得分置信度得分结构得分置信度得分结构得分置信度得分结构得分BHQH00016614(S8H)620.889660.140.923560.570.820758.480.8066BHQH00008833(F6H)620.747860.140.959860.570.738558.480.9234BHQH00001288(COSY-1)620.952260.140.863760.570.733358.480.7634BHQH00036124(COSY-2)620.745260.140.898460.570.790158.480.8347BHQH00008828(PT-6)620.802960.140.855460.570.854158.480.8181BHQH00030649(COMT-3)620.807560.140.921760.570.924558.480.8369BHQH00013672(OMT-2)620.940160.140.893160.570.869658.480.8913BHQH0003089(PS)620.862160.140.924360.570.809858.480.9275BHQH00010420(UGT-1)620.652460.140.952160.570.827658.480.9599BHQH00010422(UGT-2)620.716360.140.882360.570.843358.480.8666BHQH00036391(BMT)620.889660.140.923560.570.820758.480.80663.2. PpMYBs和紫杉素生物合成基因的细胞内定位在转染了空35S:GFP对照载体的烟草表皮细胞中，绿色荧光信号在整个细胞中均匀分布。相比之下，在转染了PpMYB3、PpMYB69、PpMYB82或PpMYB103的细胞中，绿色荧光信号特异性地定位在细胞核中（图2）。这些结果与前述关于这些蛋白质的细胞内定位的预测一致，证实了这四种转录因子都是核蛋白，并为它们的功能提供了细胞学基础。对紫杉素生物合成途径中关键基因的细胞内定位分析显示了明显的区室化。Psoralen合成酶（PS）基因定位于内质网，异戊烯基转移酶-6（PT-6）基因定位于细胞膜，咖啡酸O-甲基转移酶-3（COMT-3）基因定位于叶绿体。其余八个关键基因，包括S8H、F6H和COSY，分布在细胞质中（图3）。下载：下载高分辨率图像（560KB）下载：下载全尺寸图像图2. PpMYB3、PpMYB69、PpMYB82和PpMYB103的细胞内定位。GFP表示目标蛋白。ER-tracker Red表示内质网。Bright显示明场图像。Merged是三个通道的叠加图。35S:GFP用作阳性对照，其次是四种融合在烟草叶片中短暂表达的GFP蛋白。eGFP激发：488纳米；叶绿体自荧光激发：640纳米。刻度尺：20微米。下载：下载高分辨率图像（879KB）下载：下载全尺寸图像图3. 烟草中紫杉素生物合成途径中关键酶的细胞内定位。GFP表示目标蛋白；ER-tracker Red表示内质网；Bright显示明场图像；Merged是三个通道的叠加图。从左到右：阳性对照（35S:GFP），其次是PS、PT-6、COMT-3、S8H、F6H、BMT、OMT-2、COSY-1、COSY-2、UGT-2，每种都融合在GFP中并在烟草叶片表皮中短暂表达。eGFP激发：488纳米；叶绿体自荧光激发：640纳米。刻度尺：F6H、BMT、OMT-2和COSY-1为5微米；PT-6为15微米；35S:GFP、PS、COMT-3和S8H为20微米；COSY-2、UGT-2和UGT-1为50微米。3.3. 酵母单杂交测定阳性对照菌株（p53-AbAi）的AbA最低抑制浓度（MIC）确定为200 ng/mL，此时细菌生长完全被抑制。测定结果显示，四种MYB转录因子与不同目标基因的相互作用程度不同（表S15）。酵母单杂交测定结果显示，所有转化子在SD/-Ura/-Leu（SD-UL）平板上正常生长，表明质粒成功引入。在添加了100 ng/mL AbA的SD-UL平板上，阳性对照表现出强劲的生长，而阴性对照则没有生长。这种明显的对比证实了实验系统的可靠性。S8H启动子与PpMYB3和PpMYB103之间发生了相互作用。值得注意的是，在10^-4 ng/mL的AbA浓度下，PpMYB103仍然存活，而PpMYB3的生长完全被抑制，表明PpMYB103与S8H启动子的相互作用强度高于PpMYB3（图4A）。同样，即使在650 ng/mL AbA的选择下，F6H启动子也与PpMYB82和PpMYB69发生相互作用，其中PpMYB69显示出更强的结合亲和力（图4B）。下载：下载高分辨率图像（292KB）下载：下载全尺寸图像图4. F6H和S8H启动子的酵母单杂交测定。（A）S8H的Y1H测定；（B）F6H的Y1H测定。菌落生长表明结合能力。p53-AbAi × pGADT7-Rec53是阳性对照；pS8Hpro/pF6Hpro-AbAi × pGADT7是阴性对照。包含转录因子的组合是实验组。左侧面板显示在基本选择培养基（SD/-Ura-Leu）上的生长，右侧面板显示在添加了AbA的选择培养基上的生长。使用酵母单杂交系统分析了11个关键紫杉素生物合成基因与四种PpMYB转录因子之间的相互作用（表2）。未检测到UGT-1与PpMYB69、COSY-2与PpMYB82、PS与PpMYB103之间的相互作用，以及BMT与PpMYB103/PpMYB3之间的相互作用，而其余组合表现出不同程度的相互作用。具体来说，COSY-1与PpMYB103的相互作用最强，其次是与PpMYB3的中等相互作用，与PpMYB69和PpMYB82的相互作用相当（图5A）。COSY-2与PpMYB3的相互作用最显著，其次是PpMYB69和PpMYB103，而与PpMYB82没有相互作用（图5B）。PS与PpMYB3没有最强的结合作用观察到的是与PpMYB103（图5C）。PT-6与PpMYB82的相互作用最强，其次是PpMYB3和PpMYB103（图6A）。除了与PpMYB69没有相互作用外，UGT-1与其他三个转录因子的相互作用较弱（图6B）。此外，UGT-2与PpMYB3和PpMYB82的相互作用比与PpMYB69和PpMYB103的更强（图6C）。BMT与PpMYB82的相互作用相对较强，与PpMYB69的相互作用较弱，与PpMYB103和PpMYB3没有相互作用（图7A）。COMT-3与这四个转录因子的相互作用强度依次为PpMYB3 > PpMYB82 > PpMYB103 > PpMYB69（图7B）。OMT-3与这四个转录因子的相互作用强度依次为PpMYB103 > PpMYB69 > PpMYB3 > PpMYB82（图7C）。

