开发了一种离子配对试剂辅助的LC–MS/MS方法，该方法利用阶梯式碰撞能量进行碎片化分析，用于含3-脱氧-D-甘露-o-辛酮糖酸的单磷酸脂A及其衍生物

《Journal of Chromatography A》：Development of an Ion-pairing Reagent-assisted LC–MS/MS Method Employing Fragmentation with Stepped Collision Energy for monophosphoryl Lipid A containing 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid and its Derivatives

　　洪智英|尹智勋|金贤贞|吴汉斌|钟赫淑|金基勋
韩国科学技术院兴奋剂控制中心，首尔，大韩民国

**摘要**
随着人们对基于脂多糖（LPS）的疫苗佐剂兴趣的持续增长，阐明3-脱氧-D-甘露辛酮糖酸（Kdo）2-脂质A的结构变得至关重要。Kdo是LPS的关键成分，它维持着细菌外膜的完整性并确保细菌的存活。此外，LPS通过激活人类细胞中的Toll样受体4和caspase-4发挥免疫刺激作用。虽然Kdo2-脂质A具有内毒素的特性，但其衍生物Kdo2-单磷酸脂质A（Kdo2-MPLA）的毒性较低，并被探索作为治疗剂，包括疫苗佐剂的应用。它们酰基链和磷酸基团的结构变化决定了它们的生物活性和安全性，这突显了进行准确分子表征的必要性。然而，由于其固有的异质性和两亲性结构（由磷酸基团、脂质链和Kdo2糖基团组成），在反相液相色谱分析中存在显著挑战。本文开发了一种使用三乙胺作为离子配对试剂的液相色谱-质谱方法，成功分离并检测了从大肠杆菌中提取的复杂Kdo2-MPLA混合物。此外，通过使用阶梯式碰撞能量，获得了具有更广泛碎片覆盖范围的质谱图，提供了关于Kdo2糖以及O-酰基链的具体位置和长度的详细结构信息。通过引入离子配对试剂，我们建立了一种具有高选择性和灵敏度的可靠LC-MS/MS方法来分析Kdo2-脂质A。这种方法为工程化Kdo2-脂质A物种提供了详细的结构信息，有助于阐明其生物合成变异，并为设计下一代基于LPS的疫苗佐剂奠定基础。

**1. 引言**
在全球COVID-19大流行期间，脂质研究成为关键领域，因为脂质被认为是疫苗开发中的重要成分，既可作为强效的免疫佐剂，也可作为高效传递mRNA的基本载体[1,2]。佐剂是现代疫苗设计中的关键组成部分，因为它们能增强和调节对抗原的免疫反应[3,4]。特别是基于细菌脂多糖（LPS）的免疫刺激剂由于其衍生物的效力和较低的毒性，成为下一代疫苗开发中的有希望的佐剂候选者[1,2,3,4]。LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，它作为一种选择性通透性屏障，阻止胆盐和某些抗生素等疏水性物质的进入[5,6,7]。LPS由三个共价连接的亚结构组成：脂质A、内部寡糖和外层多糖（O-抗原）[8]。其精确的化学结构至关重要，因为结构变化会显著影响其生物活性以及细菌在不同环境条件下的存活能力[9,10]。例如，含有六酰基化脂质A部分的LPS能被先天免疫受体复合物Toll样受体4/MD2-CD14（TLR4/MD2–CD14）选择性识别，从而产生高免疫原性[11]。此外，结构中的磷酸基团在调节LPS与TLR4–MD2复合物之间的静电相互作用中起关键作用[11]。已知脂质A在C1位置的去磷酸化可以降低其毒性，单磷酸脂质A（MPLA）已被开发为疫苗佐剂[12]。因此，许多研究集中在通过改变酰基化模式或去除和共价修饰磷酸基团来修饰脂质A，以开发LPS衍生的佐剂[13]。然而，LPS的高毒性和其复杂的异质性给分析带来了挑战。

