用于多重暗光发光核酸诊断的多色生物发光工具箱

《ACS Sensors》：Multicolor Bioluminescent Toolbox for Multiplex Glow-in-the-Dark Nucleic Acid Diagnostics

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结合生物发光传感器和等温扩增技术可以实现快速简便的核酸诊断，具有巨大的潜力，适用于即时检测应用。我们之前开发了 LUNAS（发光核酸传感器）平台，该平台将重组酶聚合酶扩增（RPA）与基于 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) dCas9 的生物发光读数技术相结合。在这里，我们通过开发绿色和红色发光的 LUNAS 变体，将其扩展为一个多重检测平台。这些彩色变体可以与双链 RPA 结合，在单次反应中同时扩增和检测两个 DNA 目标，而不会影响灵敏度或反应速度。利用这种方法，我们开发了一种用于检测性传播感染（如淋病和衣原体）的双重检测方法，具有原子摩尔级的灵敏度和稳健的比率读数能力。使用简单的数码相机，多色 LUNAS 可以在约 100 个拷贝/μL 的低浓度下检测临床样本中的细菌 DNA，并在约 30 分钟内完成检测，证明了其在资源有限环境中的诊断性能。

特别专题
作为 ACS Sensors 特刊“CRISPR 在传感中的应用”的一部分发表。

核酸能够指数级扩增并特异性检测其序列，这使它们成为诊断传染病的理想分析对象。定量 PCR (qPCR) 是实验室中检测病原体 DNA/RNA 的首选分子诊断方法，但由于需要先进的设备和操作人员，不适合在野外使用。近年来，已经开发出多种更适合即时检测的核酸检测方法，这些方法通常基于等温核酸扩增技术（iNAATs），如环介导的扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）。(1?5) 与 qPCR 不同，这些 iNAATs 不需要昂贵的热循环设备，并且可以在恒定温度下快速将目标核酸扩增到可检测的水平。已经开发了非特异性和特异性方法来检测扩增产物。(6?10) 其中最突出的子类别是基于 CRISPR 的诊断方法（CRISPR Dx），主要利用 V 型（Cas12）或 VI 型（Cas13）效应核酸酶的旁路切割活性。(11?14) CRISPR Dx 方法的特异性可达到单个碱基对的水平，从而减少了通常限制 iNAAT 特异性的假阳性扩增。(15) 在多种病原体导致相同临床表现的情况下，区分多个核酸序列非常有用，或者可以加入内部阳性对照目标。(16,17) 通过将单个样本分成多个平行检测反应，每个反应针对特定序列进行检测，可以实现多重检测。尽管在检测设计上简单且高度可扩展，但这种空间多重检测方法需要额外的样本处理步骤或复杂的微流控设备来进行样本分配，可能会导致样本耗尽。(18?22) 另一方面，在单次检测反应中实现多重检测需要在分子层面进行区分，每个目标需要不同的报告信号。类似于使用不同荧光团-淬灭剂探针的多重 qPCR，多重 CRISPR Dx 检测方法也使用了不同的荧光团-淬灭剂报告信号进行荧光读数，或者使用侧向流动分析（LFA）设置来区分不同的报告信号。(23,24) 通过将 DNA 切割的 Cas12 与 RNA 切割的 Cas13 结合，或者使用具有正交切割偏好的 Cas13 同源物，可以在单次反应中区分多达 4 个不同的目标核酸。(23) 然而，很少有研究报道在单次反应中同时进行多重 RPA 预扩增和多重 Cas12/Cas13 扩增产物检测，并且大多数情况下灵敏度较低。(25,26) 此外，读数还需要配备具有多个激发和发射滤光片的荧光读取器，这在资源有限的条件下实施起来具有挑战性。虽然基于 LFA 的读数方法无需设备，但由于扩增后的反应物转移到 LFA 试纸上可能导致交叉污染，从而产生假阳性结果。

我们最近开发了一种基于 RPA 和 dCas9 介导的分裂 NanoLuc 酶重组的单锅生物发光 CRISPR 诊断方法 LUNAS（图 1A）。(27) 在这种方法中，两种链球菌属的 dCas9 (SpdCas9) 蛋白（一种与主要荧光酶片段 LargeBiT 融合，另一种与互补激活肽 SmallBiT 融合）与针对目标 DNA 中相邻序列的 gRNA 形成复合物，当目标结合时会发生荧光酶重组并产生蓝色生物发光信号。加入绿色校准荧光酶可实现稳健的比率检测，阳性测试时颜色从绿色变为蓝色。与其它 CRISPR Dx 方法相比，LUNAS 的一个关键优势是可以通过简单相机读取生物发光信号，特别适合即时检测应用。然而，原始的 LUNAS 方法不支持光谱多重检测，仅提供蓝色发光传感器复合物。