表2. 蛋白质与目标相互作用的置信度得分。

空细胞
阴性对照
蛋白质-DNA结合测定组
50 x100 x
探针
阴性对照
MYB3-S8H
0182
92.74
49
116.82
36
99
3.11
60
MYB69-F6H
0209
05.22
91
069
9.82
34
98
9.90
30
MYB82-PT6
0195
19.61
41
275
3.38
81
55.28
80
MYB103-S8H
0198
61.82
31
390
7.06
61
107
4.99
50
MYB82-F6H
075
10.68
1182
31.40
1148
54.50
10
MYB3-PT6
0823
5.33
81
50
70.06
61
80
86.27
90

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图5. COSY-1、COSY-2和PS与PpMYB3、PpMYB69、PpMYB82和PpMYB103相互作用的Y1H测定。(A) COSY-1的Y1H测定；(B) COSY-2的Y1H测定；(C) PS的Y1H测定。菌落生长表明有结合能力。p53-AbAi × pGADT7-Rec53是阳性对照；pCOSY-1pro/pCOSY-2pro-AbAi × pGADT7和pPSpro-AbAi × pGADT7是阴性对照。含有转录因子的组合是实验组。左侧面板显示在基本选择培养基（SD/-Ura-Leu）上的生长情况，右侧面板显示在添加了AbA的选择培养基上的生长情况。

