被低估的“终极灵敏度”：发光技术优势与科研应用简析

在生命科学研究中，检测技术并不只是“把信号测出来”这么简单，它往往直接决定实验的灵敏度、动态范围、重复性和最终结论的可信度。无论是基因表达、蛋白互作、细胞活性分析，还是体内示踪与分子成像，检测方法的选择都至关重要。

在众多检测手段中，发光检测（Luminescence）是一类经常被使用、却并未被充分理解的技术。相比大家更熟悉的吸光度和荧光，发光技术最大的特点在于：它不依赖外部激发光，而是由化学或生物反应直接产生光信号。正因为这一点，发光在背景控制、信噪比和检测下限上往往具有显著优势。对于弱信号、低表达、微量样本和高灵敏分析来说，发光技术常常不是“可选项”，而是更优解。

什么是发光技术？

发光是指物质在非热激发条件下释放能量，并以光子的形式发射出来的现象，也常被称为“冷光”。与荧光不同，发光不需要外加激发光照射样品，而是依赖体系本身的化学反应、酶促反应、电化学反应或放射性激发来产生光。

从实验角度看，这一差异非常关键。荧光检测需要“打光—激发—收集发射光”，因此不可避免地会遇到激发光散射、自发荧光、光漂白和串扰等问题；而发光检测由于没有激发光源，天然具备低背景优势。

为什么越来越多实验室重视发光技术？

背景低，信噪比高

发光最大的优势，就是不需要激发光。这意味着它避免了荧光检测中最常见的背景来源，如样本自发荧光、激发光散射和孔间串扰。组织自发荧光甚至可达到仪器背景的3–50倍1，这意味着在弱信号区间，荧光常常先被“背景统计波动”吞没。对于低信号实验而言，背景越低，越容易把真实差异“拉出来”。

灵敏度高，更适合弱信号检测

发光技术特别适合检测弱启动子、低表达蛋白、早期感染、稀有事件以及低拷贝样本。以生物发光体系为例，NanoLuc 等高活性荧光素酶因亮度高、输出稳定，被广泛用于低表达场景（NanoLuc 的活性约为 Firefly（FLuc）和 Renilla（RLuc）的150倍以上2。实验室常用的Renilla，其发光读出相比GFP的S/N 大约高6 倍（1.33×10⁴ vs 2.16×10³）；Z’ 更高、孔间变异更低3）。采用化学发光底物可将ELISA的灵敏度提升12–29倍，并伴随动态范围增加与达到最大灵敏度所需时间减少4。对于很多“荧光看不清、比色拉不开”的实验，发光往往可以提供更清晰的读出。

动态范围宽，定量能力强

科研中常见的问题不是“有没有信号”，而是能否在从背景到高表达的宽范围内保持良好的线性关系。由于发光背景低，弱信号区更容易分辨，同时高信号区也能保持较好定量，因此更适合跨数量级的线性分析。

更适合高价值样本和关键实验

当样本量非常少、实验材料昂贵，或者实验窗口很短时，检测灵敏度会直接影响成败。发光技术能够在更低细胞数、更少样本量和更早时间点实现检测，因此在药筛、早期信号响应、稀有细胞分析和微量样本研究中价值尤其突出。

发光技术有哪些主要类型？

1. 化学发光

化学发光是指化学反应直接生成激发态分子，随后释放光子。其特点是无需外源光源、背景极低。典型体系包括鲁米诺、吖啶酯等，广泛应用于化学发光免疫分析、Western Blot、ELISA、环境监测和食品安全检测。

2. 生物发光

生物发光通常指荧光素在荧光素酶催化下发生反应并发光，例如萤火虫荧光素酶、Renilla、NanoLuc 等体系。它是生命科学中最常用的发光形式之一，广泛应用于报告基因、双荧光素酶检测、细胞活力分析、信号通路研究和活体成像。

3. 基于发光供体的能量转移检测

如 BRET 和 NanoBRET，这类方法利用发光酶产生的能量传递给受体荧光分子，从而实现对蛋白互作、靶点占领、受体激活和细胞信号转导的检测。由于供体是“发光”而非“受激发荧光”，因此比传统荧光能量转移更适合复杂背景体系。

4. 电化学发光与放射发光

电化学发光通过电极反应产生激发态分子并发光，常用于高灵敏临床免疫检测；放射发光则利用高能粒子激发闪烁体发光，主要用于放射性示踪与成像分析。

发光技术最适合哪些科研场景

1. 报告基因和转录调控研究。启动子活性、增强子功能、转录因子响应等实验，往往需要高灵敏和宽动态范围，发光法尤其适合微弱差异的检测。

2. ATP、细胞活力与毒性分析。在药物筛选和高通量实验中，发光法常作为核心读出方式，因为其灵敏、稳定、易于自动化。

3. 蛋白互作与靶点结合研究。BRET/NanoBRET在GPCR、受体内吞、信号分子招募和靶点占领分析中具有很高价值，尤其适用于活细胞、实时、低背景检测。

4. 高灵敏免疫分析。化学发光已成为临床和科研检测中实现高灵敏度的重要路线，特别适合低丰度标志物检测。

5. 微量样本和稀有事件研究。当样本珍贵、数量少、信号弱时，发光检测的优势会被进一步放大。

几个典型应用例子

BRET

在 BRET 研究中，发光可用于分析受体与 G 蛋白招募、cAMP 变化及受体内吞动力学，从而同时揭示信号输出和膜转运过程。

BRET在该文中被用于3个方向：1、确认目标蛋白对不G蛋白的招募情况。2. cAMP传感器BRET（NlucEpacvv）实时读取ET-3经Gi抑制AC导致的cAMP变化。3. bystander-BRET，用ETB从质膜离开引起的BRET下降来定量受体内吞动力学。值得一提的是，该文使用了Berthold的LB943微孔板读数仪进行BRET信号的采集。

