基于VP1/VP2/VP3蛋白的新型多肽间接ELISA方法的开发与应用，用于检测针对Senecavirus A的抗体

《International Journal of Biological Macromolecules》：Development and application of a novel multi-peptide indirect ELISA based on VP1/VP2/VP3 proteins for the antibody detection against Senecavirus A

　　

陈欣欣|林一婷|岳毅|马梦瑶|宋若琪|王颖|牛胜|颜芳|高小龙|赵云军|田文霞|任建乐

中国山西省晋中市山西农业大学兽医学院，邮编030801

摘要

新发现的Senecavirus A（SVA）已被确定为猪水泡病的重要病原体，对全球养猪业构成了重大威胁。由于中国尚无针对SVA的许可疫苗，因此迫切需要可靠的诊断工具来控制SVA感染。在本研究中，我们从SVA的VP1、VP2和VP3蛋白中筛选出了十二个免疫优势肽。随后，利用在大肠杆菌中表达的多肽融合蛋白VP123开发了一种间接ELISA（iELISA）用于检测SVA抗体。该检测方法与其他常见猪病毒的血清抗体无交叉反应，并表现出显著的可重复性和稳定性。ROC分析显示其AUC值分别为0.955（与IFA相比）和0.973（与VNT相比），与VNT的相关性很强（Spearman's R = 0.6998）。当使用iELISA在中国山西省的大规模养猪场检测SVA血清流行率时，结果显示SVA在养猪场中广泛存在，阳性率为81.95%。总之，这种新型iELISA具有很强的稳定性、特异性和敏感性，作为SVA感染的诊断工具以及监测接种SVA疫苗的猪的抗体反应具有巨大潜力。

引言

Senecavirus A（SVA）是一种属于Picornaviridae科Senecavirus属的无包膜病毒，最初在PER.C6细胞培养物中被发现为污染物[1]、[2]、[3]。该病毒基因组由一条长约7.3 kb的单链正链RNA分子组成[1]、[3]。该基因组编码一种多聚蛋白，经过蛋白水解后产生四种结构蛋白（VP1、VP3、VP2和VP4）和八种非结构蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）[2]、[4]、[5]、[6]。其中，结构蛋白共同构成病毒衣壳：VP1、VP2和VP3位于病毒颗粒表面，而VP4位于衣壳内部[2]、[3]、[7]、[8]、[9]。值得注意的是，VP1、VP2和VP3是主要的保护性抗原，能刺激中和抗体的产生，因此经常被用于开发诊断试剂和疫苗[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。

临床上，猪的SVA感染表现为鼻部、口腔黏膜和冠状带出现水泡，常伴有跛行、发热和新生儿死亡[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。因此，这些症状与其他水泡性疾病（如口蹄疫（FMD）、猪水泡病（SVD）和 vesicular stomatitis（VS）[3]、[21]）难以区分。迄今为止，SVA已成为中国的重要病原体，自2015年在广东省首次发现以来，已有超过50%的省份报告了SVA感染病例[4]、[22]、[23]。最近，Yan等人指出，2014年至2022年间山西省的总体血清流行率约为100%[22]。然而，该研究的方法学局限性（样本量有限n = 29）凸显了进行全面流行病学调查的必要性。

目前，中国尚未开发出针对SVA的商业疫苗，这意味着猪体内的SVA抗体水平可以直接反映病毒的感染状况[22]、[24]。病毒中和试验（VNT）被广泛认为是检测血清中中和抗体的金标准，并已被证明对于识别SVA感染猪的抗体具有敏感性和特异性[25]。然而，其操作复杂且耗时，限制了大规模监测的可扩展性[26]。相比之下，间接ELISA（iELISA）是一种简单、快速且方便的方法[11]、[22]。先前的研究已经证明了结构蛋白的诊断潜力：基于VP2的检测方法达到了94.2%的敏感性和89.7%的特异性，而针对VP1的检测平台达到了93%的敏感性和99%的特异性[11]、[12]。鉴于感染后免疫保护反应主要针对VP1、VP2和VP3，并且之前的研究在这些结构蛋白中发现了更多的B细胞表位[13]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]，因此提出了是否可以使用VP1、VP2和VP3的表位来建立iELISA的问题。目前，这方面尚未有相关报道。

在此，我们介绍了一种基于多肽融合蛋白的新型iELISA的开发和验证方法，用于SVA的血清学诊断。通过生物信息学指导的VP1、VP2和VP3表位定位，我们筛选出了十二个免疫优势肽，并构建了一种多肽融合蛋白VP123作为iELISA的包被抗原。随后，该iELISA被用于2023年山西省的首次大规模SVA血清流行病学调查，结果显示血清阳性率为81.95%。我们的发现不仅提高了SVA的诊断能力，还为了解区域感染模式提供了关键见解，为未来疫苗效果监测奠定了基础。

章节片段

病毒、细胞和血清样本

SVA菌株SX2020（GenBank登录号OR703632.1）于2020年从中国山西省的SVA感染养猪场分离获得。BHK-21和PK15细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；Gibco，美国）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，美国）中培养。共六份SVA阳性的猪血清由河南农业大学兽医学院的韩世忠博士提供。SVA阴性的猪血清来自临床猪只

VP1、VP2和VP3蛋白的抗原肽筛选

利用BepiPred-2.0和DNASTAR Protean分析（图1A和B），从VP1、VP2和VP3蛋白中筛选出了十二个候选肽，所有肽都显示出较高的抗原性得分（表1）。此外，通过PyMOL进行的结构建模确认所有选定的肽都位于VP1、VP2和VP3蛋白的表面（图1C）。值得注意的是，其中一些选定的肽包含了之前研究中已知的线性B细胞表位（表1）。总体而言，这些发现

讨论

SVA已成为与水泡病相关的重要病原体，给全球养猪业带来了巨大的经济损失[4]、[36]、[37]、[38]。SVA感染的临床表现与其他水泡性疾病无法区分，给鉴别诊断带来了挑战[3]、[21]。在这里，我们开发了一种新型iELISA来检测针对SVA的抗体。我们的主要发现总结如下：（i）通过生物信息学分析，我们

CRediT作者贡献声明

陈欣欣：撰写——原始草稿、方法学、研究。林一婷：方法学、研究。岳毅：监督、研究。马梦瑶：监督、研究。宋若琪：监督、研究。王颖：资源提供。牛胜：资源提供。颜芳：资源提供。高小龙：资源提供。赵云军：资源提供。田文霞：方法学、概念化。任建乐：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了山西省重点研发计划（项目编号：202502140602076）、山西省科技创新团队专项基金（项目编号：202204051001022）以及国家自然科学基金（项目编号：32202786）的支持。此外，我们衷心感谢河南农业大学兽医学院的韩世忠博士对本研究的帮助。