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图6. PT-6、UGT-1和UGT-2与PpMYB3、PpMYB69、PpMYB82和PpMYB103相互作用的Y1H测定。(A) PT-6的Y1H测定；(B) UGT-1的Y1H测定；(C) UGT-2的Y1H测定。菌落生长表明有结合能力。p53-AbAi × pGADT7-Rec53是阳性对照；pPT-6pro/pUGT-1pro-AbAi × pGADT7和pUGT-2pro-AbAi × pGADT7是阴性对照。含有转录因子的组合是实验组。左侧面板显示在基本选择培养基（SD/-Ura-Leu）上的生长情况，右侧面板显示在添加了AbA的选择培养基上的生长情况。

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图7. BMT、COMT-3和OMT-2与PpMYB3、PpMYB69、PpMYB82和PpMYB103相互作用的Y1H测定。(A) BMT的Y1H测定；(B) COMT-3的Y1H测定；(C) OMT-2的Y1H测定。菌落生长表明有结合能力。p53-AbAi × pGADT7-Rec53是阳性对照；pBMTpro/pCOMT-3pro-AbAi × pGADT7和pOMT-2pro-AbAi × pGADT7是阴性对照；含有转录因子的组合是实验组。左侧面板显示在基本选择培养基（SD/-Ura-Leu）上的生长情况，右侧面板显示在添加了AbA的选择培养基上的生长情况。

3.4. 电泳迁移率测定（EMSA）
香豆素的结构多样性主要来源于羟基化和缩合修饰。S8H催化侧链修饰，而F6H将简单的香豆素骨架转化为特定结构；PT6作用于伞形酮，决定香豆素是线性的还是角形的。在这里，我们检测了这三个基因，并使用EMSA验证了它们与四个MYB转录因子的相互作用。随着未标记竞争探针浓度的增加，滞后的条带强度逐渐减弱，证明了蛋白质与目标DNA序列的特异性结合。以S8H为例，在未添加蛋白质的对照组中只观察到自由的探针条带。当加入PpMYB3蛋白后，出现了一个明显的滞后条带，表明形成了蛋白质-DNA复合物。同样，F6H启动子特异性地结合到PpMYB69和PpMYB82上，PT-6启动子也在体外与PpMYB3和PpMYB82结合（图8）。使用ImageJ对EMSA条带进行定量分析，当加入PpMYB3、PpMYB69、PpMYB82或PpMYB103蛋白时，结合效率范围为31.3%至66.8%，而在无蛋白对照组中为0%。随着未标记冷探针浓度的增加，滞后的条带强度逐渐减弱，这证实了序列特异性结合。值得注意的是，PpMYB3与S8H启动子的结合效率最高（66.8%），而与PT6启动子的结合效率仅为31.3%。这表明PpMYB转录因子对关键香豆素生物合成基因启动子有选择性（表2）。

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图8. PpMYB蛋白与关键基因启动子相互作用的电泳迁移率测定。PpMYBs-His指的是带有His标签的MYB家族基因融合蛋白。Biotin Probe是标记探针，Cool probe是未标记的竞争探针，His-Probe是对照探针。“+”和“-”分别表示相应组分的存在或缺失。(A) PpMYB3-His与S8H探针；(B) PpMYB69-His与F6H探针；(C) PpMYB82-His与PT-6探针；(D) PpMYB103-His与S8H探针；(E) PpMYB82-His与F6H探针；(F) PpMYB3-His与PT-6探针。每个面板中，从左到右的泳道分别是：仅Biotin探针，Biotin探针 + 相应的His融合蛋白，Biotin探针 + His融合蛋白 + 特定摩尔浓度的Cool探针，以及仅His-Probe。在含有Biotin探针 + His融合蛋白的泳道中出现滞后条带，表明转录因子与基因探针结合。当与Cool探针竞争时，该滞后条带的减弱证实了特异性结合。

3.5. 双荧光素酶报告基因测定
为了进一步研究PpMYBs与香豆素生物合成基因之间的调控关系，采用了双荧光素酶报告基因测定来验证酵母单杂交结果所指示的相互作用模式。测定显示，S8H启动子与PpMYB103共转染显著抑制了荧光素酶活性，表明PpMYB103作为S8H的转录抑制剂。相反，与PpMYB3共转染导致荧光增强，表明PpMYB3作为S8B的转录激活因子（图9A）。涉及PT-6启动子的验证显示，与PpMYB3或PpMYB82共转染显著增强了荧光素酶活性，表明这两种转录因子均正向调控PT-6的表达（图9B）。