DLR

在双荧光素酶报告实验中，发光可用于验证转录因子是否激活特定启动子，并通过双报告体系校正转染效率，提高结果可靠性。

研究人员使用DLR在烟草瞬时表达体系中先证明AcGATA1只显著激活含GATA位点的proEGY3HY而几乎不激活proEGY3MH，进而显示AcHSFA2-2虽可激活两种启动子但与AcGATA1共表达时仅对proEGY3HY产生更强增强效应，从而支持二者依赖HY启动子变异位点协同促进EGY3转录。该文使用了Berthold的LB960板式发光仪完成检测。

a. AcGATA1 只显著激活 proEGY3HY、几乎不激活 proEGY3MH。 b. AcHSFA2-2 可激活两种启动子。c. AcHSFA2-2 与 AcGATA1 共表达仅对 proEGY3HY 进一步增强

UPE&DF

在植物研究中，超弱光子发射（UPE）和延迟荧光（DF）可用于无标记、非侵入地反映植物氧化胁迫状态。健康组织与受损区域的发光差异，可作为植物逆境响应的敏感成像指标。超弱光子发射又称生物光子发射，是所有活细胞在正常代谢过程中自发辐射出的极微弱光子，强度仅为101–10³个光子·s⁻¹·cm⁻²。

研究人员分别使用1片健康和1片已经出现褐变的欧洲鹅耳枥叶片作为实验材料，检测其DF&UPE。结果如图。

A）健康叶片（右）和褐色叶片（左）的DF发射。图像是用60 s曝光时间和2x2像素合并获得的。B）健康叶片（右）和褐色叶片（左）的UPE。图像是用10 min曝光时间和8x8像素合并获得的。C）用标准数码相机拍摄的褐色叶片的图片;方框标记显示高UPE的区域。

当您的实验真正受限于背景、灵敏度和弱信号分辨能力时，发光检测往往就是更值得优先考虑的技术路线。

现在让我们一起看几款适合“发光检测”的仪器吧！

仪器推荐

1. 多功能酶标仪

德国伯托（Berthold）研发生产的两款多功能酶标仪Tristar3&Tristar5，以≤6amol ATP的发光灵敏度，和≤7amol FITC的荧光灵敏度，居行业内的翘楚。其兼具多功能检测功能、可按需配置最多3个喷注式进样器、光路的自由选择等特点。详情请参考：灵敏度不到位，多功能酶标仪就是白搭

2. 发光检测仪

Berthold提供了多款高性能的仪器，其中包括LB9510、LB9526和LB963三个型号的发光仪。这些仪器在生物发光和化学发光检测中具有显著的优势和广泛的应用。LB9510是一款灵敏度达1amolATP/管的管式发光检测仪。LB9526是一款灵敏度达0.5zmol荧光素酶的单管式发光检测仪。LB963是一款灵敏度达1.8zmol萤火虫荧光素酶的微孔板发光检测仪。详情请参考：没有比这更好的发光检测仪！

3. 小动物活体成像

NightOWL小动物活体成像仪可以对活体小动物（如小鼠、大鼠、兔子等）进行化学发光、荧光、白光、上转换荧光、切伦科夫发光和X-光等研究目标进行成像。也可以兼容其他分子影像技术，如micro-CT/ SPECT/ PET/ MRI/ Ultrasound。详情请参考：深度观察：Berthold小动物活体成像在肿瘤研究中的角色

4. 植物活体成像

NightSHADE是德国伯托推出的一款专为植物活体实验设计的成像系统，具备以下核心功能：支持荧光与生物发光成像、多通道成像同步采集、高灵敏度制冷CCD相机、适合从单个幼苗到整盆植物的多尺度成像、支持长时间（数小时至数天）实时成像。详情请参考：“看见植物沉默的光”：高灵敏度植物活体成像系统——Berthold NightSHADE

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参考文献：

1. Jiang, L., et al. (2021). Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal Models. Journal of Biomedical Optics, 26(3), 1-9.

2. Liu, X., et al. (2019). NanoLuc: A Small Luciferase is Brightening up the Field of Bioluminescence. Nature  Methods, 16(9), 747-754. 

3. Liu, Z., et al. (2017). Evaluation of Luciferase and GFP-Expressing Nipah Viruses for Rapid Quantitative Antiviral Screening. Antiviral Research, 137, 45-50.

4. Smith, C., et al. (2014). Comparison of Chemiluminescent Assays and Colorimetric ELISAs for Quantification of Murine IL-12, Human IL-4 and Murine IL-4:Chemiluminescent Substrates Provide Markedly Enhanced Sensitivity. Journal of Immunological Methods, 409, 70-79.

5. Yamamoto, N., et al. (2020). Targeting the Activated Allosteric Conformation of the Endothelin Receptor B in Melanoma with an Antibody-Drug Conjugate: Mechanisms and Therapeutic Efficacy. Cancer Research, 80(14), 2902-2913.      

6. Zhang, Y., et al. (2020). Natural Variation of AcEGY3 Mediates Chloroplastic ROS Homeostasis to Confer Kiwifruit Thermotolerance. Plant Physiology, 183(3), 1241-1255.  

7. Zhao, J., et al. (2021). A Comprehensive Exploration of Bioluminescence Systems, Mechanisms, and Advanced Assays for Versatile Applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 9, 643-656.