采用形态学和化学分类学方法，研究在MIS 3阶段（6万至2.5万年前）欧亚草原上可能存在的植物淀粉特征

《Journal of Archaeological Science》：A morphological and chemo-taxonomic approach to characterize starches from plants potentially available in the Eurasian Steppe during MIS 3 (60-25 ka BP)

　　C. Cagnato|G. Sorrentino|A. Bonetto|F.C. Izzo|A. Brunelli|G. Birarda|L. Vaccari|S. Condemi|A. Carbone|A. Marcomini|L. Longo|E. Badetti
意大利威尼斯卡福斯卡里大学环境科学、信息学与统计系（DAIS），Via Torino 155，Mestre，威尼斯，30172

**摘要**
在关于过去生存策略的考古重建中，植物通常被低估，尤其是在旧石器时代，这主要是因为它们在考古记录中保存状况较差。然而，植物是多用途资源，被用于各种目的，包括作为重要的食物来源。淀粉是一种由植物产生的高能量多糖，在智人扩散到欧亚大陆北部地区（即海洋同位素阶段3，MIS 3，60–25千年前）期间可能发挥了重要作用。淀粉颗粒直接证明了淀粉植物的消费和有意加工。这些残留物与使用痕迹的共存强烈表明了对植物的有目的利用，揭示了早期人类的适应策略。传统的淀粉颗粒鉴定方法依赖于透射光和偏振光下的光学显微镜观察关键诊断特征，并通常通过与现代参考样本的比较来进行形态学评估。然而，大多数数据集优先考虑经济上重要的驯化植物，导致MIS 3期间特别是北方纬度地区野生植物的淀粉被大大忽视。本研究全面分析了从26种植物中提取的淀粉。为此，整合了一系列物理化学表征技术，包括光学显微镜、扫描电子显微镜、激光粒径测量、红外光谱和气相色谱-质谱分析。这种创新方法有助于识别与欧亚大陆上旧石器时代遗址中磨制石器上发现的淀粉颗粒相媲美的样本，为考古解释提供了更完整的框架。

**1. 引言**
植物对人类始终具有重要作用，但由于它们保存状况不佳且残留物体积小，其在旧石器时代的意义难以评估，从而使得通过传统考古方法进行有效分析变得困难。迄今为止，植物的存在主要通过宏观植物遗存（木炭、种子、块茎和根茎的薄壁组织残余）（Mason等人，1994年；Weiss等人，2008年；Wollstonecroft等人，2008年；Pryor等人，2013年；Larbey等人，2019年；Wadley等人，2020年）、微观植物遗存（如花粉和植硅体）（Madella等人，2002年；Piperno等人，2004年；Ivanova等人，2016年；Zanina等人，2021年）、淀粉（Revedin等人，2010年；Liu等人，2013年；Power等人，2014年；Dubreuil和Nadel，2015年；Mariotti-Lippi等人，2015年、2023年；Barton等人，2018年；Longo等人，2021年、2022年）以及最近的古代植物DNA（Willerslev等人，2014年；Stahlschmidt等人，2019年；ter Schure等人，2022年）来记录。对这些遗存的研究揭示了植物在旧石器时代早期就被用于生存策略的重要证据（Goren-Inbar等人，2002年；Ahituv等人，2024年）。在后续时期，发现现代人类更广泛地利用植物，将其作为食物来源（Mercader，2009年；Revedin等人，2010年；Aranguren等人，2011年；Florin等人，2022年；Hayes等人，2022年）、药物、染料、胶水、燃料和织物（Langejans，2006年；Hardy，2018年；Hardy等人，2018年；Sukenik等人，2021年；Longo等人，2025年），以及制作绳索、线状物、网等物品（Adovasio等人，1996年；Hather和Mason，2002年；Soffer，2004年；Hardy，2008年；Hurcombe，2014年；Ingold，2012年；Hardy等人，2020年）。尽管确认了植物与智人的关联，但它们被有意转化用于其他用途的情况并不总是容易证明。尤其是对于微观植物遗存来说（García-Granero，2020年；Henry，2020年）。事实上，花粉常常通过风和水分传播，甚至可以跨越长距离，因此通常反映区域植被情况；而植硅体——形成于植物组织内的微小二氧化硅结构——由于其抗降解性，在植物分解后仍会留在原地，因此更能指示过去的本地植被和周围景观（例如，Piperno，2006年；Daniau等人，2019年；Wang等人，2022年；Olatoyan等人，2023年）。相比之下，淀粉颗粒比花粉更不易自然扩散。因此，当从用于机械处理植物资源的磨制石器表面提取出来时，可以假设它们是这种转化活动的残留物（Mercader，2009年；Revedin等人，2010年；Barton等人，2018年；Copeland和Hardy，2018年；Kovárník和Bene?，2018年；Hayes等人，2022年）。淀粉还在牙结石（Hardy等人，2009年；Henry等人，2014年）和粪便（Sistiaga等人，2014年）中被发现。总体而言，这些分析提供了进一步证据，证明了它们经过人类有意处理和消费，因此是一种强有力的仿生指标。