图 1
图 1. 多色 LUNAS 用于识别两个不同目标的示意图。(A) LUNAS 平台的概述。目标 DNA 通过 RPA 扩增，并使用两种与目标 DNA 中相邻位点结合的分裂荧光酶片段（“LUNAS 蛋白”）进行检测，从而重组出完整的荧光酶，产生蓝光。所有组件在单锅反应中结合，并使用数码相机进行读数，同时还包括一个绿色发光荧光酶用于信号校准。(B) 正交绿色和红色 LUNAS 变体以及红色校准荧光酶的开发。(C) LUNAS 颜色变体可实现多重核酸检测。在单锅反应中，两个目标通过双链 RPA 共同扩增，并使用两种不同的 LUNAS 颜色变体（中间为绿色，右侧为蓝色）进行检测。加入第三个颜色校准荧光酶用于信号校准（左侧为红色）。

在这项工作中，我们报道了开发了正交的绿色和红色 LUNAS 变体，利用生物发光共振能量转移 (BRET) 来改变分裂 NanoLuc 的发光颜色（图 1B）。(28) 我们展示了这两种 LUNAS 变体可以与第三种颜色的校准荧光酶结合，开发出单锅双链 RPA-LUNAS 检测方法，以检测和区分两种常见的性传播感染（STI）病原体——淋病奈瑟菌和沙眼衣原体 DNA（图 1C）。最后，我们使用简单的数码相机展示了这些 STI 在患者样本中的快速灵敏检测，展示了该方法在资源有限环境中的潜力。

结果
绿色 LUNAS 的开发
在原始的 LUNAS 方法中，单锅 RPA-LUNAS 反应混合物中包含一个绿色发光校准荧光酶，以实现稳健的比率检测，校正底物耗尽和样本基质效应。(27) 这种集成校准策略最初是在我们的团队中为生物发光免疫诊断方法 RAPPID 开发的，它使用了由 Suzuki 等人设计的亮绿色荧光蛋白 mNeonGreen (mNG) 与 NanoLuc (NL) 荧光酶的紧密融合。(28,29) mNG-NL 构建物表现出高效的 BRET，导致发光光谱向绿色偏移（λmax ～ 520 nm），与天然的蓝色（分裂）NanoLuc 发光（λmax ～ 460 nm）明显区分。基于这一构建，之前通过将 mNG 末端融合到分裂 NanoLuc 的 SBiT 组件上，成功开发了 RAPPID 传感器的绿色版本，实现了两种不同细胞表面癌标志物的双重检测。(30) 为了开发绿色版本的 LUNAS，我们筛选了多种 mNG 和分裂 NanoLuc 组件的融合体，以实现高效的 BRET，这对于限制双链检测中蓝色和绿色传感器之间的串扰至关重要。荧光蛋白被紧密融合到 SBiT 或 LBiT 的 N 端或 C 端，从而产生了 4 种不同的变体和 8 种潜在的绿色 LUNAS 组合（4 种单 mNG 和 4 种双 mNG LUNAS 组合）。在成功表达所有蛋白质后（图 S1），使用先前开发的 LUNAS 检测合成 SARS-CoV-2 cDNA 目标片段的方法测试了不同组合的传感器功能和 BRET 效率（图 2A）。(27) 所有组合均表现出功能，当存在 500 pM 的目标 DNA 时，绿色发光强度明显增加，绿色/蓝色（533/458 nm）的发射比率从 1.0（dCas9-LBiT-mNG × dCas9-SBiT）到 dCas9-mNG-LBiT 和 dCas9-SBiT-mNG 的组合为 24（图 2A,B 和图 S2）。比较 LBiT 传感器构建物时，发现将 mNeonGreen 融合到荧光酶片段的 N 端端对于所有 SBiT 组合都能实现最高效的 BRET，而对于 SBiT 构建物，最佳性能取决于结合伙伴。最优组合（dCas9-mNG-LBiT × dCas9-SBiT-mNG）在之前开发的单锅 RPA-LUNAS 检测中用于检测合成 SARS-CoV-2 cDNA 目标（图 2C）。加入目标 DNA 后，绿色发光明显增强（图 2D，右侧），类似于使用原始蓝色 LUNAS 时的增强效果（图 2D，左侧），证明绿色 LUNAS 适用于单锅 RPA 反应条件。(27) 尽管绿色 LUNAS 的信号在蓝色通道中的残留发光很小（约 7%），但由于蓝色 LUNAS 信号在绿色通道中的较高泄漏率（约 15%）及其在该检测中的较高峰值信号，蓝色 LUNAS 仍会产生明显的绿色发光。为了校正这种泄漏，我们应用了基于 LUNAS 变体发射光谱的光谱解混校正方法，从次级颜色通道的亮度中减去相应比例的亮度，有效解决了串扰问题（图 2D 和图 S3）。