在LPS的三个亚结构中，脂质A（含有两个C1和C4′位置的磷酸基团以及六个酰基链的葡糖胺二糖）作为疏水锚定基团，将LPS嵌入膜中并负责其内毒素效应[14,15]。脂质A通过经典的Raetz途径合成，该途径涉及几乎所有革兰氏阴性菌中保守的九个酶促反应[16]。合成中的关键步骤是将Kdo（3-脱氧-D-甘露辛酮糖酸）残基添加到脂质IVA上，这对确定Kdo2-脂质A中的酰基链数量至关重要。LpxL和LpxM酶（称为“晚期”酰基转移酶）具有显著的氨基酸序列相似性，并且依赖于Kdo2-脂质IVA中Kdo残基的存在才能正常发挥作用[13]。Kdo2-脂质A是最小的LPS结构，能够在没有抑制突变的情况下维持细菌的存活，并通过各种非定量修饰获得异质性[8]。Kdo2-脂质A的结构分析非常重要，因为它作为一种几乎均匀的LPS亚单位具有与LPS相当的内毒素活性，同时其结构多样性使细菌能够适应并逃避免疫系统[17]。此外，由于Kdo2-脂质A的毒性较低且体积较小，它比完整的LPS分子更适合用于治疗研究[18,19]。在大肠杆菌（E. coli）中，Kdo2-脂质A的修饰可以调节免疫反应并赋予细菌对感染的非特异性抵抗力[18,19]。即使是微小的酰基化和磷酸化变化也会显著改变其生物活性。虽然Kdo2-脂质A具有内毒素的特性，但Kdo2-MPLA由于其较低的毒性而成为治疗开发的潜在目标[20,21,22]。因此，通过多种修饰方法开发具有最佳生物特性的Kdo2-脂质A衍生物不仅有助于理解天然LPS的功能，也有助于合理设计解毒的基于脂质A的佐剂（如MPLA）。

尽管脂质A的两亲性和结构复杂性给分析带来了挑战，但早期研究通常使用1H NMR或13C NMR来分析脂质A物种的结构[23,24]。近年来，脂质A分析取得了显著进展，串联质谱（MS/MS）已成为结构表征的主要工具。诸如基质辅助激光解吸/电离质谱[15]、电喷雾电离质谱（ESI–MS）[16,25,26,27]和液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）[29,30,31]等分析技术能够分离多种脂质A物种，并提供关于酰基链组成和磷酸化水平的详细信息。除了这些技术外，毛细管电泳-质谱（CE-MS/MS）[32,33]和超临界流体色谱-质谱（SFC-MS/MS）[34]等先进技术也已成为脂质A分析的补充工具。然而，由于Kdo2-脂质A的分子异质性和复杂的双亲性（来自连接的Kdo2糖残基），其综合分析方法仍然有限。特别是，磷酸基团可以通过配位键与柱表面的金属离子相互作用，导致色谱分析过程中出现二次相互作用，从而引起洗脱不良和峰尾效应[35,36,37]。为了抵消这些不利影响，最近的研究采用了无金属柱和碱性流动相，以减少金属-分析物之间的相互作用[35,38]。此外，只有少数研究成功将液相色谱（LC）与质谱结合用于Kdo2-脂质A物种的分析[16,39]。先前报道的LC–MS方法通常依赖于氯仿，但这种溶剂与常规反相LC-MS的兼容性较差，且可能对环境造成影响[16,39,40]。因此，开发能够最小化柱子降解同时最大化检测灵敏度的LC–MS方法对于推进Kdo2-脂质A及其衍生物的分析至关重要。