淀粉是植物的主要多糖储备，根据植物生命周期可分为：一种是临时短期储存的淀粉，它在非储存组织（如叶子和茎）中产生并储存，迅速用于代谢需求；另一种是长期储存的淀粉，它积累在专门的储存器官（如种子和果实等地上储存器官，ASO）和地下储存器官（如块茎、根茎、根和球茎等USO）中的淀粉质体中（Haslam，2004年）。这些淀粉具有高能量价值，对于能够代谢它们的动物（包括现代人类）的生存至关重要。因此，在智人扩散到新环境——欧亚大陆期间（即海洋同位素阶段3，MIS 3，60–25千年前）的气候变严酷时期，富含淀粉的植物可能是其食物来源（Carbone等人，2025年）。本研究的時間框架受到限制，因为在末次冰盛期结束前恶劣的气候条件下，可利用的富含淀粉的野生谷物很少（Richerson等人，2001年；Riehl等人，2024年）。因此，合理推测淀粉可能是通过加工其他植物的储存器官（如根茎、块茎、带壳果实、树皮和种子）来获取的。

淀粉颗粒的尺寸为微米级（1至100微米），其特征是围绕一个称为脐点的核心形成了由直链淀粉（20-30%）和支链淀粉（70-80%）组成的同心环。这些颗粒可以通过湿法提取（如用移液管吸取或超声波处理石器）或使用牙齿刮刀进行机械作用从磨制石器表面提取（Mercader等人，2018年；Longo等人，2022年）。此外，常用作复制石器表面纹理和研究使用痕迹的模板的硅胶衍生物的剥离作用也可用于从石器表面回收有机残留物（Longo等人，2021年）。从相关基质中分离出淀粉颗粒后，通常通过透射光学显微镜（OM）在明场和偏振光下进行鉴定（Piperno和Holst，1998年；Haslam，2004年；Piperno等人，2004年；Henry等人，2014年；Cagnato和Ponce，2017年；Copeland和Hardy，2018年；Kovárník和Bene?，2018年；Longo等人，2021年），后者用于检测马耳他十字结构，这是由于它们的半结晶结构造成的。淀粉颗粒的形态也可通过扫描电子显微镜（SEM）进行研究，通常能提供高倍率和外部特征的分辨率（Cortella和Pochettino，1994年；Torrence，2006年；Longo等人，2021年、2022年；Zanina等人，2021年；Birarda等人，2023年）。显微镜分析还可以提供关于机械加工和热处理的信息，并帮助识别因酶活性（特别是α-淀粉酶）而降解的淀粉颗粒（Moss，1976年；Gott等人，2006年；Hardy等人，2009年；Ma等人，2017年）。补充地，光谱和光谱分析可以提供关于古老淀粉成分及其结构的信息（Birarda等人，2023年；Ordo?ez-Araque等人，2024年）。这些技术还能提供关于淀粉中其他较少见成分的信息，如蛋白质和脂质，这些成分既存在于淀粉颗粒表面也存在于内部（Pérez和Bertoft，2010年）。表面脂质成分包括游离脂肪酸、甘油三酯、糖脂和磷脂，而内部脂质主要是单酰脂（Gallant等人，1997年；Dhital等人，2019年；Ordo?ez-Araque等人，2024年）。脂肪酸在许多维持健康的重要生物功能中起关键作用（Ursin，2003年；Calder，2015年），包括作为能量来源（Lunn和Theobald，2006年；Ameur等人，2012年）。然而，由于从考古样本中提取的淀粉量有限，一些光谱和光谱技术无法应用（Copeland和Hardy，2018年）。尽管如此，使用更亮的光源（如激光或同步辐射）以及先进的光谱显微镜技术，可以分析单个颗粒（Birarda等人，2023年）。目前，虽然淀粉颗粒的分类精度不如花粉，但可以根据其形态和大小进行分类，这取决于其所来源的植物种类和储存器官（Esau，1977年；Pearsall，2000年）。大量出版物专注于工业上感兴趣的植物（如马铃薯、大米、玉米、木薯）的淀粉表征（Deka等人，2024年；Shetty等人，2024年），从而限制了考古淀粉颗粒的准确分类（不过参见Piperno和Holst，1998年；Messner，2011年；Mercader等人，2018年；Larbey等人，2019年；Cagnato等人，2021年；Ahituv和Henry，2022年）。这种比较数据集的匮乏导致了MIS 3期间北方纬度地区植物可用性和使用的信息不完整（Revedin等人，2010年；Mariotti Lippi等人，2015年；Longo等人，2022年；Birarda等人，2023年）。解决这一差距至关重要，这也促使我们开发了一个稳健且系统设计的植物淀粉参考集合。在本研究中，我们首次尝试建立一个有据可查的多分析参考框架，用于确定MIS 3期间在欧亚草原上可能存在的植物。这种方法支持形态学比较，并为初步的物理化学研究奠定了基础。

