利用R1-Navajo方法评估了供体基因型、诱导剂基因型以及胚乳质地对玉米单倍体诱导的影响

《Euphytica》：Effects of donor and inducer genotype and endosperm texture on haploid induction in maize assessed using R1-Navajo

　　摘要
玉米（Zea mays L.）中的双单倍体（DH）技术依赖于体内单倍体诱导，其中单倍体种子和幼苗的鉴定是该技术的关键步骤，这决定了DH品系生产的效率。本研究旨在评估胚乳质地、供体基因型和诱导剂对基于R1-navajo（R1-nj）标记的潜在单倍体率的影响，并利用保卫细胞长度和气孔密度作为工具来区分潜在单倍体中的二倍体。共有11个杂交种被评估为供体基因型，并与10种单倍体诱导剂进行授粉。响应指标是基于R1-nj表型的潜在单倍体种子数量，该数量是根据总种子数来评估的。之前分类的两种诱导玉米杂交种的种子被种植出来，通过测量玉米叶片背面的表皮印迹来测定保卫细胞长度（GCL）和气孔密度（SD）。植物根据真实倍性通过金标准评估进行分类。三交诱导剂（UH400×UH401）×TAIL 9与5个供体杂交种组合获得了最高的潜在单倍体率（PHR）。GCL和SD的差异幅度足以通过逻辑回归有效分类玉米的倍性。获得的AUC值分别为0.916和0.941，表明这两种测试可以整合到玉米育种计划中，用于正确区分潜在单倍体中的二倍体。

引言
在玉米（Zea mays L.）育种计划中，生产双单倍体（DH）品系的方法涉及四个关键步骤：（1）通过将母本单倍体诱导剂花粉供体与供体基因型杂交来实现单倍体诱导，从而产生母本单倍体种子；（2）鉴定和分离单倍体种子；（3）使用抗有丝分裂剂对单倍体植物进行染色体加倍；（4）对加倍后的植物进行自花授粉以产生双单倍体品系。与需要连续几代自花授粉的传统方法相比，DH技术能够在单一代中开发出纯合自交系，减少了玉米育种所需的时间和资源（Chaikam等人，2019年）。单倍体诱导率（HIR）由单倍体种子数量与总种子数量之比决定。较高的HIR值对于基于DH的育种计划的效率至关重要，并允许大规模生产双单倍体品系（Silva等人，2023年）。HIR特性首先受到单倍体诱导剂基因型的影响。在早期使用DH进行玉米育种时，Stock 6品系被广泛用作诱导剂，平均产生2-3%的单倍体种子。后来的单倍体诱导育种使HIR率在8%到15%之间，例如RWS、UH400和TAIL等诱导剂品系（Coe 1959；Prasanna 2012）。此外，HIR还显著受到供体遗传背景的影响（Silva等人，2020年）。De La Fuente等人（2018年）观察到使用相同诱导剂RWS/RWK-76授粉的30个杂交种的潜在单倍体率在2.6%到30.5%之间。其他潜在因素中，存在于供体中的花青素抑制剂等位基因（C1-I、C2-Idf和in1-D）会以上位性方式影响R1-nj，从而阻止糊粉层色素的形成。通常，硬粒玉米携带花青素抑制基因的频率高于马齿粒玉米，这使得在硬粒或硬粒×马齿粒杂交种中鉴定单倍体种子更加困难（Eder和Chalik，2002年；Chen等人，2024年）。鉴于诱导剂和供体种质对单倍体诱导率的复杂相互作用，需要研究来确定这些因素之间的依赖性，特别是在热带条件下（Ren等人，2022年；Trentin等人，2023年）。识别出显著的相互作用可以使特定诱导剂品系用于特定供体基因型，从而降低与单倍体选择相关的成本。