本文开发并优化了一种LC–MS方法，用于分析Kdo2-脂质A及其相关衍生物，通过使用离子配对试剂三乙胺（TEA）来克服其两亲性和磷酸基团带来的挑战。TEA是一种挥发性的离子配对试剂，可以增强阴离子分析物的保留能力，并与电喷雾电离（ESI）兼容[41]。提出的机制表明，TEA通过与Kdo2-脂质A物种的磷酸基团形成中性离子对，从而调节其整体疏水性，并在非极性柱子上提供足够的保留力，同时防止柱内的金属螯合。此外，我们采用了一种改进的MS/MS方法来提高负离子质谱中的碎片覆盖范围。通常，较低的碰撞能量（CE）提供完整结构的m/z信息，而较高的CE则产生丰富的碎片，有助于结构解析[42,43]。我们采用了平行反应监测（PRM）MS/MS策略和阶梯式CE设置，能够同时检测在多个CE下产生的重叠碎片模式，从而提高结构分辨率。通过扩展的碎片覆盖范围，成功鉴定了Kdo2-脂质A物种及其衍生物的解离途径。此外，还表征了Kdo2-脂质A物种的各种加合物形式，以深入了解其碎片行为。通过将LC分离与MS/MS分析相结合，这种方法为工程化Kdo2-MPLA物种提供了可靠的鉴定工具，有助于阐明生物合成变异，并为设计下一代基于LPS的疫苗佐剂奠定基础。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学品
本研究使用的所有菌株、质粒和引物均总结在支持信息中（表S1和S2）。Kdo2-脂质A标准品购自Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴斯特，AL）。水使用Milli-Q系统（Millipore，美国贝德福德，MA）纯化。LC级甲醇和异丙醇购自J.T. Baker（美国菲利普斯堡，NJ）。TEA、醋酸和氯仿为试剂级，购自Sigma（美国圣路易斯，MO）。
2.2. 菌株构建和生长条件
为了获得具有不同数量或长度酰基链的Kdo2-脂质A衍生物，从大肠杆菌染色体中删除了参与Kdo2-脂质A生物合成的五个基因（lpxL、lpxM、lpxP、pagP和waaC）。如前所述，使用BKT08菌株（ΔlpxP、ΔlpxM和ΔpagP）作为受体，通过scarless lpxL(Cat-SacB)缺失突变的转导，生成KHSC0090（ΔlpxP、ΔlpxM、ΔpagP和ΔlpxL）[44]。随后，使用WBB06中的waaF–waaC::tet盒通过P1vir转导使KHSC0090中的waaF和waaC基因失活[45]。所得菌株KHSC0091（ΔlpxP、ΔlpxM、ΔpagP、ΔlpxL和waaF–waaC::tet）产生的主要LPS物种为Kdo2-脂质IVA。

为了实现组成性蛋白质表达，如前所述，将pWSK29载体中的Ptac启动子替换为PL启动子（pLpro-pWSK29）[46]。通过聚合酶链反应扩增大肠杆菌中的lpxL或lpxM基因，并分别使用XbaI/BamHI或BamHI/HindIII限制酶切位点将其克隆到pLpro-pWSK29中。然后将这些质粒（pLpro-pWSK29-lpxLEC、pLpro-pWSK29-lpxMEC或pLpro-pWSK29-lpxLEC lpxMEC）与pBAD30-lpxEAA共表达在KHSC0091菌株中[46,47]。结果，这些工程菌株产生的主要LPS物种为Kdo2-MPLA衍生物。所有大肠杆菌菌株在添加了100 μg/mL氨苄西林和30 μg/mL氯霉素的Lysogeny培养基中于30°C下培养24小时，摇床转速为180 rpm。培养过夜后，通过2900 rpm和4°C离心收集细胞。如前所述，使用Bligh-Dyer方法提取Kdo2-MPLA物种[47]。简要来说，将大肠杆菌细胞沉淀重悬在5 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，加入氯仿和甲醇，使氯仿:甲醇:PBS的比例为1:2:0.8（v/v/v），形成单相系统。充分混合后，以700 × g离心15分钟。将上清液转移到玻璃管中，并通过添加氯仿和PBS调整溶剂比例为2:2:1.8（v/v/v），再次以700 × g离心15分钟，形成清晰的双相系统。从下层有机相中回收脂质，在N2流下干燥，并储存在-20°C。

2.3. 脂质的LC-MS分析
将提取的脂质溶解在4:1（v/v）氯仿:甲醇溶液中，然后用甲醇稀释五倍，用于LC–MS分析。Kdo2-脂质A的标准品溶液（1 mg/mL）制备在LC级4:1（v/v）氯仿:甲醇溶液中，并储存在-20°C直至使用。然后将标准品溶液用甲醇稀释至最终浓度1 μg/mL，用于进一步分析。使用岛津Prominence UFLC系列LC系统（岛津，日本京都）和Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪（Thermo Scientific，美国圣何塞）进行脂质分析。色谱分离在YMC-Triart C18柱（2.1 mm × 100 mm，3 μm；YMC Europe，德国丁斯拉肯）上进行。梯度洗脱使用二元溶剂系统：流动相A由95:5（v/v）甲醇/水和0.2%（v/v）TEA及0.07%（v/v）醋酸组成；流动相B由异丙醇和0.2%（v/v）TEA及0.07%（v/v）醋酸组成。制备的流动相pH值为9.5。此外，选择了水、甲醇和异丙醇作为溶剂，以覆盖广泛的溶解度范围，因为它们是极性质子溶剂，并且可以通过氢键与磷酸化脂质物种相互作用。柱温保持在40°C，流速为0.4 mL/min，样品的注入量为5 μL。13分钟的梯度从2%的流动相B开始保持0.5分钟，然后在7.5分钟内线性增加到60%的流动相B。在8分钟时，流动相B的百分比在1分钟内增加到98%，保持2分钟，然后在2%的B下重新平衡2分钟。对于质谱（MS），通过负离子模式下的加热电喷雾离子化分析通过LC分离的脂质物种，毛细管温度保持在269°C。在m/z范围850–2,500内获得了纯化脂质混合物的高分辨率全扫描光谱，分辨率为17,500。在MS/MS采集过程中，使用了PRM模式，其Δm/z=0.4的狭窄隔离窗口，覆盖预测的Kdo2-MPLA物种的m/z范围。包含列表是根据工程化Kdo2-MPLA物种的预期结构生成的，以指导MS/MS扫描，从而能够系统地采集所有预期的结构。此外，使用狭窄的隔离窗口减少了光谱复杂性，得到了更简单的MS/MS光谱。MS/MS光谱的分辨率为17,500，循环次数设置为20。自动增益控制目标和最大注入时间分别设置为1×10^6和自动。应用了20、40和60 eV的阶梯式碰撞能量，以促进累积碎片模式。所有数据均使用Xcalibur?软件收集，数据分析使用Qual Browser和Freestyle（Thermo Scientific，美国圣何塞）进行。