图 2
图 2. 绿色 LUNAS 的开发。(A) 不同 mNeonGreen LUNAS 融合体的示意图和绿色与蓝色的比率。dCas9-LBiT (L) 和 dCas9-SBiT (S) 与 mNeonGreen (g, N 端和 C 端) 融合，可以组合得到绿色 LUNAS（左侧）。不同组合的绿色与蓝色比率（右侧）。LUNAS 蛋白的使用浓度分别为 1 nM（LB 变体）和 10 nM（SB 变体），并与针对 SARS-CoV-2 ORF1a 目标的 gRNA 结合。目标 cDNA 的最终浓度为 500 pM。条形图表示平均值，圆圈表示单个测量值（n = 3）。(B) 原始蓝色 LUNAS（蓝色）和 dCas9-mNG-LBiT × dCas9-SBiT-mNG（绿色）的发射光谱。测量使用 1 nM LUNAS-LB:gRNA_SC2ORF1a_B 和 10 nM LUNAS-SB:gRNA_SC2ORF1a_A RNP 变体以及 500 pM SARS-CoV-2 cDNA 目标进行。光谱归一化到峰值发射波长。(C) 使用蓝色或绿色 LUNAS 的单锅 RPA-LUNAS 检测的示意图。(D) 使用蓝色 LUNAS 或绿色 LUNAS 的单锅 RPA-LUNAS 检测 SARS-CoV-2 cDNA 的结果。检测使用 1000 个合成目标 DNA 测量，反应条件为 1 nM SpdCas9-LB:gRNA_ORF1a_B、10 nM SpdCas9-SB:gRNA_ORF1a_A 或 1 nM SpdCas9-mNG-LB:gRNA_ORF1a_B 和 10 nM SpdCas9-SB-mNG:gRNA_ORF1a_A，在 20 μL 体积的反应中。显示了单个重复测量的结果（n = 2），并应用了泄漏校正（蓝色 = 蓝色 ? 0.04 × 绿色，绿色 = 绿色 ? 0.15 × 蓝色）和平滑滤波器（7 点中心平均）。

红色校准荧光酶和红色 LUNAS 的开发
为了使用不同的颜色通道区分两个目标并仍然应用内部校准方法，需要使用第三个颜色通道。为了完成三色 LUNAS 工具箱，并允许在双链检测中互换使用不同的 LUNAS 和校准荧光酶组合，我们着手开发了红色发光的 LUNAS 变体和校准荧光酶。开发在可见光谱红色端发光的荧光酶也非常适用于组织和血液等强吸收 600 nm 以下波长的介质的成像和传感应用。(31) 使用 BRET 将 NanoLuc 的蓝光光谱向红色范围偏移是具有挑战性的，因为供体和受体之间的强光谱重叠对于高效的共振能量转移至关重要。已经有关于将橙色/红色荧光蛋白融合或插入到NanoLuc中的报道，但这些融合体的BRET效率有限，导致在蓝光波长范围内仍有相当多的残余发射。(28,31,32) 作为替代方案，不同研究小组也尝试将有机荧光团与NanoLuc结合以生成彩色变体，但在橙色/红色变体的情况下，这些变体的BRET效率也通常较低。(33?35) 值得注意的是，Winssinger的研究小组最近报道了一种红移的NanoLuc变体，其674/450纳米的发射比达到了14.5，但这需要使用一种合成的高亲和力SBiT变体，并且仍然使用与NanoLuc发射波长重叠不理想的荧光团。(36) 因此，我们选择使用具有较大斯托克斯位移的ATTO490LS染料（λex,max ～ 496 nm, λem,max ～ 661 nm），并通过特定的硫醇-马来酰亚胺标记将其连接到NanoLuc的不同位置。由于光物理和/或光化学效应（如内部电荷转移（ICT）和激发态质子转移（ESPT），具有较大斯托克斯位移的有机荧光团和荧光蛋白发出的光子与其最佳激发光在光谱上分离得很好。(37?39) 与常用的红色染料如Cy3和ATTO647N相比，ATTO490LS染料的激发光谱与NanoLuc的发射光谱有更广泛的重叠，这可能使其成为一种良好的红色光BRET受体。