在此背景下，我们开发了一个从26种植物中提取的淀粉参考集合：其中23种被选为可能在MIS 3期间存在于欧亚草原上，另外3种非本地植物用于比较目的（Hardy，2010年；Blinnikov等人，2011年；Magyari等人，2014年）。用于参考集合的植物器官包括地上储存器官和地下储存器官。随后，我们开发了一种从储存器官中提取淀粉的程序。分离出的淀粉颗粒通过OM和SEM进行了形态学分析。为进一步加强参考集合的分析深度，我们使用激光粒径测量法研究了淀粉颗粒的大小分布，并通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和气相色谱-质谱（GC-MS）对其化学成分进行了表征。这些互补方法共同构建了一个综合比较框架，提高了识别考古淀粉的可靠性，并有助于重建我们研究领域的植物利用情况。最后，为了评估和完善这种方法的适用性，我们纳入了从摩尔多瓦Br?nzeni I洞穴上旧石器时代层中出土的磨制石器BZ833和BZ442中回收的考古淀粉颗粒（Allsworth-Jones等人，2018年）。由于并非总是能够对这些独特样本进行所有可能的物理化学分析，我们设法结合了OM、SEM和FTIR的数据。由于GC-MS需要大量样本，而考古学家通常无法获得足够的样本，因此我们未能对其应用该技术。此外，鉴于该技术的破坏性，我们将其作为补充信息来源，以帮助解释或确认FTIR光谱中观察到的信号，特别是通过识别可能存在于考古样本中的特定脂肪酸的特征振动模式。

**2. 材料与方法**
2.1. 基于考古和民族植物学数据的植物选择
我们对23种植物进行了深入分析，这些植物根据三个标准选出：第一组是出现在旧石器时代考古背景中的物种；第二组是在MIS 3期间仍存在于参考区域的植物；最后一组是现今存在于已知6万年前智人经过区域的植物，假设如果存在的话，它们在过去可能被人类利用过。本次选择是基于文献中报道的考古植物学证据，包括宏观和微观植物遗存（花粉、淀粉颗粒）以及植物DNA（表1）。此外，还考虑了三种非本研究区域原生的物种以供比较，并在下面进一步讨论。总体上，这个样本集合包含26个分类单元，代表了17个植物科。其中既有美国本土植物（USOs），也有亚洲本土植物（ASOs），分别为14种USOs和13种ASOs。Isatis tinctoria是唯一一种由两个不同植物部位（根和叶）代表的物种（表2）。

表1. 本研究选定的植物分类单元摘要，其记录的区域性和时间性的考古植物学证据，以及相应的参考文献。

| 分类单元 | 地区 | 时期 | 考古背景 | 证据类型 | 参考文献 |
| -------- | ----- | ------- | -------- | ------- |
| Arundo donax | 塔吉克斯坦 | 公元前4千年至公元前3千年末 | 炭化木 | Spengler和Willcox (2013) |
| Avena sativa | 以色列 | 公元前780年 | 磨石（淀粉颗粒） | Ahituv等人 (2024) |
| Italy (Avena sp.) | 意大利 | 公元前33年 | Paglicci洞穴 | 磨石（淀粉颗粒） | Mariotti Lippi等人 (2015) |
| Altai in Central Eurasia | 中欧亚大陆 | 公元前6世纪至前4世纪 | 牙结石（淀粉颗粒） | Zanina等人 (2021) |
| Cannabis sativa | 土耳其 | 约11万年前 | 花粉 | McPartland等人 (2019); Rull (2022) |
| Carex humilis | 德国 | 公元前30万年 | 种子和花粉 | Bigga等人 (2015); Urban和Bigga (2015) |
| Eastern Russia | 俄罗斯东部 | 约22,500年前 | 北雅库特 | 毛猛犸象肠道内容物（种子） | van Geel等人 (2008) |
| Poland | 波兰 | 公元前11,380至8,270年 | Ca?owanie沉积物（炭化瘦果） | Kubiak-Martens (1996) |
| Castanea sativa | 格鲁吉亚 | 公元前84,560年 | Sokota洞穴 | 冰柱（aDNA） | Stahlschmidt等人 (2019) |
| Spain | 西班牙 | 公元前3,140年 | El Tiemblo | 沉积物岩芯（花粉） | López-Sàez等人 (2017) |
| Cyclamen sp. | 西喀尔巴阡山脉和南石灰岩阿尔卑斯山 | 公元前11,500至11,000年 | 多个避难所 | Slovak等人 (2012) |
| Cyperus rotundus | 德国 | 约30万年 | Schoningen 13 II | 种子和小麦花粉 | Bigga等人 (2015) |
| Convallaria majalis | 匈牙利平原 | 次北温带时期（5,000-2,500年前） | 巴拉顿湖 | 花粉 | Nagy-Bodor等人 (2000) |
| Echinochloa crus-galli | 中国 | 公元前13,800和11,600年 | Shizitan遗址9 | 炭化种子 | Bestel等人 (2014) |
| Isatis tinctoria | 亚美尼亚 | 公元前39-24千年 | Aghitu-3洞穴 | 沉积物岩芯（DNA） | ter Schure等人 (2022) |
| Carex humilis | 德国 | 约3,000年前 | Schoningen 13 II | 果实 | (Bigga等人, 2015) |
| Oxalis acetosella | 匈牙利 | 当前现代植被 | Dénes等人 (2012) |
| Paeonia officinalis | 中欧亚大陆 | 公元前5世纪至公元5世纪 | 诸站点 | 牙结石（淀粉颗粒） | Zanina等人 (2021) |
| Pisum sativum | 亚美尼亚 | 公元前39-24千年 | Aghitu-3洞穴 | 沉积物岩芯（DNA） | ter Schure等人 (2022) |
| Quercus ilex | 以色列 | 公元前780年 | Gesher Benot Ya'aqov | 磨石（淀粉颗粒） | Ahituv等人 (2024) |
| Erythronium dens-canis | 中欧亚大陆 | 公元前39-24千年 | Aghitu-3洞穴 | 沉积物岩芯（DNA） | ter Schure等人 (2022) |
| Sorghum halepense | 俄罗斯 | 当前现代植被 | Kolosova等人 (2020) |
| Typha latifolia | 德国 | 约3,000年前 | Schoningen 13 II | 种子和根茎 | Bigga等人 (2015) |
| Solanum tuberosum | 英国 | 公元前25世纪 | 马铃薯 | Solanaceae块茎 | (2020) |
| Zea mays | 美国 | 玉米 | Poaceae种子 | (2020) |