尽管TEA作为离子配对试剂非常有效，但由于其在MS系统中的记忆效应，其在LC-MS中的使用受到限制。为了解决TEA污染和离子抑制问题，采用了之前报道的使用水、异丙醇和醋酸混合溶剂的清洁程序来清洁离子源和LC系统[48]。该程序有效地减少了TEA污染，没有干扰后续分析。

3. 结果与讨论
3.1. Kdo2-脂质A物种分析的LC方法的开发与优化
为了识别来自大肠杆菌的两亲性Kdo2-脂质A物种的色谱行为，使用Kdo2-脂质A标准品评估了不同的色谱柱和流动相组合。测试了甲酸铵、碳酸氢铵和醋酸铵作为流动相添加剂；然而，它们并没有改善Kdo2-脂质A的保留时间、选择性和灵敏度。通过将TEA作为流动相修饰剂应用于YMC C18-triart柱，成功检测到了Kdo2-脂质A的峰。选择这种柱子是因为它在碱性条件下的稳定性，这是含有TEA的流动相条件所必需的[29]。为了了解TEA的影响，在三种不同的pH条件和四种TEA浓度下检查了Kdo2-脂质A标准品的保留行为。灵敏度有显著的pH依赖性变化：在pH 4时信号强度急剧下降，而在pH 9时观察到大约两倍的增加（图1A）。在pH <9时，由于与固定相上的质子化金属氧化物位点的相互作用，磷酸基团的非特异性吸附增加[49]。磷酸基团的pKa1范围从<1到6[50]。然而，Kdo糖中的羧酸可以通过场效应显著提高磷酸基团的pKa[51]。因此，高碱性pH条件确保Kdo2-脂质A主要保持其阴离子形式，从而便于与TEA形成离子对。此外，在高pH条件下，固定相上的硅醇基团的脱质子可以改变柱子上离子对层的组织，从而增强分析物的保留[52]。除了pH之外，TEA浓度也可能通过其离子配对活性影响灵敏度。为了测试高TEA浓度是否促进离子对的形成，准备了含有0.02%（v/v）、0.1%（v/v）、0.2%（v/v）和0.3%（v/v）TEA的四种流动相，pH为7。正如预期的那样，离子配对效率取决于TEA浓度，在0.2%（v/v）TEA时观察到最高的检测灵敏度，超过这个浓度后灵敏度下降（图1B）。在0.02%（v/v）TEA的浓度下，没有观察到明显的峰，而随着TEA浓度的增加，出现了清晰的峰并且分离得到了改善。总体而言，这些结果表明Kdo2-脂质A的检测主要受pH和TEA浓度控制。基于这些发现，最终确定了基本的流动相条件：流动相A由95:5（v/v）甲醇/水组成，含有0.2%（v/v）TEA和0.07%（v/v）醋酸（pH 9.6），而流动相B由异丙醇组成，含有0.2%（v/v）TEA和0.07%（v/v）醋酸。使用从2%增加到95%的线性梯度流动相B实现了最佳分离，从而覆盖了流动相A中的广泛脂质物种。

