基于链位移级联扩增技术的高度灵敏且稳健的人类端粒酶检测方法

《ACS Measurement Science Au》：Highly Sensitive and Robust Detection of Human Telomerase Based on Strand-Displacement Cascade Amplification

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端粒酶是早期筛查癌症的经过充分验证的诊断靶点。为了解决现有检测方法的局限性，我们在此提出了一种新策略，该策略基于链置换级联放大和三维DNA纳米结构辅助信号固定的精细集成。改性的磁性纳米复合材料和电极提供了合适的反应界面，从而简化了纯化过程。所开发的电化学方法不仅具有良好的灵敏度、选择性和稳定性，而且在端粒酶抑制剂筛选和肿瘤细胞鉴别方面也表现出极大的实用性。此外，使用人类尿液样本进行的验证证实了该方法与临床诊断结论的一致性。因此，这种方法作为端粒酶相关应用的即时检测工具具有显著潜力。

**引言**
端粒酶是一种具有逆转录酶活性的独特核糖核蛋白复合物，它可以在引物和dNTP作为原料的情况下催化端粒重复核苷酸序列（TTAGGG）的延伸。(1,2) 它在维持端粒的完整性和稳定性方面起着关键作用。(3) 在干细胞和前体细胞中，端粒酶被激活以保持端粒长度并维持细胞干性。在大多数正常体细胞中，端粒酶活性几乎无法检测到。然而，在大多数癌细胞中，端粒酶过度表达以支持无限增殖。(4) 因此，端粒酶不仅被视为癌症诊断的生物标志物(5)，也是癌症治疗的目标。(6) 目前，有多种端粒酶检测方法，每种方法都有其独特的优势和局限性。端粒重复序列扩增协议（TRAP）及其改良版本是金标准。(7) 然而，该协议是半定量的，难以提供准确的定量结果。其他传统的检测相对基因表达或蛋白质水平的技术包括逆转录定量PCR（RT-qPCR）、Western blotting、定量荧光原位杂交（Q-FISH）等。(8,9) 这些方法受到间接检测、操作复杂或灵敏度低的限制。此外，还开发了多种生物传感方法，利用表面增强拉曼光谱（SERS）、(10) 荧光、(11) 和质谱细胞术等技术。(12) 例如，Xu等人制备了DNA驱动的纳米粒子自组装金字塔，基于原位拉曼光谱对细胞内端粒酶进行分析。(13) He等人通过基于FRET的端粒酶水平比率分析实现了癌细胞鉴别。(14) 尽管如此，仍迫切需要标准化程序的方法。

**电分析技术**
电分析技术将目标信息转化为电信号或电化学信号，这些信号广泛应用于生物分析和环境监测领域。(15?17) 高灵敏度、简单的仪器设备、成本效益高的试剂以及便携性等优点使得端粒酶分析变得非常吸引人。(18?20) 为了进一步提高准确性和灵敏度，可以整合不同的信号放大策略。例如，Jia等人合成了铂纳米粒子/大孔碳复合材料作为电化学探针，并利用催化的发夹组装来放大端粒酶的检测。(21) Liu等人设计了链霉亲和素-生物素-DNA-生物素网络的原位形成，以增强端粒酶催化的延伸反应的信号。(22) 扶手介导的链置换放大（TMSDA）是另一种强大的等温核酸放大技术，它利用互补碱基配对和链置换来放大目标信息。通常，关键元素是设计一个附加在双链DNA底物上的把手结构。该过程包括把手结合、分支迁移和放大循环。TMSDA不引入额外的酶，因此具有出色的稳定性和易于模块化设计的优点。在这项研究中，我们将端粒酶催化的延伸/置换与TMSDA相结合。级联放大反应产生大量的单链探针，这些探针通过可控的三链纳米结构固定在电极上。整个过程效率很高，能够准确量化端粒酶活性，这一点已通过临床样本得到验证。