表2. 本研究选定的植物，这些植物可能在MIS 3期间存在（条目1-24），以及参考材料或潜在污染物（条目25-27）。

**注：**
1. 表中的“Plant part”表示采集的植物部位，“Storage organ”表示储存这些部位的器官。
2. 由于部分植物的原始文献信息不足或数据缺失，部分条目标注为“__”或“当前现代植被”。采用了一种成熟的GC-MS方法来确定脂质组分（Izzo等人，2014年，2022年；Scarponi等人，2021年；Fuster-López等人，2019年；Caravá等人，2020年；Gnemmi等人，2024年）：将少量淀粉样品（0.20至0.40毫克）与50微升2.5%的甲醇溶液在室温下反应过夜，使脂肪酸转化为相应的甲酯。然后使用Thermo Scientific公司的AS1310自动进样器将每种衍生化溶液的1微升样品注入配备有ISQ 7000 MS检测器（四极杆 analysor）的Trace GC 1300系统中。色谱分离采用化学键合的熔融石英毛细管DB–5MS柱（长度30米，内径0.25毫米，壁厚0.25微米，填充物为5%苯基甲基聚硅氧烷），以氦气作为载气（流量为1毫升/分钟）。GC进样口、MS接口和输送管的温度设为280摄氏度，MS源温度设为300摄氏度。温度梯度从50摄氏度（3分钟）升至320摄氏度（5分钟），上升速率为每分钟10摄氏度。MS以全扫描模式（m/z 40–650）运行，扫描速率为每秒1.9次。电子电离能量为70电子伏特。通过将化合物的MS光谱与NIST和MS Search 1.7数据库中的光谱进行比对，以及作者创建的脂质数据库进行鉴定。使用十九烷酸作为内标，并通过含有最丰富饱和脂肪酸（肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸）和不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸）的标准溶液来定量淀粉中的脂肪酸。定量数据以μg/mg表示。

GC-MS的数据通过层次聚类分析进行统计处理，该方法基于不同簇中任意两点之间的最大距离来确定簇之间的距离（称为“完全”链接）。这种方法侧重于最远的点，从而形成比单一或平均链接方法更紧凑、分离更清晰的簇。统计分析使用R Statistical Software（版本4.1.2；R Core Team，2021年）和R包“hclust”（Becker等人，1988年）进行。

本研究采用了一系列分析技术来表征从选定植物中提取的淀粉，旨在提供新的、未被探索的特性，以便更好地识别从考古材料（如植物残留物、牙结石和粪便化石）中获得的淀粉。考古学家常用的光学显微镜（OM）用于非破坏性地识别淀粉和其他残留物，同时结合扫描电子显微镜（SEM）观察更微小的结构。此外，还通过粒度测量、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术进行了物理化学表征。

3.1. 提取过程
本研究开发的现代植物淀粉颗粒提取过程（第2.3节）旨在保持颗粒的形态、大小和形状。为防止化学降解，在提取过程中测试了几种溶剂。经过将Castanea sativa和Cannabis sativa的淀粉与四种不同溶剂混合后，通过OM和SEM分析，选出了最佳溶剂。由于Cannabis sativa淀粉颗粒非常小，我们无法通过OM观察到任何形态变化。然而，SEM图像显示，在所有测试的溶剂中，除了乙醇（EtOH）外，Castanea sativa淀粉颗粒都发生了变化（见图S28–S31）。特别是丙酮和异丙醇导致淀粉颗粒膨胀，暴露出直链淀粉和支链淀粉环。而在乙腈的情况下，淀粉颗粒似乎被溶解了。因此，乙醇被选为最适合的溶剂，用于表2中描述的植物提取过程，因为它可以防止细菌侵蚀，同时不改变淀粉颗粒的形状和大小。