此外，在生产双单倍体品系时，需要可靠的方法在种子或幼苗阶段确认诱导杂交后植物的单倍性（Dang等人，2012年；Melchinger等人，2016年）。此外，还需要方法来消除可能在自花授粉前未被先前过程消除的二倍体植物。这种评估将减少假阳性的数量、时间和不必要的劳动力。使用表达茎和叶鞘紫色或红色色素的基因（Rober等人，2005年；Li等人，2009年）以及种子中的油含量（Melchinger等人，2014年）的报告，是试图整合到使用DH技术的育种计划中的方法示例。在用于区分倍性的方法中，已经探索了气孔形态特征（Pires等人，2023年）。据报道，气孔保卫细胞的长度与咖啡（Mishra 1997年）、菊花（Wang等人，2014年）和铁线莲（Wu等人，2013年）中的DNA含量相关，这表明其具有区分植物倍性的潜力。也有研究评估了玉米叶片中的保卫细胞长度和气孔密度以区分二倍体和双单倍体植物（Choe等人，2012年；Molenaar等人，2019年；Silva等人，2020年；Ribeiro等人，2022年）。在这方面，基于气孔保卫细胞的技术被证明是可靠的、非破坏性的，并适用于广泛的种质。对于简单有效的单倍体鉴定程序的需求正在增加。理想情况下，这些方法应在种子或幼苗阶段适用于不同的种质，并且速度快且运营成本低。因此，本研究旨在评估供体胚乳质地、供体和诱导剂基因型对基于R1-nj表型的单倍体诱导率的影响，并利用保卫细胞长度和气孔密度作为工具来区分潜在单倍体中的二倍体。

材料与方法
种子来自11个玉米杂交种的授粉，这些杂交种作为供体基因型（雌性亲本），与10种单倍体诱导剂玉米基因型（雄性亲本）进行杂交。供体基因型包括10个单杂交种和一个三交杂交种。这些杂交种在巴西的玉米种植中具有商业重要性，并表现出半马齿粒、半硬粒和硬粒胚乳质地（表1）。表1 用于评估玉米潜在单倍体率（PHR）的供体基因型杂交种

表1 用于评估玉米潜在单倍体率的杂交种

所评估的单倍体诱导剂因其稳定的R1-nj表达和在热带条件下的适应性而被选中（表2），这些诱导剂被育种公司频繁使用。它们包括：由德国霍恩海姆大学开发的温带品系UH400和UH401衍生的单交杂交种，使用KEMS（Krasnador Embryo Marker Synthetic）诱导剂（Liu等人，2016年）；由墨西哥国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）与霍恩海姆大学合作，通过将UH400和RWS（俄罗斯诱导剂KEMS+WS14）诱导剂与热带玉米品系回交开发的Tropical Adapted Inducer Lines（TAILs 7、8和9）（Prasanna 2012；Liu等人，2016年）；由Nidera Sementes开发的诱导自交系，源自TAILs 1、2和3；以及从UH400、UH401、TAILs 7、8和9诱导剂获得的简单和三交杂交种。表2 用于评估玉米潜在单倍体率的母本单倍体诱导剂

单倍体诱导杂交和表型分类
授粉试验在2016/2017生长季节在巴西SC州的Abelardo Luz进行，由商业玉米种子生产公司Nidera Sementes实施。供体和诱导剂基因型以每组合6米行距排列（供体×诱导剂），行间和行内间距分别为0.90米和0.20米。单倍体诱导剂种植在相邻的田地里。为了确保开花期同步，诱导剂基因型分五个连续的播种日期播种，间隔一周；第一次和最后一次播种分别比供体基因型提前一周和落后21天。在花丝出现之前保护供体基因型的穗。在开花期间，使用纸袋批量收集每种诱导剂的花粉，并进行人工授粉。授粉后的穗被分开收获，根据种子盾片和糊粉层的紫色是否存在对种子进行分类，这是由于诱导剂种质中存在的显性R1-nj标记基因的表达（Nanda和Chase，1966年）。因此，具有紫色胚乳和白色胚（无色）的种子被认为是潜在单倍体（图1）。每个穗的总种子数量是通过将潜在单倍体种子、杂交产生的二倍体（具有紫色胚乳和紫色胚）和正常种子（无紫色色素）相加得到的。