为了有效地筛选NanoLuc中的合适BRET位点，我们首先开发了一种红色校准荧光酶。供体和受体之间的短距离是高效BRET的关键，因此选择了靠近活性位点（T41, G66, S68, G113, G136, G159）的环状区域中的残基进行染料偶联，假设这些残基的突变不会显著影响蛋白质的折叠和催化功能。此外，还包含了位于β桶另一侧环状区域中的D148位点，因为这个位点之前在我们小组中已被成功用于创建基于BRET的NanoLuc-噻唑橙色荧光插层染料结合物（LUMID）。(6) 选定的残基被分别突变为半胱氨酸，而NanoLuc中原本存在的Cys166被突变为丝氨酸（NL_C166S = NL*），已知这种突变不会影响荧光酶的活性。(40) 经过成功的表达和纯化后（NL*_G113C除外，该突变体显示出明显的杂质，见图S4），比较了这些半胱氨酸突变体的发光强度与野生型NanoLuc的发光强度。大多数突变体的发光强度降低了2到3倍，除了D148C突变体，其发光强度保持与野生型相同（见图S5A）。随后通过吸光度测量和质谱确认了蛋白质的标记是（几乎）完全的（见图S6）。所有得到的染料结合物都显示出红色荧光，其红/蓝（653/458 nm）发射比范围从0.6（NL*_D148C-ATTO490LS）到9.1（NL*_T41C-ATTO490LS）。红色（653 nm）的发光强度低于野生型NanoLuc的蓝色发光强度（约为蓝色强度的3?34%，见图3A和图S5B），这可以归因于ATTO490LS的相对较低的荧光量子产率（ηfl = 0.3）。NL*_T41C-ATTO490LS变体被认为是最佳的，因为它具有最高的BRET比和足够的发光强度。为了更好地适应LUNAS传感器中使用的裂解荧光酶的酶动力学特性，(41) 我们基于融合的SBiT和LBiT开发了一种新的红色校准荧光酶版本，使用相同的T41C标记位点（NB_T41C-ATTO490LS），其红/蓝（653/458 nm）比达到了8.9（见图3B和图S7?S9）。

图3. 红色校准荧光酶和红色LUNAS的开发。(A) 左图：NanoLuc结构与azacoelenterazine底物类似物（青色）在桶内催化位点（PDB 8BO9）中的示意图，突变的位点和染料偶联位点被标出。右图：NanoLuc内不同ATTO490LS偶联位置的红色/蓝色比（653/458 nm），以及未偶联的野生型NanoLuc（wt）。条形代表平均值，圆圈代表单个重复实验（n = 3）。(B) 蓝色（NB_T41C）、绿色（mNG-NB）和红色（NB_T41C-ATTO490LS）裂解NanoLuc基校准荧光酶的标准化发射光谱。光谱均归一化到峰值发射波长。PlateReader的最大波长范围为398?653 nm。(C) 左图：dCas9*-LBiT（L）和dCas9*-SBiT（S）中可用于组合成红色LUNAS的染料偶联位置的示意图。右图：不同ATTO490LS偶联LUNAS蛋白与原始LUNAS蛋白的组合的红色/蓝色比（653/458 nm）。LUNAS反应使用500 pM的目标DNA（合成T7噬菌体片段，间隔50 bp）、10 nM dCas9*-SBiT:gRNA_T7A变体和1 nM dCas9*-LBiT:gRNA_T7B变体进行。条形代表平均值，圆圈代表单个重复实验（n = 3）。(D) 原始蓝色LUNAS（dCas9-SB × dCas9-LB）、绿色LUNAS（dCas9-SB-mNG × dCas9-mNG-LB）和红色LUNAS（dCas9-SB_K-4C-ATTO490LS × dCas9-LB_T41C-ATTO490LS）的标准化发射光谱。LUNAS反应使用500 pM的目标DNA（SARS-CoV-2 ORF1a）、10 nM LUNAS-SBiT:gRNA_SC2ORF1a_A变体和1 nM LUNAS-LBiT:gRNA_SC2ORF1a_B RNA进行。光谱均归一化到峰值发射波长。(E) 使用绿色LUNAS检测人类cDNA序列（HsRPP30）、红色LUNAS检测SARS-CoV-2 cDNA序列（ORF1a）和裂解NanoLuc蓝色校准荧光酶的双链RPA-LUNAS检测的示意图。(F) 用于HsRPP30（左）和SARS-CoV-2 ORF1a（右）目标的一锅双链RPA-LUNAS检测。反应使用1000 cp的合成目标cDNA输入、160 nM的RPP30引物和480 nM的SARS-CoV-2引物，以及2 nM的SpdCas9-mNG-LB:gRNA_RPP30_B、20 nM的SpdCas9-SB-mNG:gRNA_RPP30_A、20 nM的SpdCas9-LB_T41C-ATTO490LS:gRNA_ORF1a_B和2 pM的NB_T41C蓝色校准荧光酶在20 μL的反应中进行。显示了单个重复实验的迹线（n = 2），并对发光读数应用了滚动平均滤波器（7点中心）。