3.2. 形态表征和大小分布
从表2中列出的植物中提取的淀粉颗粒通过OM和SEM进行了观察（见图2、图3、图4、图5）。两组图像都显示了多种形状的淀粉颗粒，包括球形、多面体和椭圆形颗粒。在某些情况下，还观察到了其他植物残留物（如针状体、淀粉质体）；这将在第3.3节进一步讨论。对于Isatis tinctoria，我们仅包括了根部发现的淀粉颗粒图像，因为叶片中的颗粒太小而无法通过OM进行表征。

3.3. FTIR表征
提取的淀粉通过OM和SEM进行了研究。OM观察到典型的马耳他十字形结构，SEM也显示了各种形状的颗粒。一些植物还含有其他植物残留物（如针状体、淀粉质体）。在Isatis tinctoria的案例中，我们仅包含了根部的淀粉颗粒图像，因为叶片中的颗粒太小而无法通过OM表征。

3.4. 脂肪酸的GC-MS分析
采用GC-MS方法对脂肪酸进行了分析。如SEM所示，除了淀粉外，提取的材料中还存在其他有机植物残留物，如针状体（草酸钙晶体）和植硅体（植物中的硅质凝聚物）。这些残留物在考古样本中也经常被观察到（Crowther，2009年；Shillito，2018年），它们与其他结构较不规则的残留物一起可能存在，需要其他分析技术来识别，从而提供有关过去植物利用的重要信息。为了更深入地了解提取过程中残留的有机物质，对表2中报告的所有提取淀粉进行了FTIR分析，相关光谱见补充信息（SI）。Solanum tuberosum被选为参考材料，因为其提取的淀粉纯度较高。FTIR光谱显示了与直链淀粉和支链淀粉相关的特征吸收峰（见图7）。与Solanum tuberosum相比，其他提取的淀粉在1640厘米-1处出现了强度增加的吸收峰，并在1530厘米-1处出现了新的吸收峰，这些峰可能与蛋白质的酰胺I和酰胺II有关。此外，来自其他植物的淀粉在1745厘米-1处还出现了新的吸收峰，这可能来自大分子（如半纤维素、木质素和果胶）中的未结合酮、酯和酰基。这种情况特别通过形成直链淀粉-脂质复合物（V型复合物）而发生，这种关联对淀粉的许多特性至关重要（Jane等人，1999年；Hoover，2001年）。关键特性如结晶性、糊化行为以及与其他生物分子的相互作用都由这些因素决定（Gallant等人，1997年）。事实上，由于这些脂肪酸的化学和热稳定性以及疏水性，它们与淀粉颗粒结合后能长时间保持在原位（Whelton等人，2021年）。这使它们成为识别原始植物或植物群的宝贵生物标志物，为了解植物来源、加工方法（例如热处理）及其保存状态（即脂肪酸的完整性）提供了重要线索（Dudd等人，1998年；Evershed，2008年；García-Granero等人，2022年；Ordo?ez-Araque等人，2024年）。尽管用于分析脂肪酸的分析技术（例如GC-MS）只需要非常少量的样本，但在考古学背景下获得这样的样本量往往很有限。这一挑战因缺乏对非商业用途植物来源的淀粉中脂肪酸的数量和组成的系统研究而进一步加剧。通过创建一个包含多种非商业植物淀粉中脂肪酸类型和数量的参考集合，可以显著推进我们对考古学背景下植物生物标志物的理解。为了识别能够将淀粉与其植物来源联系起来的脂肪酸谱型，我们通过GC-MS检测到了淀粉颗粒上饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的存在。图8显示了从本研究选定的植物中提取的淀粉中鉴定出的主要脂肪酸的丰度（以μg/mg表示）。总体数据见表S2，GC-MS总离子色谱图（TICs）的示例见图S32。在几乎所有样本中，都检测到了饱和长链单 fatty acid（主要是肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸）、饱和二 fatty acid（主要是阿泽酸和芥酸）以及不饱和单 fatty acid（棕榈油酸、油酸、亚油酸和亚麻酸）。

尽管用于分析脂肪酸的分析技术（例如GC-MS）只需要极少的样本量，但在考古学环境中获取这类样本的数量往往受到限制。这一挑战还因缺乏对非商业用途植物来源的淀粉中脂肪酸的数量和组成的系统研究而加剧。通过创建一个包含多种非商业植物淀粉中脂肪酸类型和数量的参考集合，可以显著推进我们对考古学背景下植物生物标志物的理解。为了识别能够将淀粉与其植物来源联系起来的脂肪酸谱型，我们使用GC-MS检测到了淀粉颗粒上饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的存在。图8显示了从所选植物中提取的淀粉中鉴定出的主要脂肪酸的丰度（以μg/mg表示）。总体数据见表S2，GC-MS总离子色谱图（TICs）的示例见图S32。在几乎所有样本中，都检测到了饱和长链单 fatty acid（主要是肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸）、饱和二 fatty acid（主要是阿泽酸和芥酸）以及不饱和单 fatty acid（棕榈油酸、油酸、亚油酸和亚麻酸）。