3.2. Kdo2-脂质A物种结构分析的LC-MS/MS方法的优化
为了完全表征分离的化合物，采用了负离子模式下的靶向MS/MS分析。对于质谱分析中的结构阐明和准确化合物鉴定，CE参数的优化至关重要。在CE 20 eV时，m/z 1117.6608的前体离子显示出高强度，表明碎片较少，而更高的CE，如CE 40 eV和60 eV，产生了更多的碎片离子（图2A）。对应于Kdo和Kdo2糖部分的关键离子分别在m/z 219.0508和439.1095出现，主要在CE 20 eV和40 eV时。在CE 20 eV时，m/z 1007.6339、679.4079、783.5010和227.2014的双电荷离子不明显，甚至在CE 60 eV时m/z 1796.2133的单电荷碎片离子也几乎检测不到。碎片不足限制了结构阐明，并可能导致误解。为了解决这个问题，应用了带有阶梯式CE的PRM来收集全面的结构数据。这种方法通过同时捕获低能量和高能量的碎片，克服了单一CE的局限性。在由20、40和60 eV的阶梯式CE生成的单个光谱中观察到了主要碎片，这些碎片提供了特定酰链和环断裂的证据（图2A）。因此，根据之前报道的数据系统地评估和分配了这些碎片，如图2B所示[16,26]。Kdo2-脂质A分子中最酸性的磷酸基团可以进行双重脱质子作用，产生如[M?2H]2?这样的双电荷离子，这是在我们的实验条件下的主要离子物种[42,43]。

除了前体离子外，大多数碎片是通过去除酰链和连接到葡萄糖胺二糖脂质A骨架上的Kdo2糖部分产生的。以下缩写用于表示质谱解释的化学组成：C12:0（十二烷酸），C14:0（十四烷酸），C14:0(3-OH)（3-羟基十四烷酸），C13:0(3-OH)（3-羟基十三烷酸）。酰链的碎片被标记为酸形式或酮烯形式。众所周知，磷酸基团上的负电荷促进了O-酰链的位点特异性断裂[42,44]。m/z 227.2014的碎片确认了C3′位置存在C14:0二级酰链（图2B中的断裂③）。m/z 1007.6339的双电荷离子表明失去了一个Kdo残基（Δm/z 110.03，图2B中的断裂①）。此外，对应于Kdo和Kdo2糖部分的产物离子分别以m/z 219.0508和439.1095的单电荷离子出现（图2B中的断裂①和②），证实了脂质A结构中存在Kdo2糖部分。此外，Kdo2糖部分的丢失产生了m/z 1796.2133的单电荷离子。这些离子的高丰度表明了Kdo2糖在Kdo2-脂质A结构中的重要性，突显了其在MS/MS分析中的重要性。随后，观察到Kdo2糖的丢失（Δm/z 220.06，图2B中的断裂②）以及C14:0（图2B中的断裂③）或C14:0[3-O-(C14:0)]（图2B中的断裂④）在C3′位置的丢失，分别以m/z 679.4079和783.5010的离子形式出现。这种碎片仅来自这些特定的断裂，因为在其他位置没有观察到特征性的碎片离子损失。这些结果表明，阶梯式CE能够高效且同时地分离Kdo2脂质A结构中的Kdo2糖和酰链，增强了其在LC–MS/MS分析中的碎片覆盖和光谱表征。

3.3. 从大肠杆菌中分离出的Kdo2-单磷酸脂质A物种的LC-MS分析
接下来，将开发的方法应用于通过LC–MS分析从大肠杆菌中分离出的Kdo2-MPLA物种，这些化合物在标准C18柱上得到了有效分离。主要鉴定出了Kdo2-MPLA物种，以及少量的Kdo2-二磷酸脂质A（DPLA），通过准确的质量测量（相对质量偏差< 10 ppm）。所有Kdo2-脂质A分离物的叠加离子色谱图显示在图3中。它们的相对疏水性主要由酰链的总数决定，其次由磷酸基团的数量决定，这与观察到的洗脱顺序相关[53]。因此，这种方法可以区分Kdo2-脂质A物种的C1位置是否被磷酸基团取代。DPLA物种（A）比MPLA物种（B）洗脱得更快，因为它们由于含有两个磷酸基团而具有较低的疏水性（图3）。此外，具有相同磷酸化程度但酰链数量不同的Kdo2-脂质A物种可以根据它们的洗脱顺序进行分离。四酰基化（B）、五酰基化（D和E）和六酰基化（F和H）的单磷酸脂质A物种能够基线分离，酰基化程度较低的物种洗脱得更早（图3）。此外，具有不同一级和二级酰链的五酰基化脂质A物种（C、D和E）也成功分离（图3）。这些分离出的Kdo2-脂质A物种进一步通过MS/MS进行鉴定和完全的结构阐明。特别是，即使是仅在一级酰链长度上有所不同的五酰基化脂质A物种（C和D，表1），也可以使用当前方法区分，这对于NMR或TLC分析来说是具有挑战性的（图3）。色谱分离是分析微量Kdo2-脂质A物种的强大工具，特别是那些由于丰度低而难以通过MS/MS表征的物种。