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红色校准荧光酶的设计被用作开发红色LUNAS变体的起点。对于LBiT和SBiT传感器部分，分别有两个残基被突变为半胱氨酸，而两个天然的SpCas9半胱氨酸（C80S, C574S）被突变为丝氨酸（已知这些突变对其功能影响很小）。(42) 对于LBiT传感器部分，测试了校准荧光酶筛选中效率最高的BRET位点（T41和G66）。对于SBiT传感器部分，测试了SBiT的N端（K-4，即连接链中第4个残基的赖氨酸）和C端（K+2，即连接链中第2个残基的赖氨酸）的位点，以避免干扰荧光酶的重组。结果得到的4种成功表达、纯化（见图S10）并标记（ATTO490LS-maleimide，标记程度>0.9）的蛋白质被相互结合或与经典的蓝色LUNAS蛋白质结合，共筛选了8种候选的红色LUNAS组合。观察到的红/蓝（653/458 nm）发射比显示，同时标记dCas9-SBiT和dCas9-LBiT蛋白质有明显的好处，单染料LUNAS组合的红/蓝发射比为1.7?2.9，而双标记组合的比值为8.1?13.2（见图3C和图S11）。接下来，使用BRET效率最高的LUNAS组合dCas9*-LBiT_T41C-ATTO490LS（L41r）与dCas9*-SBiT_K-4C-ATTO490LS（S-4r），称为“红色LUNAS”（见图3D），进行了一锅双链RPA-LUNAS检测。为此，设计了RPA引物和gRNA来检测人类核糖核酸酶P蛋白亚单位p30 mRNA（(Hs)RPP30），这通常用作多重分子诊断测试中的阳性对照目标，以确认样本制备的正确性。(43,44) 这种RPP30检测与之前报道的SARS-CoV-2（ORF1a目标）RPA-LUNAS检测结合使用，编程绿色LUNAS检测RPP30，红色LUNAS检测SARS-CoV-2 ORF1a，并包括一个蓝色校准荧光酶（见图3E）。最初使用等摩尔浓度的RPP30和SARS-CoV-2引物组合时，发现RPP30引物的存在对SARS-CoV-2检测有负面影响（见图S13），这可能表明重组酶更倾向于结合RPP30引物。将RPP30引物的数量减少3倍（SARS-CoV-2:RPP30引物比例=3:1）成功解决了这个问题。使用这种引物比例，在存在RPP30 cDNA的情况下，双链检测的绿色/蓝比显著增加；而当加入SARS-CoV-2 ORF1a cDNA时，红色/蓝比也增加，且当两个目标都存在时，绿色和红色LUNAS都被明显激活（见图3F）。由于绿色和红色LUNAS的信号交叉干扰很小，因此在这种情况下不需要进行解混校正（见图S14）。这些结果表明，多色RPA-LUNAS可以用来包含一个内部对照反应，用于检测宿主特异性核酸序列以及病原体DNA/RNA。筛选各种引物组合以设计这样的双链RPA-LUNAS将有助于实现更平衡的扩增动力学和改善检测性能，但在这个特定检测中并未进行尝试。相反，我们专注于开发一种新的双链LUNAS检测方法，以在单次反应中区分相关的病原体。

作为多色LUNAS的第一个重要应用，我们设计了一种双链RPA-LUNAS检测方法，用于检测细菌N. gonorrhoeae（NG）和C. trachomatis（CT），这两种细菌分别是导致淋病和沙眼衣原体的病原体。尽管这两种病原体可能无症状，但CT和NG感染常常表现出重叠的临床症状，并且可能同时发生，因此需要双链检测来同时检测和区分这两种细菌。(45) 鉴于这些疾病的高发病率及其可能带来的严重并发症、寻求医疗服务的社会污名以及日益增长的抗菌素耐药性，特别是在资源匮乏的环境中，迫切需要经济实惠、快速可靠的即时检测方法。(46,47) 为了可靠地检测这两种细菌，我们选择了在各种亚型中高度保守的基因：NG的uvrC基因和NG的dcmH基因。(45) 为了建立该检测方法，我们首先分别设计和筛选了多个CT和NG的gRNA和互补RPA引物组合，使用无校准荧光酶的单目标蓝色RPA-LUNAS检测（见图S15?S17）。选择标准包括发光强度的增加倍数和反应速度。使用表现最佳的组合，即使目标输入量低至20个拷贝（uvrC, CT）和200个拷贝（dcmH, NG），也能够在20分钟内与无模板对照（NTC）区分开来（见图4B）。对于NG，20个拷贝输入的三个重复实验中有两个显示出发光强度的增加；这是NAATs在低目标浓度下的典型随机检测反应特征。图4B中高目标浓度下15?20分钟后观察到的信号衰减可能是由于底物耗尽所致。在后续包含校准荧光酶的检测中纠正了这种底物耗尽的影响。