GC-MS数据（图8）显示，在不同植物物种的淀粉中脂肪酸含量存在显著差异。特别是Cannabis sativa、Heracleum sibiricum、Paeonia officinalis、Pisum sativum、Erythronium dens-canis和Sagittaria sagittifolia表现出最高的脂肪酸浓度（均>100 μg/mg，按丰度递减顺序排列）。相反，Cyperus rotundus、Rumex acetosa、Triticum dicoccum、Sorghum halepense和Carex humilis含有最低的脂肪酸量（均<5 μg/mg，也按丰度递减顺序排列）。饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸因物种和加工方法的不同而有所差异。总体而言，在分析的淀粉中检测到最丰富的脂肪酸是棕榈酸、油酸和亚油酸。文献中也报告了类似发现，关于谷物中常见的脂肪酸（Morrison，1988年；Pastor等人，2020年；Mansouri等人，2021年）。次要成分通常包括硬脂酸、肉豆蔻酸和亚麻酸。这些谱型反映了遗传和环境对脂质组成的影响（Schmid和Ohlrogge，2008年）。油酸也在大多数样本中被检测到，但在Oxalis acetosella、Solanum tuberosum和Zea mays中未检测到，或在Cyclamen sp.、Isatis tinctoria、Convallaria majalis和Heracleum sibiricum中仅以低含量存在（<0.1 μg/mg）。在分析的淀粉中，Cannabis sativa的脂肪酸总浓度最高，其中油酸和棕榈酸占主导地位。同样，Linum usitatissimum的淀粉中也显示出较高的油酸含量。其他物种，包括Erythronium dens-canis、Heracleum sibiricum、Paeonia officinalis、Pisum sativum和Sagittaria sagittifolia，其淀粉中的棕榈酸和亚油酸含量也较高。此外，值得注意的是，一组脂肪酸，包括月桂酸、阿泽酸、芥酸、棕榈油酸和亚麻酸，在某些物种的淀粉中不存在或仅以微量存在（<0.1 μg/mg），如Avena sativa、Cannabis sativa、Castanea sativa、Linum usitatissimum、Carex humilis、Echinocloa crus-galli、Oxalis acetosella、Solanum tuberosum和Triticum dicoccum。本研究分析了Isatis tinctoria两种不同器官（叶子和根部）的淀粉样本。值得注意的是，从这两个植物部分获得的脂肪酸谱型高度相似，证明了所用分析方法的可重复性和可靠性，这与之前关于植物脂质组学的研究一致（Schmid和Ohlrogge，2008年；Shuman等人，2010年；Hill和Roessner，2013年）。一致地，根部和叶子提取物的GC–MS总离子色谱图（图9a，b）显示了相同的主峰，在相似的保留时间（例如峰1-3和6以及内标），证实了器官间的质谱谱型有很高的保守性。值得注意的是，叶子的TIC显示出额外的不饱和脂肪酸甲酯信号（峰4-5），并且棕榈酸衍生物信号的相对强度（峰2）比根部的TIC更高。这些发现表明，来自同一物种不同器官的淀粉可能具有相似的脂肪酸组成，但棕榈酸的浓度在叶子来源的淀粉中略高。这种器官特异性的棕榈酸含量差异与之前关于植物组织中脂质分布差异的报告一致（Lytovchenko等人，2009年；Napier等人，2014年），反映了叶子与根部在淀粉生物合成和储存方面的不同生理作用或代谢活动。

通过对Isatis tinctoria两个不同器官（叶子和根部）的淀粉样本进行分析，发现这两个植物部分的脂肪酸谱型具有高度相似性，证明了所使用分析方法的可重复性和可靠性。除了之前讨论的趋势外，红色矩形内的样本以高浓度的亚油酸（>55 μg/mg）和棕榈酸（>50 μg/mg）为特征。相反，黑色矩形内的样本通常表现出低水平的亚油酸（<20 μg/mg）和棕榈酸（<8 μg/mg），其中Cannabis sativa是一个显著的例外。此外，紫色矩形标出了两个油酸浓度异常高的样本。尽管层次聚类没有揭示出如按脂肪酸类型和浓度对植物家族进行分组这样的显著模式，但GC–MS结果仍可与其他用于考古学中植物鉴定的技术（例如光学显微镜（OM）、扫描电子显微镜（SEM）和飞行时间差示质谱（FTIR）提供补充信息（Longo等人，2021年）。尽管亚油酸和亚麻酸是现代植物脂质和参考淀粉的常见成分，但由于它们容易氧化降解，在考古学样本中直接保存的情况很少见（Whelton等人，2021年）。因此，通过GC–MS获得的脂肪酸谱型不应被解释为现代参考材料的直接等同物，而应从降解途径和由不饱和前体衍生的更稳定氧化产物的角度来理解。阿泽酸和芥酸的鉴定与植物来源脂质中原本存在的不饱和脂肪酸的氧化降解一致。这些化合物通常被报告为降解脂质混合物中的主要二元羧酸，而苏铁酸——虽然理论上预期会共存——但在考古样本中通常仅以微量存在，可能低于检测限。实验和遗产科学研究表明，这种二元羧酸的分布反映了影响多不饱和脂肪酸（特别是亚油酸和亚麻酸）的复杂氧化过程（例如Izzo等人，2014年；Fuster-López等人，2019年）。在我们的案例中，由于材料量极少且该技术的破坏性，对考古样本使用GC-MS是不可行的。相反，使用了GC–MS参考数据来支持将特定FTIR信号鉴定为脂肪酸。