图1
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

图1的说明性示意图：A是潜在单倍体种子（紫色胚乳和无色胚），B是杂交产生的二倍体种子（紫色胚乳和紫色胚），C是正常种子（无紫色色素）

气孔实验程序
之前从两个玉米单杂交种和10种单倍体诱导剂之间的杂交中获得的种子（表3）用于评估气孔密度（SD）和保卫细胞长度（GCL）。从每个倍性组中随机抽取样本，并使用每个杂交的种子数量来进行实验。每个杂交的种子单独放置在BOD培养箱中，在26±1℃的受控温度下发芽96小时（Prasanna 2012）。幼苗被移植到直径4.8×9.0厘米、高50孔的塑料托盘中，其中含有蔬菜土壤基质。托盘在温室中保持10天以使植物适应环境。10天后，幼苗被移植到田间，以5米长的行距种植，植株间距为0.2米。田间实验在2016/2017作物季节在巴西Paraná州的Guarapuava进行。表3 用于实验的每个杂交的种子数量（N）、潜在单倍体（PH）和潜在二倍体（PD）

根据Kim等人（2010年）的方法，并由Choe等人（2012年）复制，使用氰基丙烯酸酯胶水获得保卫细胞和气孔的表皮印迹。包含背面表皮印迹的载玻片是从叶片样本（0.5×1厘米）制成的，从叶片基部第三和第四节点处的中线两侧各采集一个样本。图像是在Primo Star?型号的光学显微镜上捕获的，配备了Zen Lite 2001软件。为了评估GCL，使用40倍物镜捕获图像，并借助ImagePro?Plus软件从四个随机选择的气孔中获取测量值。为了评估SD，使用10倍物镜拍摄了图像，并从三个随机选择的样本点（0.3×0.3毫米2）计算了气孔的数量，同样借助ImagePro?Plus软件完成。为了评估真实的倍性，植物在开花阶段使用基于植物视觉评估的金标准分类方法进行评估，这些评估依据是花序的活力和生育力（Melchinger等人，2013年）。活力较低、植株较矮小、叶片较细且直立的植物，以及花序生育力较低的植物被归类为单倍体，而活力强且生育力高的植物被归类为二倍体（图2）。所有来自每个杂交组合和每个倍性分组的植物都被标记并编号，以便进行比较。

图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像

植物表型的金标准评估。二倍体和单倍体植物在活力上的表型差异；B二倍体和C单倍体植物在花序生育力上的差异

R1-nj数据的统计分析
响应变量是从每个供体×诱导剂组合的单个穗中获得的假单倍体数量（y_ijkl）与总种子数量（n_ijkl）之比。因此，y_ijkl遵循二项分布，成功概率为π_ijkl（假单倍体率-PHR）[y_ijkl ~ Binomial(π_ijkl, n_ijkl)]，使用logit链接函数，如方程所示：
$$logit(\pi_ijkl) = \eta_ijkl = \mu + \alpha_i + \beta_j + \gamma_k(j) + \tau_i(j) + \omega_{ij}$$
其中η_ijkl是第j个胚乳质地中第k个供体基因型产生的第l个穗的线性预测因子，μ是数据中的常数，α_i表示第i个诱导剂的效果，β_j表示第j个胚乳质地的效果，γ_k(j)表示第j个胚乳质地中第k个供体基因型的效果，τ_i(j)表示第j个胚乳质地中第i个诱导剂基因型的效果，ω_ij表示第j个胚乳质地和第k个供体基因型中的第i个诱导剂基因型的效果。该模型使用R Core Team 2025中的‘glm’函数进行拟合。