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图9. PpMYB转录因子在烟草中对S8H和PT-6启动子转录调控的双荧光素酶测定。(A) PpMYB3或PpMYB103与S8H的瞬时表达；(B) PpMYB3或PpMYB82与PT-6的瞬时表达。黑色条形代表实验组，灰色条形代表对照组。

3.6. 通过HPLC-MS分析野生型Col-0株系和过表达PpMYB3、PpMYB69、PpMYB82和PpMYB103的转基因拟南芥株系中的香豆素含量及目标基因表达
使用HPLC-MS分析了野生型Col-0株系和过表达PpMYB3、PpMYB69、PpMYB82和PpMYB103的转基因拟南芥株系中的主要香豆素成分。建立了九种香豆素成分的标准曲线（表S16）。结果表明，野生型和转基因株系之间的bergapten或xanthotoxin水平没有显著差异（图10A, 10F）。Praeruptorin B在野生型和过表达PpMYB3的株系中均未检测到。其在PpMYB69过表达株系中的含量高于PpMYB82和PpMYB103株系（图10B）。野生型中的bergapten、praeruptorin A、praeruptorin E和xanthotoxin水平始终高于所有转基因株系（图10A, 10C-10F）。psoralen的含量在PpMYB103过表达株系中显著低于野生型（图10G）。相比之下，columbianadin和scopoletin的含量在野生型中低于转基因株系（图10H-10I）。值得注意的是，scopoletin的含量在PpMYB3过表达株系中最高（图10I）。

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图10. 野生型和转基因拟南芥中的香豆素含量。(A-I) 拟南芥中bergapten、praeruptorin B、praeruptorin A、praeruptorin II、praeruptorin E、xanthotoxin、psoralen、columbianadin和scopoletin的含量。星号表示统计显著性：*p ≤ 0.05；**p ≤ 0.01；***p ≤ 0.001。
使用定量实时PCR（qRT-PCR）和ACTIN作为参考基因，分析了野生型和过表达PpMYB的转基因拟南芥中香豆素生物合成基因的表达水平（图11），包括F6H、COSY-1、COSY-2、UGT-1、PT-6、BMT和PS。为了阐明MYB基因在香豆素生物合成中的转录调控作用，选择了三个表达水平较高的独立转基因株系来分析这些关键基因的转录水平。在体内和体外实验中观察到的一些转录因子对其目标启动子的结果存在矛盾，这可能是由于物种间的遗传多样性和植物调控网络的复杂性。与野生型相比，PpMYB3过表达植物中F6H、COSY-1和BMT的表达显著上调，而COSY-2、PT-6、PS和UGT-1的表达下调（图11）。在PpMYB69过表达植物中，COSY-2、PT-6、PS和UGT-1的表达下调。在PpMYB82过表达植物中，除了UGT-1外，所有测试基因的表达均呈上调趋势。相比之下，PpMYB103的过表达显著激活了大多数基因的表达，只有UGT-1受到抑制。值得注意的是，在四个转基因株系中均未检测到S8H的表达。总体而言，这些结果表明UGT-1在所有过表达系统中均受到抑制。这一发现与双荧光素酶测定中观察到的PpMYB82对PT-6启动子的激活作用一致。体内和体外实验验证表明，PpMYB转录因子通过正向和负向机制协调香豆素生物合成途径中特定下游目标基因的表达，从而影响香豆素含量（图11）。Scopoletin的生物合成由F6H和COSY共同调控。在过表达株系中，香豆素含量和基因表达水平均有所增加（图10I和11）。Xanthotoxin、psoralen和bergapten的生物合成由BMT和COSY共同调控。然而，香豆素含量的基因表达水平呈现出相反的趋势，反映了植物中复杂的调控网络（图10A, F和G；图11）。Columbianadin的合成由COSY调控，其含量和表达趋势一致。其余香豆素的含量和表达由COSY和PT6共同调控，表明在香豆素生物合成中存在额外的调控网络。PpMYB3激活了S8H、PT-6、F6H和BMT的表达，同时抑制了PS和UGT-1。PpMYB69激活了F6H和BMT的表达，但抑制了PT-6、PS和UGT-1。PpMYB82和PpMYB103同时激活了PT-6、F6H和BMT的表达，同时抑制了UGT-1。基于这些发现，我们构建了一个示意图，说明了PpMYB转录因子介导的香豆素生物合成调控机制。