图4. CT/NG的多色RPA-LUNAS检测方法的开发。(A) CT（dcmH基因）和NG（uvrC基因）的检测目标基因的示意图。(B) 分别使用蓝色LUNAS作为读数的CT（左）和NG（右）的一锅RPA-LUNAS检测。反应使用20?20,000 cp的合成目标DNA输入，以及10 nM的dCas9-SB:gRNA_CT011/NG008和1 nM的dCas9-LB:gRNA_CT012/NG004在20 μL的反应中进行。(C) 使用绿色LUNAS（NG, dcmH）、蓝色LUNAS（CT, uvrC）和红色校准荧光酶的双链RPA-LUNAS检测的示意图。(D) 使用10?10,000 cp的合成目标DNA输入，以及10 nM的蓝色dCas9-SB:gRNA_CT011、1 nM的蓝色dCas9-LB:gRNA_CT012、20 nM的绿色dCas9-SB:gRNA_NG008和250 pM的红色校准荧光酶进行的一锅多重RPA-LUNAS检测。单个重复实验的迹线（单个n = 3，多重n = 2）显示了结果，并对发光读数应用了滚动平均滤波器（5点中心）。

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接下来，将单独的CT和NG检测合并成一个双链检测，其中蓝色和绿色LUNAS分别针对uvrC（CT）和dcmH（NG），并且使用红色发光荧光酶进行校准（见图4C）。我们根据它们相似的发光强度选择了蓝色和绿色LUNAS（见图S12），尽管也可以使用其他颜色组合。双链检测需要合并两组可能会相互干扰的引物（如SARS-CoV-2/HsRPP30检测中所观察到的）。通过额外的筛选，我们找到了一个最佳的引物组合，该组合能够在全基因组DNA存在的情况下高效扩增目标基因，并避免非特异性结合和扩增（图S18）。为了评估CT/NG双靶RPA-LUNAS的性能，我们使用了逐渐降低浓度的合成目标基因进行检测。该检测方法在20分钟内成功检测到了低至10个目标DNA拷贝（图4D和图S19）。尽管与单靶RPA-LUNAS相比，双靶检测方法增加了反应组分的数量（传感器蛋白、引物），但其灵敏度和反应速度并未受到影响。当同时加入CT和NG目标时，蓝色和绿色荧光均增强，这也证实了两者能够同时被有效扩增和检测到。对于这种检测方法，观察到蓝色和绿色LUNAS信号分别有显著的串扰现象，进入了绿色和蓝色通道。通过应用基于经验确定的校正因子，成功最小化了这种串扰，同时没有明显影响实际激活相应LUNAS的反应中蓝色相对于红色（B/R）和绿色相对于红色（G/R）的比率（图4D和图S20）。我们发现，由于发射光谱的微小差异，最佳校正因子因检测方法而异，因此必须为每种检测方法单独确定。

为了验证RPA-LUNAS多靶检测方法在临床样本上的有效性，我们在一小部分DNA分离物（n = 18）上对其进行了测试，这些样本来自CT阳性、NG阳性和CT/NG双阳性的患者（图5A）。样本包括男性和女性样本，它们具有不同的病原体载量，并且来自不同的样本类型，如尿液和肛门、咽喉及阴道拭子（表S3）。所有样本都与商业qPCR检测和数字滴液PCR（ddPCR）检测同时进行，以确定目标浓度（图S21-S23）。使用荧光板读数器进行读数时，我们在每个20 μL的RPA-LUNAS反应中加入了1 μL的DNA分离物。如果荧光比率（B/R或G/R）在某个时间点t超过了阈值（该阈值由t时刻无模板对照（NTC）的平均荧光比率加上所有样本在t = 5分钟时的标准差的8倍（蓝色LUNAS）或16倍（绿色LUNAS）确定），则认为样本为阳性。报告的LUNAS阈值时间是指测量到的荧光比率超过该阈值的时间点（图5B和图S24）。对于这种CT/NG检测方法，阈值是通过经验确定的，对于其他检测方法可能有所不同，这取决于LUNAS信号的变化和最大响应。

**CT/NG双靶检测方法临床样本验证**
为了验证RPA-LUNAS多靶检测方法在临床样本上的有效性，我们在一小部分DNA分离物（n = 18）上对其进行了测试，这些样本来自CT阳性、NG阳性以及CT/NG双阳性的患者（图5A）。样本包括男性和女性样本，它们具有不同的病原体载量，并且来自不同的样本类型，如尿液和肛门、咽喉及阴道拭子（表S3）。所有样本都与商业qPCR检测和数字滴液PCR（ddPCR）检测同时进行，以确定目标浓度（图S21-S23）。使用荧光板读数器进行读数时，我们在每个20 μL的RPA-LUNAS反应中加入了1 μL的DNA分离物。如果荧光比率（B/R或G/R）在某个时间点t超过了阈值（该阈值由t时刻无模板对照（NTC）的平均荧光比率加上所有样本在t = 5分钟时的标准差的8倍（蓝色LUNAS）或16倍（绿色LUNAS）确定，则认为样本为阳性。报告的LUNAS阈值时间是指测量到的荧光比率超过该阈值的时间点（图5B和图S24）。适合这种CT/NG检测方法的阈值是通过经验确定的，对于其他检测方法可能有所不同，这取决于LUNAS信号的变化和最大响应。