提供更好数据拟合的模型使用‘hnp’包（Moral等人，2017年）进行残差分析，采用模拟包络的诊断图。检测到过度离散，因为数据中的变异量超出了模型的预期。因此，使用准二项模型校正了估计的标准误差和置信区间，其中方差由φπ_ijkl(1 - π_ijkl)给出，φ是离散参数（Demétrio等人，2014年）。进行了顺序偏差分析，使用F统计量评估模型的因素。在每个因素的水平内估计了估计均值的成对对比，并使用Wald检验进行推断。p值使用Bonferroni校正进行调整，以保持全局错误率为α = 0.05。然后使用链接函数的逆将线性预测因子尺度上的均值转换为概率：
$$g^{-1}(\pi_ijkl) = \frac{e^{\eta_ijkl}}{1 + e^{\eta_ijkl}$$
使用R环境中的‘emmeans’包（R Core Team 2025）获得了估计对比的渐近置信区间。

使用R1-nj进行倍性鉴定的准确性
根据金标准确定的倍性，被确认为真正的二倍体被归类为真正例（TP），被确认为真正的单倍体被归类为真正例（TN）。在二倍体组分中被分类为单倍体的真正例被称为假正例（FP），而在单倍体组分中被分类为二倍体的真正例被称为假负例（FN）。根据金标准识别的单倍体和二倍体的总数，调整了TP、TN、FP和FN的数量。这些数据还用于计算假发现率（FDR）和假负率（FNR）（Melchinger等人，2013年）。

保卫细胞长度和气孔密度的统计分析
气孔数据通过具有伽马分布和对数链接函数的广义线性模型（GLM）进行分析，用于测试单倍体和二倍体植物之间以及杂交种和单倍体诱导剂之间GCL测量差异的显著性。对于SD变量，使用具有负二项分布和对数链接函数的GLM。两个变量采用的统计模型是饱和模型，具有固定效应因子：
$$\log_e(\mu_ijkl) = \eta_ijkl = \mu + \alpha_i + \beta_j + \alpha \beta_ij$$
其中\(\log_e(\mu_ijkl)\)是第j个供体基因型与第i个诱导剂基因型杂交产生的第k个穗的第l个观察值的自然对数，μ是常数，\(\alpha_i\)是第i个诱导剂的效果，\(\beta_j\)是第j个胚乳质地的效果，\(\alpha \beta_ij\)是第i个倍性水平与第j个杂交种的效果。使用似然比卡方检验测试因素，并使用Wald检验和Bonferroni校正进行均值比较，显著性水平为5%。统计分析使用R软件（R Core Team 2025）进行。

为了验证GCL和SD变量在识别二倍体植物中的使用，使用了逻辑回归。使用接收者操作特征曲线（ROC曲线）建立了倍性分类的截止点。计算了与截止点相关的概率值、敏感性（SENS）、特异性（SPE）、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）以及ROC曲线下的面积（AUC）。这些指标用于量化GCL和SD在基于金标准倍性分类区分单倍体和二倍体植物方面的准确性。

结果与讨论
共评估了1,394个穗中的240,285粒种子。每个供体×诱导剂组合的穗数从0到30不等（补充图1）。由于样本大小直接影响置信区间，因此它根据每个供体×诱导剂组合获得的穗数而变化。较大的样本大小为PHR提供了更窄的置信区间，提高了检测显著差异的统计能力。有八个杂交组合没有产生任何种子，这很可能是由于诱导剂和供体之间缺乏开花同步性，因此无法估计这些组合的均值和涉及这些均值的对比。这些杂交组合包括：BG 7060×TAIL 7、P4285 YHR×[TAIL 9、UH400×UH401、(UH400×UH401)×TAIL 9和Nidera Orig TAIL 1，以及SYN 7205×[TAIL 7、TAIL 7×TAIL 8和Nidera Orig TAIL 1]。共获得了15,254粒假单倍体种子，实验中观察到的平均PHR为6.35%，在不同供体×诱导剂组合中的范围从0.05%到18.63%不等。