**结果与讨论**
**纳米复合材料的确认**
磁性Fe3O4纳米颗粒（MNPs）被用作TMSDA的界面，同时也便于分离。(23,24) 所有的DNA探针都在表S1中列出。首先分别用P1和P3修饰MNP1和MNP2。之后，P2探针可以通过杂交固定在MNP1表面，而P4和P5以相同的方式固定在MNP2表面（图S1a）。扫描电子显微镜（SEM）图像证实了磁性纳米材料的成功合成。其直径约为200纳米，球形结构清晰可见（图S1b）。加载DNA链后，MNPs在260纳米处显示出额外的吸收峰，表明DNA链的修饰成功（图S1c）。

**端粒酶触发TMSDA的原理**
所提出的电化学方法的工作原理如图1a所示。引物可以连接到MNP1界面处的P1/P2双链上。在端粒酶存在的情况下，该双链被延伸，产生的链依次置换两个P2探针。释放的P2作为后续TMSDA的触发剂。简而言之，由P3/P4/P5形成的双链包含一个把手结构，该结构识别P2，逐渐的置换反应释放P4，从而创建一个新的把手结构。进一步引入的P6链与这个区域杂交，同时释放P2和P5。自由的P2可以在MNP2表面循环利用，生成更多的自由P5链。通过磁分离，上清液中的多个P5链可以被纯化。上游和下游的链置换反应首先通过NUPACK预测（图S2–S4）。形成的产物也在聚丙烯酰胺凝胶电泳图像中得到了验证（图1b）。另一方面，形成了三维四面体DNA（TDNA）（图1c），它被固定在金电极表面。TDNA能够在中性pH条件下通过三链形成寡核苷酸（TFO）组装捕获P5。P5的5′端标记有亚甲蓝（MB），从而产生强烈的电化学响应，这与初始端粒酶活性直接相关。

**制备的电化学界面的表征**
通过循环伏安法（CV）、电化学阻抗谱（EIS）和方波伏安法（SWV）分别表征了不同修饰步骤下金电极的电化学特性。如图2a所示，裸金电极观察到一对明确的电流峰，表明基底电极具有良好的导电性。在TDNA固定后，带负电的DNA支架排斥电化学物种[Fe(CN)6]3–/4–，因此峰电流显著降低。同时，氧化峰和还原峰之间的差异增大。进一步加载的TFO链（P5）使界面更加负电荷，排斥效应增强，这通过进一步降低的CV峰得到证实（图2b）。Nyquist图中的变化与CV结果一致（图2c）。在TDNA和P5的逐步修饰过程中，半圆结构的直径变大，表明电荷转移电阻（Rct）增加。详细数值列在图2d中。P5末端的修饰MB导致在?0.3 V处出现显著的SWV峰，很好地揭示了组装过程（图2e）。P5的附着和脱离可以通过MB信号监测。如图2f所示，未经MB修饰的TDNA电极在?0.3 V处仅显示有限的初始电流。在中性pH条件下孵育P5后，峰强度显著增加。调整pH后，TFO链可以解离，峰电流恢复到初始状态。经过额外的三次pH调整和P5孵育后，记录到稳定的高和低峰强度，表明具有良好的再生能力。

**分析性能**
SWV技术用于端粒酶活性的定量分析。为了获得最佳的分析性能，优化了一些关键实验参数，包括0.75 μM的TDNA用于电极修饰，0.6 μM的P6和90分钟的链置换反应时间（图S5）。在这些条件下，反映了一系列端粒酶浓度的SWV曲线被叠加。如图3a所示，随着端粒酶活性的增加，SWV峰变大，这是预期的结果。图3b描绘了端粒酶浓度与峰电流变化（ΔIp）之间的详细关系。从10到10000个细胞建立了线性范围（图3c）。检测限（LOD）估计为1个细胞/mL，优于大多数现有检测方法（表S2）。