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图11. PpMYB介导的关键香豆素生物合成基因的表达分析及转录调控网络。星号表示统计显著性：*p ≤ 0.05；**p ≤ 0.01；***p ≤ 0.001。实线表示直接转录调控；虚线表示潜在的调控参与，箭头表示正向调控。带斜线的线表示负向调控。深蓝色、黄色、绿色和红色线条分别代表PpMYB对目标基因的调控。棕色、深绿色和青色线条分别代表简单香豆素、线性呋喃香豆素和角形吡喃香豆素的生物合成途径中的目标基因。粗箭头表示香豆素含量相对于野生型的增加，而细箭头表示减少。

4. 讨论
作为植物次生代谢的主要调控因子，R2R3-MYB转录因子通过特定调控激活或抑制不同的代谢分支，从而构建了一个复杂的代谢网络。这些因子对于次生代谢产物的时空特异性也至关重要。在拟南芥中，AtMYB75（PAP1）正向调控花青素生物合成，而AtMYB4负向调控木质素生物合成。这两种蛋白的联合效应建立了精细的代谢途径调控网络（Wang等人，2020年；Zheng等人，2019年）。本研究检测了四种PpMYB转录因子对关键香豆素生物合成基因的调控作用，显示出明显的特异性，这与该家族的功能特征一致。值得注意的是，PpMYB103显著抑制了S8H的转录。理论上，PpMYB103的高表达会降低S8H的水平。然而，初步的共表达分析显示它们的表达模式具有高度的时间和空间一致性。这表明植物的香豆素生物合成不是由单一转录因子控制的。相反，其他来自bHLH和WD40家族的激活因子可能与PpMYB103形成调控复合体。该复合体通过维持基础水平的S8H表达来抵消其抑制作用，以确保香豆素的稳态生产。先前的系统发育分析表明，PpMYB103属于拟南芥R2R3-MYB亚家族的S5亚支，该亚家族的成员广泛参与植物次生代谢的调控（Liao等人，2024年）。TT2（AtMYB123）属于S5亚家族，与TT8（一种bHLH转录因子）和TTG1（一种WD40重复蛋白）相互作用，形成了MBW复合体。该复合体随后激活了花青素还原酶（ANR）的表达，后者催化了花青素的还原（Baudry等人，2004年）。在棉花和杨树的同源基因中也观察到了类似的功能（Wang等人，2017年；Yan等人，2018年）。这些发现与现有研究结果一致，这些研究表明MYB和其他转录因子（TFs）广泛参与调控多种药用和工业作物的特定代谢过程（Raziq等人，2024年；Liu等人，2023年）。酵母单杂交实验和EMSA分析证实，四种PpMYBs能够特异性结合到关键香豆素生物合成基因的启动子上，从而确立了它们的直接转录调控作用。这种结合特异性与香豆素的结构多样性相平行，而这种多样性是由后期的羟基化、链烯基化和甲基化修饰驱动的。执行这些修饰的酶的表达和活性直接决定了最终产物的种类。在拟南芥中，S8H羟化酶催化香豆素侧链的羟基化反应。先前的研究表明，在酸性缺铁条件下，由scopoletin通过S8H催化生成的fraxetin会分泌到根际中。除了在香豆素生物合成中的作用外，fraxetin还有助于植物吸收铁（Siwinska等人，2018年；Tsai等人，2018年）。F6H是一种羟化酶，可将feruloyl-CoA转化为6-羟基feruloyl-CoA，在某些植物中它是形成基本香豆素骨架的关键酶（Tao等人，2023年）。链烯基转移酶（PT）催化伞形酮在C-6或C-8位置的链烯基化反应，其活性直接影响复杂香豆素产物的组成（Li等人，2024年）。我们利用双荧光素酶报告基因实验进一步阐明了PpMYBs如何通过结合到S8H、F6H和PT6基因的启动子上来精确调控香豆素的修饰并塑造产物多样性。