半正态图为考虑过度离散的模型提供了强有力的支持，大多数残差落在模拟包络内（图3）。因此，对于这项研究，准二项模型提供了更好的拟合，因此更适合估计估计均值的标准误差。准二项过度离散模型的估计离散参数为2.67，表明数据表现出比二项假设预期的更大的变异性。这种过度离散可能是由于模型协变量无法解释的观察值之间的异质性（Demétrio等人，2014年）。当忽略过度离散时，估计均值的标准误差被低估，从而夸大了I型错误率。

图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像

对于假单倍体率（PHR）的A二项模型和B准二项logit模型的残差偏差诊断图，带有模拟包络

PHR的顺序偏差分析显示所有评估因素及其交互项都有显著效果（p < 0.05）（补充表1）。Trentin等人（2022年）使用七组诱导剂基因型与五组不同背景的供体基因型杂交，观察到诱导剂和供体之间的显著交互作用。另一方面，Prigge等人（2011年）也发现了诱导剂和供体种质之间的基因型效应，尽管没有报告显著的交互作用。尽管存在基因型效应，环境也会影响诱导效率（Silva等人，2023年）。温度、辐射和湿度等因素可以影响R1-nj标记的表达和单倍体胚胎的形成。因此，单季实验限制了捕捉影响单倍体诱导的环境变异性的能力。未来的研究应在多个季节或地点评估供体×诱导剂组合，以更好地理解环境效应和基因型×环境交互作用对PHR的影响。在未来的研究中，更广泛地采样不同质地类别的供体基因型也有助于确认这些模式。

单倍体诱导剂的性能
图4还展示了供体基因型和诱导剂之间的交互作用图。诱导剂（UH400×UH401）×TAIL 9作为单倍体诱导剂与五个供体杂交种结合使用时，表现出最高的估计均值，统计上优于表现较差的诱导剂（补充表2）。作为三重杂交种，该诱导剂在多个位点积累的等位基因可能解释了观察到的PHR（Chaikam等人，2019年）。虽然PHR代表的是一个间接估计，但使用R1-nj分类的假单倍体与真正的单倍体诱导率相关，可以作为评估不同诱导剂效率的基础（Couto等人，2015年）。

图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像

在玉米中，诱导剂基因型与供体基因型在胚乳质地内的复杂交互作用对假单倍体率的影响

对于供体杂交种NS 50 PRO，单个杂交诱导剂TAIL 7×TAIL 8显示出最高的单倍体诱导能力（7.98%），优于其他三个诱导剂，包括三重杂交种（UH400×UH401）×TAIL 9（2.80%），后者在其他杂交中表现较好。对于杂交种AS 1677 PRO3和SYN 7205，诱导剂UH400×UH401表现出最高的PHR。NS 92 PRO和P4285 YHR在诱导剂之间没有显示出显著差异。

诱导母系单倍体的能力是一个由多个位点控制的定量性状（Trentin等人，2023年）。已经成功鉴定了两个关键基因：（1）三个独立研究小组鉴定的基因，称为MATRILINEAL（MTL）、NOT LIKE DAD（NLD）或ZmPHOSPHOLIPASE-A1（ZmPLA1）（Gilles等人，2017年；Liu等人，2017年；Kelliher等人，2017年），位于1号染色体上的QTL qhir1内；以及（2）ZmDMP（Zhong等人，2019年），位于9号染色体上的QTL qhir8内。QTLs qhir1和qhir8分别解释了单倍体诱导率的66%和20%的基因型变异（Prigge等人，2012年）。Khammona等人（2024年）通过标记辅助选择在分离群体中确认了这些QTLs对单倍体诱导率的关键作用。虽然qhir8单独贡献的单倍体诱导率较低（0.15%），但当与MTL/NLD/ZmPLA1位点的突变等位基因结合时，它可以将其提高两到六倍，突显了这些基因之间的协同效应（Zhong等人，2019年）。此外，Trentin等人（2023年）在10号染色体上鉴定了一个主要效应的QTL，并在其他六个染色体上鉴定了一些次要效应的QTLs，反映了这一性状的复杂遗传结构。