**端粒酶抑制剂的潜在应用**
端粒酶抑制剂可用于潜在的治疗应用。为了检验该方法筛选端粒酶抑制剂的能力，我们引入了N,N′-1,3-苯并[2,3-二羟基苯胺]（MST-312）作为模型。准备了一系列标准浓度的MST-312溶液来干扰端粒酶催化的反应。根据测量的SWV峰电流强度，计算了端粒酶的相对活性。如图3d所示，随着MST-312浓度的增加，端粒酶的相对活性降低。MST-312的IC50估计为0.68 μM，与先前的报告一致。结果表明，电化学方法适用于筛选端粒酶抑制剂。为了检验抗干扰能力，引入了几种常见蛋白质，包括牛血清白蛋白（BSA）、胰蛋白酶、溶菌酶和单链DNA结合蛋白（SSB）。这些潜在的干扰蛋白都不能触发延伸反应和随后的链置换反应，这一点通过几乎不变的峰强度得到证明（图3e）。热处理后，端粒酶可以被失活。我们还比较了从不同细胞系中提取的端粒酶活性。如图3f所示，热处理的HeLa细胞与对照组相当，而未经处理的HeLa细胞会产生较高的ΔIp值。此外，从L02、MCF-7和HepG2细胞中提取的端粒酶表现出不同的电化学响应，这反映了不同的表达水平。因此，这种电化学方法可用于分析多种细胞系。

**人类样本分析**
我们进一步研究了这种电化学方法在识别健康捐赠者和膀胱癌（BC）患者收集的尿液样本方面的有效性（图4a）。之前共收集了24个样本，其中12个被诊断为BC。预处理后，两组样本进行了电化学检测。健康捐赠者和BC患者的ΔIp值分别显示在图4b和c中。健康个体的电化学变化与BC患者的相比，强度显著较低（图4d）。接收者操作特征（ROC）曲线分析进一步用于定量评估临床样本中的分析性能（图4e）。令人印象深刻的AUC值为0.986，表明其在诊断乳腺癌（BC）方面具有出色的敏感性和特异性。图4：(a) 从临床尿液样本中提取端粒酶、链置换扩增和电化学检测过程的示意图；(b) 12名健康个体的端粒酶电化学响应的热图；(c) 12名乳腺癌患者的端粒酶电化学响应的热图；(d) 两组真实样本的SWV响应箱线图；(e) 24个临床样本电化学检测方法的ROC曲线分析。统计分析使用Student’s t检验进行，统计显著性定义为****p < 0.0001。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片。

实验部分：材料与仪器
氯化铁、柠檬酸钠二水合物、尿素、戊二醛、聚丙烯酰胺、CHAPS、BSA、胰蛋白酶、溶菌酶、SSB、苯甲基磺酰氟（PMSF）、MST-312和三(2-羧基乙基)膦盐酸盐（TCEP）均从Sigma（美国）订购。其他试剂为分析级，无需进一步处理。HeLa、L02、MCF-7和HepG2细胞系来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（上海，中国）。人类尿液样本来自苏州新区人民医院。所有寡核苷酸均购自Sangon Biotech（上海，中国）。序列和修饰信息列于表S1中。双蒸水通过Millipore系统纯化。SEM图像使用Hitachi S4800扫描电子显微镜（日本）拍摄。UV–vis吸收光谱使用Thermo Scientific NanoDrop OneC分光光度计（美国）测量。凝胶电泳图像使用GelDoc XR+成像系统（Bio-Rad，美国）拍摄。