对通过超声处理从Br?nzeni I的GSTs BZ442和BZ833霉菌中获得的考古淀粉进行了分析（Longo等人，2021年，2022年；Birarda等人，2023年），使用了光学显微镜（OM）、扫描电子显微镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）（图11，图12）。OM和SEM提供了互补的信息：OM通过马耳他十字形结构确认了淀粉的存在，而这两种技术都允许详细观察颗粒形态、保存情况以及潜在的机械或热变化。FTIR进一步通过特征性的直链淀粉和支链淀粉吸收带加强了淀粉的鉴定，尤其是在马耳他十字形结构被沉积物遮挡或颗粒降解时。它还可以检测到表明成岩作用的过程的功能基团，从而确认淀粉的古老来源。在分析的样本中，OM清楚地显示了具有受损马耳他十字形结构的淀粉颗粒（图11A和B以及D-E）。此外，在BZ442样本的颗粒中观察到了明显的裂纹（图11A和B），而BZ833的淀粉颗粒则表现出中央凹陷，这一特征通常与受热暴露有关（图11D和E）。扫描电子显微镜获取的显微照片显示了两种不同的淀粉颗粒；其中一个表面似乎附有土壤（图11C），而另一个表面出现剥落，可能是由于层状结构断裂（图11F）。使用同步辐射进行FTIR分析至关重要，因为它允许对单个淀粉颗粒进行观察（Birarda等人，2023年）。传统的FTIR需要大量样本，而这对于这种年代的考古材料通常是不可用的，并且它不允许对单个颗粒进行测量，而这在样本可能含有来自不同植物来源的淀粉时是必要的。随后，对现代和考古光谱进行了比较分析，以确定在现代淀粉中观察到的特征是否可以指示这些古代淀粉的植物来源或器官。关于BZ442_#1和BZ833_#1这两种谷物，与其它考古样本相比，它们的光谱特征保存得更好，峰值清晰明确。相反，BZ442_#2和BZ442_#4的光谱在1020 cm?1处显示出宽而模糊的带状结构，在2800-3000 cm?1范围内CH2的信号较弱，在约3300 cm?1处有一个宽而弱的OH伸缩带。这表明淀粉结构较为混乱，可能存在少量有机化合物/污染物（可能来自其他植物物质），或者经历了严重的降解和脱水。最后，尽管BZ833_#1的淀粉保存状况良好，但在1430 cm?1处仍有一个宽带，在1780和2511 cm?1处有两个较小的信号，这些信号可能与碳酸盐有关，可能涉及到淀粉的部分矿化作用（Birarda等人，2023年）。在保存较好的BZ833_#1颗粒中，1733 cm?1处有一个非常弱的峰，这可能是由于其中含有少量脂肪酸（FAs），这些脂肪酸有助于淀粉颗粒的长期保存。

根据分析结果，所有被研究的颗粒都被确认为淀粉颗粒。然而，有些样本由于光学特征受损严重，无法被归类到具体的植物种类中。值得注意的是，这些损伤可能为我们提供了关于这些植物在过去是如何被处理或加工的重要信息。使用扫描电子显微镜（SEM）观察到的淀粉颗粒由于其更加完整的结构而更容易被识别。通过与我们的参考样本进行比较，并结合现代参考材料的粒度分析数据，我们可以推断出一个颗粒（图11C）可能属于禾本科（Poaceae）中的Triticeae族，而另一个颗粒（图11F）则与Sorghum halepense产生的淀粉相似。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析确认这些样本显示典型的直链淀粉（amylose）和支链淀粉（amylopectin）特征，以及可能的脂肪酸（1730 cm?1处的信号）和蛋白质（1640-1530 cm?1区域的酰胺类化合物）的存在。在此框架下，虽然没有对考古样本使用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）来分析其成分，因为该技术具有破坏性，且可用的考古材料数量极其有限。尽管GC-MS只需要非常少量的样本，但由于这些原因，我们主要使用其结果来辅助解读FTIR光谱，而不是直接分析考古样本本身。但这并不削弱GC-MS在考古研究中的价值；相反，当应用于合适的替代材料时，它可以提供非常有价值的信息。当条件允许时，GC-MS仍然是表征有机残留物的强大工具。

我们的研究强调了采用多技术分析方法的必要性，因为没有一种单一方法能够始终提供信心满满地识别淀粉所需的所有信息并有助于考古解释。然而，这种方法也带来了固有的挑战：通常很难使用多种技术分析同一区域或甚至是同一个淀粉颗粒。此外，有时在不失去稀有且不可替代的考古材料的情况下应用破坏性方法也是不可能的。因此，强烈建议采用依赖替代材料并优先使用非破坏性技术的分析策略，因为这样可以最大限度地利用珍贵的考古样本所提供的信息。此外，未来的方法学进步如果能够使样本在相同区域被标记并重复分析，将显著提高多技术分析方法的可靠性和可比性。

