《International Journal of Biological Macromolecules》：Characterization of Trachinotus blochii mstnb gene and construction of cognate gRNA vector
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哈里尼·古纳塞卡兰（Harini Gunasekaran）、K.V. 纳杰瓦（K.V. Najwa）、N.C. 尼达尔尚（N.C. Nidarshan）、穆鲁格桑·波尔科迪（Murugesan Porkodi）、卢克拉姆·苏希尔·辛格（Lukram Sushil Singh）、基
哈里尼·古纳塞卡兰（Harini Gunasekaran）、K.V. 纳杰瓦（K.V. Najwa）、N.C. 尼达尔尚（N.C. Nidarshan）、穆鲁格桑·波尔科迪（Murugesan Porkodi）、卢克拉姆·苏希尔·辛格（Lukram Sushil Singh）、基兰·D·拉萨尔（Kiran D. Rasal）、马诺杰·P·布拉马内（Manoj P. Brahmane）、穆昆达·戈斯瓦米（Mukunda Goswami）、阿尔文德·A·松瓦内（Arvind A. Sonwane）印度孟买ICAR-中央渔业教育研究所鱼类遗传学与生物技术部门，邮编400061
摘要
在鱼类中，myostatin b（mstnb）基因对骨骼肌的发育具有负调控作用。通过CRISPR-Cas9技术敲除mstnb基因，可以培育出肌肉质量增加的鱼类品系。Trachinotus blochii（银 Pompano）是一种高价值、中等体型（约500克）且可养殖的海水鱼类，是使用CRISPR/Cas9技术进行mstnb基因敲除的理想候选物种。然而，关于T. blochii的mstnb基因特征的研究有限，且目前尚未有基于CRISPR的敲除研究报道。本研究旨在部分表征T. blochii的mstnb基因，并开发用于其敲除的CRISPR/Cas9引导RNA（gRNA）表达载体。利用NCBI中提供的T. blochii mstnb基因序列设计了特异性引物，用于PCR扩增和测序。测序结果显示该基因包含三个外显子和两个内含子。预测的1131 bp开放阅读框编码一个由376个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质含有TGF-β家族典型的保守结构域，包括N端信号肽、前肽区、保守的RARR切割基序以及C端的GF结构域，后者包含九个保守的半胱氨酸残基。二级结构和三维结构预测证实了该蛋白质的功能完整性。序列分析还发现了新的潜在多态性，包括SNP和（CA)n微卫星。系统发育分析表明T. blochii与相关的Trachinotus属及其他鲀形目物种具有亲缘关系。利用CRISPOR设计了一种针对外显子1的gRNA，并成功将其克隆到表达载体中。这些新的序列信息有助于群体水平的研究和遗传标记的发现。构建的gRNA载体可促进T. blochii中mstnb的CRISPR/Cas9敲除，从而研究基因功能并培育出肉质更佳的品系。
引言
肌抑素（mstn），也称为生长分化因子-8（GDF-8），属于转化生长因子-β（TGF-β）家族[1]，最初由McPherron等人于1997年在小鼠中发现[2]。这种蛋白质是一种分子量为25 kDa的同二聚体，能够抑制骨骼肌的生长[2]。mstn基因的自然突变与比利时蓝牛和皮埃蒙特牛等品种的双肌肉表型相关[2]。这些突变也会导致小鼠、绵羊、狗、人类及其他牛品种[3],[4],[5],[6],[7]以及实验鱼类[8],[9]出现肌肉过度增生的表型。在斑马鱼中，mstn基因的敲低仅导致肥大，而在斑马鱼和青鳉中过表达显性负形式仅引起增生[8]。尽管mstn基因编辑在模式物种中得到了广泛研究，但其在水产养殖重要物种中的应用仍然有限[10]，这表明其在改善生长性状方面具有巨大潜力。
肌抑素基因在所有脊椎动物中都表现出强烈的序列保守性。该蛋白质序列包含分泌信号、蛋白酶切割位点以及一个具有九个保守半胱氨酸残基的羧基末端区域，这些特征是所有TGF超家族成员共有的[11]。mstn基因编码的前体蛋白经过蛋白酶切割后形成活性成熟的mstn[12]。在斑马鱼、大西洋鲑鱼、欧洲海鲈鱼、杂交比目鱼和智利比目鱼等鱼类中，C末端结构域与哺乳动物的mstn有超过88%的相似性[13]。尽管mstn基因在脊椎动物中具有保守性，但其表达模式和启动子元件表明其在鱼类中的功能可能比在哺乳动物中更为复杂[14],[15]。虽然已在多种鱼类中报道了cDNA序列[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22]，但对其完整基因特征的研究仍较为有限。这些信息对于培育mstn突变鱼类品系以及通过研究不同环境条件下myostatin的表达来改进渔业技术至关重要。除了基因特征分析外，探索单核苷酸多态性（SNP）和微卫星等遗传变异也有助于了解它们与经济重要性状的关联。例如，在虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）中，SNP g.1904C > A与体长和体重显著相关[23]，这突显了遗传变异研究在性状改良中的潜力。