玉米体内母系单倍体诱导的生物学机制尚未完全理解。已经提出了两种主要现象来解释单倍体胚胎的起源：（i）单次受精，其中只有极核被精子核受精，而诱导剂配子未能与卵细胞融合，产生具有正常父系贡献的胚乳和单倍体胚胎；（ii）双受精后的选择性染色体消除，在随后的合子分裂过程中消除诱导剂的染色体（Gilles等人，2017年；Kelliher等人，2017年）。这些过程与诱导剂位点如MTL/NLD/ZmPLA1和ZmDMP功能相关，这些位点可以改变配子的行为并促进父系基因组的消除。单次受精和染色体消除的同时发生可能以互补的方式起作用，表明多种生物学途径可以促进单倍体胚胎的形成（Zhong等人，2019年；Qu等人，2024年）。

使用R1-nj验证倍性鉴定的准确性
对来自假单倍体和二倍体胚胎的植物的金标准表型评估显示，两种杂交种的FDR都很低（表4）。对于AS 1555 RR，FDR的范围从0%到4.44%（平均1.81%），而假负率（FNR）的范围从0%到15.69%（平均7.28%）。对于P1630 HX，FDR的范围从0%到2.78%（平均1.46%），FNR的范围从2.17%到8.89%（平均4.93%）。考虑到所有组合，总体假阳性率（FDR）为1.64%，总体假阴性率（FNR）为6.16%，这表明R1-nj单倍体鉴定的准确性很高（Chaikam等人，2016年）。表4通过表型评估对基于R1-nj的单倍体/二倍体胚胎鉴定进行了金标准确认。全尺寸表格。

从光学显微镜下的观察中可以注意到，单倍体植物和二倍体植物在气孔保卫细胞长度方面存在视觉差异（图5）。与二倍体植物相比，单倍体植物的保卫细胞较短。同样，在不同倍性植物之间也检测到了气孔密度的差异。单倍体植物的叶片每单位面积的气孔数量通常比二倍体同源植物的叶片更多（图6）。

统计分析还显示，当这一因素与杂交品种相互作用时，两种表型在保卫细胞长度（GCL）和气孔密度（SD）上存在显著差异（p<0.05）（补充表3）。单倍体植物的平均GCL为41.17微米，而二倍体植物的平均GCL为58.16微米（表5）。在归类为单倍体和二倍体的植物中，杂交品种P1630 HX的GCL更大（分别为43.15微米和59.62微米）。在所有源基因型中，单倍体植物的保卫细胞长度始终比二倍体植物的GCL短。因此，二倍体植物的保卫细胞长度平均比单倍体植物的保卫细胞长度长41%。表5比较了单倍体和二倍体表型在与杂交品种相互作用时玉米叶片保卫细胞长度（GCL）的差异。

对于所评估的两种杂交品种，单倍体植物的气孔密度（SD）分别为25.61和24.58个/平方毫米，而二倍体植物分别为13.62和14.04个/平方毫米（表6）。总体而言，单倍体植物每单位面积的气孔数量通常比二倍体植物多，分别为25.09个/平方毫米和13.83个/平方毫米。GCL和SD的差异支持了倍性分类，单倍体和二倍体之间的平均差异分别为16.99微米和11.26个/平方毫米。

气孔长度与密度之间的负相关关系是众所周知的，并已在气孔导度研究中得到证实（Franks和Beerling，2009年）。气孔形成的控制与遗传和环境因素都有关。因此，保卫细胞的长度不仅与基因组大小有关（Beaulieu等人，2008年；Lomax等人，2009年），还与植物所处的水分条件有关（Xu和Zhou，2008年；Abdel和Stutzel，2016年）。

在一项关于玉米的研究中（Zhao等人，2015年），研究人员观察到在正常生长条件下，幼苗生长和叶片扩展过程中会不断形成新的气孔。气孔数量的增加使气孔密度保持相对稳定，而气孔的大小（宽度和长度）保持不变。这些研究人员还报告说，受到严重干旱条件的玉米幼苗显著刺激了气孔的生成，这包括气孔密度的显著增加和长度的减少。这一现象与小气孔可以在较低的保卫细胞膨压下保持孔隙开放的观点有关，相比大气孔而言。因此，较高的密度和较小的气孔大小可以抑制水分流失，保证水分平衡（Bosabalidis和Kofidis，2002年）。