淀粉分析具有很高的信息价值，因为它能够在考古环境中（如石器和陶瓷制品、牙结石、粪便化石）保存数千年。淀粉颗粒为我们提供了关于过去人类活动、易腐材料的使用情况、依赖植物资源的生存方式以及与环境互动的独特见解，包括特定植物种类的使用情况。尽管有这样的潜力，淀粉颗粒在考古学中的应用仍受到一些重要挑战的制约，例如随着时间的推移淀粉颗粒的保存状态会改变其形态，以及提取和鉴定技术中的固有偏差。此外，目前缺乏全面的参考样本集，特别是对于那些在旧石器时代可能很重要但今天在经济上不重要、因此难以获取的野生或非驯化植物。本研究解决了其中两个问题：首先，它提供了一个包含23种淀粉的新多技术参考集，这些淀粉来自可能在MIS 3时期存在的植物以及3种非欧亚地区的植物种类。虽然这个集合还不全面（尽管正在努力扩展），但这 merupakan识别不同植物家族和器官类型的重要第一步，使研究人员能够更自信地区分古代淀粉与潜在的现代污染物。其次，这里采用的方法超越了传统的基于形态的鉴定方法。虽然形状和大小仍然是有价值的诊断特征，但在考古样本中这些特征经常因成岩过程（如酶的作用）或人为活动（如机械加工或加热）而受损。通过整合化学分析技术，这项研究表明即使淀粉颗粒发生了变化，化学组成仍可作为确认其存在的补充依据。此外，这些技术还能帮助识别嵌入在复杂基质（如土壤）中的淀粉颗粒，并且也可以成功应用于牙结石或粪便化石等难以提取微观分析元素的样本。实际上，将FTIR分析结果与现代淀粉参考集进行对比对于确认观察特征的淀粉性质至关重要。光谱分析还揭示了与年龄相关降解、矿化或加工效应相关的特定信号，这一点也可以通过显微镜观察得到验证。尽管GC-MS可以通过脂肪酸谱分析提供关于淀粉结构和组成的重要信息，尤其是对于非商业植物来源，但其应用于考古植物标本时存在相当大的方法学挑战。在考古环境中常见的淀粉量较少，可能使得GC-MS分析在操作上不可行。然而，在大约1740 cm?1处的红外吸收带的光谱检测提供了一种非特异性指标，表明可能存在酯化的脂肪酸。

本研究还指出了当前分析程序的一些局限性。最明显的问题是无法在同一淀粉颗粒上进行所有上述分析。将样本从一种仪器转移到另一种仪器可能会导致参考坐标的丢失，从而降低识别目标区域的概率。此外，不同的样本观察方法（如湿法与干法、是否使用盖玻片、样本沉积的支持方式等）也为分析流程增添了额外难度。总体而言，这种多技术分析方法提供了更稳健的分析框架，即使在淀粉颗粒保存状况不佳或发生改变的情况下也能提高识别的可靠性，并有助于区分古代和现代未受污染的物质。

**数据可用性声明**
本研究的所有原始数据均可在补充信息中找到。

**资金支持**
本项工作得到了新加坡国立大学（NTU）的SUG项目M4081669.090（LL资助）、UniCampania提供的访问教授职位（2018年，由C. Lubritto主持）的支持。部分研究资金来自ANR项目Starch4Sapiens（AAPG2020 CE03-0002），该项目由法国马赛CNRS-AMU的SC协调（SC、AC、LL、CC、EB参与）。此外，意大利大学和研究部（MUR）的PRIN-2022 2022XX8BRT项目“用于分子考古学的可逆吸水智能材料以揭示旧石器时代石器作为生物档案-SMarT4BioArCH”也提供了资金支持，该项目由欧盟下一代计划（Next Generation EU）第四任务和CUP Master & CUP B53DZ3014020006资助（EB、GS参与）。

**作者贡献声明**
C. Cagnato：数据管理、调查、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。
G. Sorrentino：数据管理、调查、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。
A. Bonetto：数据分析、资源获取、写作、审稿与编辑。
F.C. Izzo：数据分析、资源获取、写作、审稿与编辑。
A. Brunelli：数据管理、数据分析、资源获取、写作、审稿与编辑。
G. Birarda：数据分析、资源获取、可视化、写作、审稿与编辑。
L. Vaccari：调查、资源获取、写作、审稿与编辑。
S. Condemi：资金获取、项目管理、监督、写作、审稿与编辑。
A. Carbone：项目管理、资源获取、写作、审稿与编辑。
A. Marcomini：资源获取、监督、写作、审稿与编辑。
L. Longo：概念化、资金获取、调查、方法论设计、资源获取、写作、初稿撰写、审稿与编辑。
E. Badetti：概念化、数据管理、数据分析、资金获取、调查、方法论设计、项目管理、资源获取、监督、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。