根据同源基因比对，拟南芥中S8H基因的直系同源物是AT3G12900，该基因的表达具有明显的组织特异性，仅在新萌发的幼苗根部有低水平表达。因此，在本研究中使用的样本中，由于S8H的表达量极低，可能无法检测到其存在。此外，当在水稻和番茄的基因在拟南芥中过表达时，也观察到了体内和体外验证结果之间的不一致性（Jang和Li，2018年；Shkolnik和Bar-Zvi，2008年）。转基因拟南芥的总香豆素含量显著高于野生型，这是由于PpMYB通过差异性调控香豆素生物合成途径来重新分配代谢流。从结构上看，香豆素被分为三类：简单香豆素、呋喃香豆素和吡喃香豆素。每一类都需要特定的酶：线性呋喃香豆素需要PS和BMT，角状吡喃香豆素需要PT和OMT，简单香豆素需要F6H和S8H（Wang等人，2024年；Song等人，2024年；Liao等人，2024年；DeLoose等人，2024年）。这四种PpMYBs差异性地调控特定分支的基因，激活主导分支并抑制冗余分支，从而平衡底物竞争和代谢资源分配，增加总香豆素含量，这是PpMYB调控香豆素的核心机制。这些结果有助于更深入地理解R2R3-MYB转录因子如何协调工业药用作物中的次级代谢网络，这已成为当前研究的重点（Yin等人，2022年；Zheng等人，2021年）。

Peucedanum praeruptorum经常出现过早抽薹现象，导致根部木质化，进而降低香豆素含量，严重影响药材的质量（Song等人，2024年）。因此，研究抽薹机制并调控早期抽薹对于提高P. praeruptorum的质量至关重要（Xie等人，2023年）。有一项研究主要关注香豆素生物合成途径中的关键酶基因，通过克隆和表达实验研究它们的表达模式，以确定它们对香豆素含量的影响（Sui等人，2019年）。值得注意的是，最近的研究探索了多种提高P. praeruptorum产量和质量的策略，例如利用内生真菌介导的纳米粒子（Huang等人，2024年）。本研究聚焦于R2R3-MYB转录因子及其对P. praeruptorum中多个香豆素生物合成分支的靶向调控，填补了上游调控研究的空白。PpMYBs对目标基因的差异性调控表明，R2R3-MYB家族在不同物种间具有功能保守性。这一发现验证了在缺乏P. praeruptorum遗传转化系统时，使用拟南芥异源系统研究药用植物次级代谢的可行性。然而，也存在一些固有的局限性：P. praeruptorum特有的修饰酶（如BMT）在拟南芥中没有直系同源物，这阻碍了相应复杂香豆素的积累。缺乏内源性相互作用辅因子和天然染色质环境也限制了某些PpMYB调控功能的完全发挥，这也是为什么这些植物中某些香豆素成分的积累量低于野生型的原因。未来的工作应在P. praeruptorum原生质体中建立瞬时表达系统或稳定转化系统，以在自然环境中精确验证这些功能。本研究还探讨了PpMYBs与早期抽薹之间的关联，为P. praeruptorum的抗早抽薹性和优质育种提供了理论基础和核心靶点。

**作者贡献声明：**
Cheng Song：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、软件使用、资源获取、项目管理、方法学设计、资金申请、数据分析、概念构建。
Bangxing Han：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、项目管理、资金申请。
Yuxian Liu：撰写——初稿、数据可视化、结果验证、实验设计、数据分析。
Ranran Liao：撰写——初稿、数据可视化、结果验证、软件使用、方法学设计、实验设计、数据分析。
Jinzhuo Yao：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、数据可视化、结果验证、软件使用、方法学设计、实验设计、数据分析、数据整理。