在利用R1-nj标记进行育种计划时，这种方法被广泛使用（Dang等人，2012年）。然而，这种方法可能会导致将大量二倍体误判为单倍体，即所谓的假阳性（Prigge等人，2011年；Melchinger等人，2014年；Chaikam等人，2016年）。一种可以在复制前帮助评估植物的方法是通过测量气孔长度，因为研究表明不同倍性的植物在这些细胞的大小上存在差异（Choe等人，2012年；Wu等人，2013年；Wang等人，2014年；Silva等人，2019年）。通过调整逻辑回归和概率（补充图2），可以使用ROC曲线（接收者操作特征曲线）为数据集建立一个临界点。ROC曲线在二元统计中已被使用，并可以在估计过程中引入先验信息（金标准），从而减少推断的不确定性（Gon?alves等人，2014年）。当诊断测试针对真实的基础条件进行评估时，特别是当真实植物倍性被分类为单倍体或二倍体时，这一点尤为重要。

ROC曲线（图7）是根据完整的保卫细胞长度（GCL）数据集生成的，将这些数据与真实植物表型相关联，而不考虑测量数据的杂交来源。图7使用AI生成的全尺寸图像。

从完整的保卫细胞长度（GCL）数据集生成的ROC曲线。虚线的交点标记了与理想临界点相关的概率，连续的对角线表示模型在没有添加评估响应变量时获得的比例关系。虚线的交点标记了一个概率值，该概率值使得能够获得估计的临界点。在这种情况下，采用的概率为0.616，估计的GCL临界点为48.71微米（表7）。根据这个临界点，将GCL等于或大于该值的植物分类为二倍体，相反，低于该值的植物分类为单倍体。从完整数据集生成的列联表显示在补充图3中。表7使用ROC曲线为玉米叶片保卫细胞长度（GCL）定义的临界点，获得了与临界点相关的概率值、敏感性（SENS）、特异性（SPE）、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和AUC，用于分类假定的二倍体和单倍体。

在建立的临界点上，发现的敏感性为86.3%，特异性为80.1%，被认为是令人满意的，因为构建的逻辑模型对真阳性和阴性都有很高的分类比例。还获得了较高的阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）比例（分别为90.1%和74.2%）。指数如PPV（阳性预测值）和NPV（阴性预测值）分别表示当测试结果为二倍体时植物实际为二倍体的概率，以及当测试结果也为单倍体时植物实际为单倍体的可能性。确定ROC曲线下的面积（AUC）是一种简单快速的方法，可以指示诊断测试在区分研究类别方面的性能（Gon?alves等人，2014年）。考虑到获得的AUC为0.916，可以推断GCL是一个可靠的诊断测试，用于选择二倍体和单倍体。

考虑到杂交品种和表型之间的相互作用，以及在不同杂交组合中观察到的GCL平均值之间的差异，如果采用单一临界值，倍性分类的效率可能会受到影响。因此，采用了一种更具体的方法，即为每个杂交组合生成ROC曲线并定义单独的临界点（图8）。尽管估计了具体的临界值，但不同杂交品种之间的预测性能差异相对较小，表明模型的整体区分能力在各种杂交组合中是一致的。

几位研究人员在植物育种研究中使用了GCL测量方法（Choe等人，2012年）。他们提出在染色体复制后的双倍体玉米程序中评估气孔保卫细胞以区分倍性。结果显示，在早期阶段（第2片叶子），可以区分单倍体植物和二倍体植物，而从第5片叶子取得的样本能够区分单倍体、二倍体和双倍体植物。作者还指出，这种技术可能比流式细胞术更有效，因为DH植物具有嵌合组织，在图表中可能同时显示单倍体和二倍体峰值，需要较高的经验水平来正确解释结果。此外，与流式细胞术相比，气孔长度测量是一种更快且成本更低的技术。