基因组编辑技术加速了水产养殖中的性状改良[24]。最初，基因组编辑依赖于锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）等技术。由于这些技术的靶点特异性依赖于DNA结合结构域，每个新靶点都需要重新设计这些结构域[25]，使得过程复杂且耗时。相比之下，成簇规律间隔回文重复序列（CRISPR）/Cas系统提供了一个简单、高效且经济可行的精准基因组编辑平台[25],[26]，便于轻松定制和靶向操作鱼类中的基因（如mstn）。在商业上重要的水产养殖物种中，银 Pompano（Trachinotus blochii）在国内外市场上需求旺盛，年销售额可达2000万磅[27]。其耐热能力（CTmax为41.1 ± 0.0478°C，CTmin为12.0 ± 0.0748°C）使其成为亚热带地区气候智能型海洋养殖的理想选择[28]。但由于捕捞渔业供应有限，需要通过水产养殖来满足市场需求。ICAR-中央海洋渔业研究所（ICAR-CMFRI）已在包括台湾和印度在内的多个亚太国家成功建立了该物种的养殖技术[29]。在养殖条件下，T. blochii可在六个月内长到约500克的上市规格[30]。然而，进一步提高其生长性能和肉质产量仍然是可行的目标。Dharmawati等人（2023年）[30]已开展了针对生长和抗病性状的定向选择研究。在这种情况下，利用CRISPR介导的mstn基因敲除是一种有前景的策略，可以培育出肌肉质量更高、收获体重更大的品系，从而支持在变化环境条件下的可持续水产养殖。
硬骨鱼类通常拥有多个相同基因的拷贝[14]，这是由于在辐鳍鱼类和软骨鱼类分化之前发生的一次古老基因组复制事件[31]。这次复制产生了两个mstn基因分支，分别命名为mstn-1和mstn-2[32]。组织表达分析显示，mstnb（肌抑素I）基因在多种组织中广泛表达，包括肌肉、大脑、眼睛、肾脏、睾丸、卵巢、消化道和心脏，而mstna（肌抑素II）基因的表达较为有限，主要局限于大脑[22],[33]。因此，mstnb的广泛表达使其在研究中更为重要。本研究旨在部分表征Trachinotus blochii的mstnb基因，并构建用于CRISPR/Cas9介导的mstn基因敲除的引导RNA表达载体。
节片段
伦理声明
本研究采用的实验方案符合鱼类使用的伦理准则，并获得了印度孟买ICAR-中央渔业教育研究所鱼类遗传学与生物技术部门研究委员会的批准（参见FBT-MB3–02）。
样本采集与DNA分离
样本来自ICAR-CMFRI曼达帕姆地区中心的银 Pompano（Trachinotus blochii）幼鱼。样本保存在绝对乙醇中以保持DNA的完整性。
Trachinotus blochii mstnb基因的分子特征
PCR检测结果显示，外显子1、2和3的扩增产物长度分别为540 bp、475 bp和572 bp；内含子1和内含子2的扩增产物长度分别为约857 bp和1063 bp。测序得到的mstnb基因全长2580个碱基对（GenBank登录号PX101741-PX101742），包含三个外显子（长度分别为379 bp、371 bp和381 bp），以及两个内含子（长度分别为419 bp和913 bp）。开放阅读框...
讨论
Trachinotus blochii因其快速生长速度、优良的肉质和不断增长的市场需求而被认为是一种有前景的水产养殖物种[29]。它能够适应低盐度和宽温度范围，进一步支持其在气候适应性强的水产养殖系统中的应用[28],[38]。与此相关的研究，如mstn基因的研究，可以提高其养殖生产力。哺乳动物只有一个mstn基因拷贝[2]。相比之下...
CRediT作者贡献声明
哈里尼·古纳塞卡兰（Harini Gunasekaran）：负责撰写初稿、验证、软件开发和实验设计。K.V. 纳杰瓦（K.V. Najwa）：负责审阅和编辑、实验设计。N.C. 尼达尔尚（N.C. Nidarshan）：负责撰写、审阅和编辑、验证、方法学设计和实验设计。穆鲁格桑·波尔科迪（Murugesan Porkodi）：负责撰写、审阅和编辑、方法学设计和实验设计。卢克拉姆·苏希尔·辛格（Lukram Sushil Singh）：负责撰写初稿和实验设计。基兰·D·拉萨尔（Kiran D. Rasal）：负责审阅和编辑、软件开发和资源提供。马诺杰·P·布拉马内（Manoj P. Brahmane）：负责撰写、审阅和编辑、软件开发...
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本论文期间，作者使用了[ChatGPT]来确保英语语法的正确性。使用该工具/服务后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对发表文章的内容承担全部责任。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢ICAR-中央渔业教育研究所所长提供的必要支持。