DNA修饰磁性纳米粒子的制备
首先通过水热法制备纯Fe3O4纳米粒子。(25) 通常，准备含有氯化铁（0.5 g）、柠檬酸钠二水合物（1.5 g）和尿素（0.5 g）的40 mL溶液。然后缓慢向上述混合物中加入聚丙烯酰胺溶液（40 mL中的0.5 g），并剧烈搅拌。将混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的高压釜中，加热至200 °C并保持12小时。接着，使用磁铁分离得到的Fe3O4纳米粒子，再用无水蒸馏水和乙醇洗涤。随后，将1 mg的Fe3O4纳米粒子和200 μL浓度为2.5%的戊二醛溶液加入300 μL pH = 7.4的PBS中。(26) 孵育4小时后，使用磁铁分离戊二醛活化的纳米粒子并洗涤三次。然后将重新分散的纳米粒子加入200 μL链霉亲和素溶液（12 μg/mL）中。混合物进行30分钟的超声处理，之后摇匀并在4 °C下孵育9小时。将磁性纯化的纳米粒子与生物素修饰的DNA链（5 μM）混合1小时以实现结合。简而言之，MNP1用P1和P2修饰，而MNP2用P3/P4/P5双链修饰。

TDNA修饰电极的制备
T1、T2、T3和T4的DNA链溶解在含有100 mM NaCl（pH = 7.5）的PBS缓冲液中。四种链的最终浓度均为0.75 μM。混合物加热至95 °C，然后缓慢冷却至室温以组装TDNA。首先将金电极与piranha溶液（98% H2SO4:30% H2O2 = 3:1）孵育10分钟。之后，用1.0、0.3和0.05 μm大小的氧化铝浆料抛光，然后在乙醇和超纯水中依次进行10分钟的超声处理。电极在0.5 M H2SO4中通过CV扫描进行20次电化学活化。彻底冲洗后，将TDNA涂覆在金电极表面8小时。

端粒酶催化的链置换反应
所有细胞均在含有10% FBS的DMEM中培养。细胞经胰蛋白酶辅助分离后收集，用含有1 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.1 mM PMSF、0.5% CHAPS（w/v）和10%甘油（v/v）的10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）洗涤并重新悬浮。溶液置于冰上30分钟，然后多次吸取。接下来，在4 °C下以12000 rpm离心30分钟。上清液中的端粒酶可以用延伸溶液（20 mM Tris-HCl、1 mM EGTA、63 mM KCl、1.5 mM MgCl2、10 mM dNTPs、0.05% Tween 20，pH 8.3）稀释。这些稀释后的溶液与引物（1 μM）、MNP1（0.1 mg/mL）和MNP2（0.5 mg/mL）在37 °C下混合90分钟。随后，通过磁分离去除这些纳米材料。TDNA修饰电极与上清液孵育60分钟。

电化学测量
EIS、CV和SWV实验使用CHI 660D电化学工作站（CH Instruments，中国）进行。该系统由参比电极、对电极和TDNA修饰的工作电极组成。EIS和CV的电解质为含有1 M KNO3的5 mM [Fe(CN)6]3–/4–。参数包括0.208 V的偏置电位、5 mV的振幅、0.1–100,000 Hz的频率范围和100 mV/s的CV扫描速率。SWV的电解质为含有100 mm NaCl和50 mM MgCl2（pH 7.5）的20 mm Tris-HCl缓冲液。参数包括50 mV/s的扫描速率和4 mV的阶跃电位。

电极传感界面的再生
端粒酶的电化学检测后，将金电极置于碱性环境中以去除先前附着在TDNA支架上的P5链。通常，首先用纯水冲洗电极，然后将其浸入500 μL Tris-HCl（10 mM、100 mM NaCl、50 mM MgCl2，pH 10）中，在37 °C下孵育60分钟。之后，在进行其他测试前再次用纯水冲洗电极。

结论
总之，我们精心设计了两种独立MNPs上的端粒酶引发的链置换反应。产生的单链DNA可以通过TFO组装捕获在电极上的TDNA边缘。这种电化学生物传感器不仅由于级联放大而表现出优异的敏感性，而且还能实现满意的电极再生，适用于后续测试。实验结果表明其具有良好的稳定性、特异性和重复性。此外，所提出的方法不仅可以筛选潜在的端粒酶抑制剂，还可以区分来自不同细胞的端粒酶表达水平。在识别乳腺癌患者样本方面的性能非常令人满意，证明了其在临床应用中的巨大潜力。