**图5**
**图5. 使用临床样本验证CT/NG检测方法。**
(A) 临床样本组的示意图和样本制备过程。
(B, C) 使用板读数器对CT阳性、NG阳性以及CT/NG双阳性临床样本进行一锅法多靶RPA-LUNAS检测。测试中使用了1 μL的样本输入，其中包括10 nM的蓝色dCas9-SB:gRNA_CT011、1 nM的蓝色dCas9-LB:gRNA_CT012、20 nM的绿色dCas9-SB:gRNA_NG008、2 nM的绿色dCas9-LB:gRNA_NG004以及250 pM的红色校准剂，在一个20 μL的反应中。
(B) 一部分临床样本的蓝色/红色和绿色/红色荧光曲线。虚线表示基于无模板对照（NTC）和所有反应间变异的阈值蓝色/红色和绿色/红色比率（见方法部分）。LUNAS阈值时间是指蓝色/红色或绿色/红色比率首次超过设定阈值的时间点。曲线代表单个重复实验的结果（n = 2），并对荧光读数应用了串扰校正（蓝色 = 蓝色 ? 0.10 × 绿色，绿色 = 绿色 ? 0.20 × 蓝色）和滚动平均滤波器（5点中心）。
(C) 所有测试样本的CT（左）和NG（右）的多靶RPA-LUNAS检测结果概览，每个样本显示一个数据点。数据将LUNAS阈值时间与qPCR阈值循环数（Ct）及相应的目标浓度（基于ddPCR的相关性）进行比较。重复实验用垂直线连接。星号（*）表示CT阳性样本12。
(D) 使用板读数器或数码相机的测试设置，采用光密盒和加热块。
(E) 相机图像处理步骤。
(F-H) 使用数码相机对CT阳性、NG阳性以及CT/NG双阳性临床样本进行一锅法多靶RPA-LUNAS检测，使用数码相机作为读数器。测试中使用了1 μL的样本输入，其中包括10 nM的蓝色dCas9-SB:gRNA_CT011、1 nM的蓝色dCas9-LB:gRNA_CT012、20 nM的绿色dCas9-SB:gRNA_NG008、2 nM的绿色dCas9-LB:gRNA_NG004以及625 pM的红色校准剂，在一个25 μL的反应中。
(F) 使用数码相机拍摄的一部分反应图像，显示了多个时间点的蓝色/绿色/红色强度。同一虚线框内的两个连续孔代表技术重复实验。
(G) 从相机图像中提取的蓝色/红色和绿色/红色比率随时间的变化曲线，应用了串扰校正（蓝色 = 蓝色 ? 0.10 × 绿色，绿色 = 绿色 ? 0.20 × 蓝色）和滚动平均滤波器（5点中心）对颜色强度读数进行校正。
(H) 使用数码相机作为读数器对所有测试样本的CT（左）和NG（右）的多靶RPA-LUNAS检测结果概览。圆圈代表单个数据点，重复实验用垂直线连接。

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使用多色RPA-LUNAS方法，所有CT阳性和CT/NG阳性样本（n = 12）在25分钟内均被检测为阳性，其中20/24个重复实验在15分钟内被检测到（图5D）。同样，所有NG阳性样本（n = 6）也在30分钟内被检测到。大多数CT/NG双阳性样本（n = 6）也被正确地检测为NG阳性。然而，在其中一个目标载量较低的样本中，观察到两个重复实验中有一个的信号超过了阈值。有趣的是，一个CT阳性样本在NG通道中也显示了信号增强（图5D，用*标记）。随后的qPCR检测针对的是与商业qPCR检测不同的基因（TFPP基因），确认了NG DNA的存在（Ct值 = 27.0），表明我们的检测方法正确地将该样本识别为双阳性，而常规qPCR方法则未能做到这一点（图S25）。重要的是，使用多色RPA-LUNAS方法没有出现假阳性结果。最后，为了展示等温扩增和多色生物发光信号的结合如何使该检测方法适用于资源匮乏的环境，我们还使用廉价且简单的设备进行了检测（图5C）。实验设置包括一个3D打印的光密盒，内部有一个小型加热块，顶部安装了一个标准数码相机用于信号记录。一半的样本组（n = 9）在与板读数器实验相似的条件下进行了测试（图5B,D），但使用了1 μL的DNA分离物在25 μL的RPA-LUNAS反应中，并将校准剂浓度增加了2.5倍以便更好地可视化。图像以2分钟的快门时间捕获，并使用自定义脚本进行分析，该脚本可以自动识别孔并计算平均蓝色、绿色和红色像素强度以及相应的蓝色相对于红色和绿色比率（图5E,F和支持信息）。基于相机的设置产生的响应曲线与板读数器的测量结果相似（图5G和图S26），成功地将所有测试样本识别为阳性或阴性（图5H）。与板读数器的结果相比，LUNAS阈值时间略长（CT阳性样本<30分钟，NG阳性样本<55分钟），这可能是由于校准剂浓度增加所致。这些结果表明，多色RPA-LUNAS能够在简化的实验设置中实现CT和NG的高灵敏度双靶检测，适用于即时诊断应用。