保卫细胞长度在检测单倍体和二倍体之间的差异方面被证明是有效的，并且可以与表型标记R1-nj一起用于遗传改良，从而提前淘汰大多数二倍体种子（Molenaar等人，2019年；Silva等人，2020年）。通过R1-nj大量淘汰二倍体种子，并通过GCL在早期阶段淘汰假阳性，最大化了这种淘汰的效率，减少了育种计划中的劳动力、空间和资源消耗。GCL也可以用于那些由于源基因型而阻碍或抑制花青素标记表达的育种计划中（Chaikam等人，2014年）。

在检测假定的单倍体中的二倍体时，使用保卫细胞长度的方法被广泛采用。然而，这种方法可能会导致将大量二倍体误判为单倍体，即所谓的假阳性（Prigge等人，2011年；Melchinger等人，2014年；Chaikam等人，2016年）。一种可以在复制前帮助评估植物的方法是通过测量气孔长度，因为研究表明不同倍性的植物在这些细胞的大小上存在差异（Choe等人，2012年；Wu等人，2013年；Wang等人，2014年；Silva等人，2019年）。

与GCL的情况相反，在气孔密度（SD）与植物倍性之间的关系中，随着叶片上每单位面积的气孔数量增加，发现二倍体的概率降低（补充图4）。ROC曲线得出的临界点为18.33个/平方毫米（图9）。图9使用AI生成的全尺寸图像。

从完整的玉米叶片气孔密度（SD）数据集生成的ROC曲线。虚线的交点标记了与理想临界点相关的概率，虚线对角线表示模型在没有添加评估响应变量时获得的比例关系。从临界点得出的高敏感性值（89.4%）和特异性值（87.2%）（表8）。对于预测值也是如此，分别表示检测到真实（阳性 and 阴性）的概率为93.5%和80.1%。ROC曲线的列联表（补充图5）显示了基于气孔密度的玉米叶片中单倍体和二倍体的分类。表8使用ROC曲线为玉米叶片气孔密度（SD）定义的临界点，获得了与临界点相关的概率值、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和AUC，用于分类假定的二倍体和单倍体。

根据ROC曲线，模型的区分能力为0.941，表明气孔密度可靠地检测了单倍体和二倍体植物之间的差异，这有助于在培养早期阶段淘汰二倍体植物。每个杂交品种的ROC曲线显示在图10中。图10使用AI生成的全尺寸图像。

Wu等人（2013年）使用秋水仙碱对四倍体Clematis heracleifolia的顶端分生组织进行了四倍体化处理。通过比较叶片，作者观察到四倍体突变体的叶片比二倍体对照植物的叶片具有更大的气孔。平均而言，四倍体气孔的长度增加了16.7%，而二倍体植物的气孔频率大约高出8%。他们提出，气孔的大小和频率可以作为植物倍性初步筛查的间接指标。同样，Ribeiro（2022）的研究表明，气孔密度会因来源种群和基因型的不同而有所差异，并可能成为区分双倍体和单倍体植物的潜在特征。本研究的发现显示，在所测试的诱导剂中，(UH400 × UH401) × TAIL 9与五种供体杂交组合时表现出最高的单倍体诱导率（PHR），这表明这种三因子杂交诱导剂中可能存在负责单倍体诱导的等位基因积累。对于AS 1677 PRO3和SYN 7205这两种杂交种，诱导剂UH400 × UH401的效果更为显著。这些结果共同表明，不同的单倍体诱导剂在用于不同优良供体基因型和胚乳质地时，其诱导单倍体的能力存在差异。研究还发现，通过逻辑回归分析，保卫细胞长度和气孔密度能够区分来自两个不同来源基因型的玉米单倍体和二倍体植株。由于这些性状仅基于两种供体杂交种进行评估，未来需要包含更多玉米种质资源的研究来验证该方法的普遍适用性。