**讨论**
本文报道的多色LUNAS平台提供了一个快速且灵敏的多重核酸检测平台，特别适合即时诊断应用。通过将绿色荧光蛋白与一个大的斯托克斯位移红色荧光染料紧密融合，并将其引入接近NanoLuc活性位点的位置，开发出了绿色和红色LUNAS变体以及红色校准剂荧光酶，这些变体与原始的蓝色LUNAS和绿色校准剂荧光酶互补。这些颜色变体显示出高效的BRET效应，BRET比率大于10，因此具有最小的残余蓝色荧光，从而允许在单次反应中实现正交的DNA检测。不同的LUNAS颜色变体和校准剂组合可以与双靶RPA反应结合使用，以同时扩增、检测和区分两个目标。为了展示这一平台，我们开发了一种针对性传播感染（淋病和衣原体）的双靶检测方法，其灵敏度类似于qPCR，并使用简单的实验设置进行了验证，适用于资源匮乏的环境。

开发的三种颜色可以在单次反应中识别两个目标（带有内部信号校准）或三个目标（无需校准）。单次反应的多重检测对于传染病诊断非常有价值，因为它可以一次性区分符合患者临床表现的不同病原体，并允许包含一个内部阳性对照目标，以检查样本采集/处理和检测功能的正确性。然而，光谱多重检测的范围受到可在视觉光谱中区分的正交荧光受体数量的限制。对于需要区分更多目标的应用（例如病原体亚型鉴定），通过微流控技术在多个反应室中分配样本可以实现空间多重检测，这将是更直接的解决方案。当这两种技术结合使用时，光谱多重检测和空间多重检测可以协同作用，为面板多重检测提供有效的解决方案。

其他单次反应多重CRISPR检测方法已经报道过，这些方法使用DNA切割酶Cas12和一个或多个针对RNA的Cas13同源物，利用它们不同的转切割序列偏好来实现多达四个目标的正交荧光检测。（23,25,26）虽然LUNAS和这些Cas12/Cas13方法都受到光谱重叠的影响，但Cas12/Cas13酶还通过Cas12酶对ssRNA的二次切割和非严格的序列偏好表现出交叉反应性，导致额外的串扰，使得信号解释更加困难。（23,24,48）此外，将多重Cas12/Cas13检测与多重RPA集成在一起时，由于涉及许多不同的反应组分（包括用于Cas13酶检测dsDNA扩增子的转录试剂），使得集成变得复杂。（25,49）与LUNAS不同，成功集成的一锅法双靶RPA-Cas12/Cas13检测通常显示出比相应单靶检测更低的灵敏度，限制了它们在如衣原体/淋病双重检测等高灵敏度应用中的使用。（25,26）

红色移位的荧光酶蛋白在生物成像和传感中非常有用，但由于红色荧光受体与天然蓝色和黄色荧光酶的光谱重叠有限，历史上一直难以设计。据我们所知，我们的红色NanoLuc变体通过简单的硫醇-马来酰亚胺标记方法实现了最高的BRET效率，这是由于ATTO490LS染料与NanoLuc之间的高效光谱重叠以及系统性的标记位置筛选。尽管Winssinger等人也报道了一种具有令人印象深刻的BRET效率的红色移位NanoLuc，但这涉及一种分离系统，需要额外添加一种高亲和力的SBiT肽，因此不适合与分离的NanoLuc基传感器结合使用。（36）相比之下，这里开发的红色移位NanoLuc可以作为已建立检测方法中的替代校准剂荧光酶，例如在RAPPID平台中，它与天然NanoLuc的光谱重叠最小，并且与蓝色和绿色荧光传感器兼容。（30）此外，它还可以用于分子成像，例如开发高效的红色生物发光抗体。（50）

简单的LUNAS检测设置使用一个便宜且便携的设备，并通过数码相机进行读数，可以在初级医疗设施中使用，为资源匮乏地区（如撒哈拉以南非洲）的应用提供了可能性。在这些地区，C. trachomatis和N. gonorrhoeae非常普遍，但由于诊断基础设施有限，通常采用综合治疗方法。（46）即时检测可以改善性传播感染的检测可及性，从而防止传播并实现早期和适当的治疗，减少抗生素的滥用以及由此产生的抗菌素耐药性选择压力，特别是对于N. gonorrhoeae。（45,51）为了进一步简化这种即时检测平台的实用性，下一步将集中在样本预处理和反应混合物的冻干上，以延长其保质期。