表1. 来自大肠杆菌的观察到的Kdo2-脂质A物种的结构及其保留时间。这些物种是根据它们的准确质量鉴定的，连接到葡萄糖胺骨架的侧链的分配是根据MS/MS光谱确定的。显示的m/z值分别对应于双脱质子化物种的计算单同位素质量和实验测量值。偏差表示计算值和观察值之间的相对质量差异。
空单元
RT（分钟）
化合物
m/z 计算值
m/z 测量值
偏差（ppm）
酰基属性
C3?
C2?
C3
C2
A
3.06
Kdo2-四磷酸-DPLAa（Kdo2-脂质IVA）
92
1.47
76
92
1.47
84
-0.87
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
B
3.21
Kdo2-四磷酸-MPLA
88
1.49
48
88
1.49
45
0.34
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
C5.30
Kdo2-五磷酸-L-MPLA?a
96
5.57
18
96
5.57
07
1.14
C13:0(3-OH)
C14:0[3-O-(C12:0)]
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
D
5.54
Kdo2-五磷酸-L-MPLA
97
2.57
84
97
2.57
73
1.13
C14:0(3-OH)
C14:0[3-O-(C12:0)]
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
E
6.11
Kdo2-五磷酸-L-MPLA
98
6.59
40
98
6.59
36
0.41
C14:0[3-O-(C14:0)]
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
F
7.30
Kdo2-六磷酸-L-MPLA
106
3.66
19
106
3.66
92
-6.86
C14:0[3-O-(C12:0)]
C14:0[3-O-(C12:0)]
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
G
7.57
Kdo2-六磷酸-L-DPLAa（Kdo2-脂质A）
1117.66
03
1117.65
79
2.15
C14:0[3-O-(C14:0)]
C14:0[3-O-(C12:0)]
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
H
7.73
Kdo2-六磷酸-L-MPLA
107
7.67
75
107
7.68
53
-7.24
C14:0[3-O-(C14:0)]
C14:0[3-O-(C12:0)]
C14:0(3-OH)
C14:0(3-OH)
a
这种化合物在脂质生物合成途径中是未预测到的。
b. 使用以下缩写根据它们的酰链组成对目标Kdo2-脂质A物种进行分类：MPLA，单磷酸脂质A；DPLA，二磷酸脂质A；L，C12:0二级酰基化；M，C14:0二级酰基化；四，四酰基化；五，五酰基化；六，六酰基化。分析是在负离子模式下进行的。3.4. Kdo2-单磷酸脂A及其衍生物的双去质子化离子的碎片模式分析 使用MS/MS对上一节中检测到的成分进行了详细的结构分析，通过阶梯式CE碎片化提供了结构信息。从大肠杆菌的不同菌株中，通过MS/MS实验共鉴定并确认了八种不同的Kdo2-MPLA结构。磷酸基团在C1或C4′位置的负电荷有助于分子的解离[31]。因此，磷酸基团的数量至关重要，因为它们会产生不同的碎片模式。对于所有检测到的Kdo2-脂质A物种，主要碎片化涉及Kdo2糖基团的丢失，产生m/z 219.0501和439.1091的单电荷离子。这些产物离子对于确认结构中存在Kdo2糖基团是必不可少的。具有磷酸基团的Kdo2-脂质A物种主要产生由环碎片化形成的主要产物离子，如先前所述[54]。具体来说，m/z 508.23和690.40的产物离子对应于源内环0,4A2碎片化，对于识别C2′位置的酰基链至关重要[28]。m/z 508.2309的碎片离子表明是一个单酰化结构，C2′位置有C14:0，没有次级酰基链；而m/z 690.3995的碎片离子表示一个双酰化结构，C2′位置有C14:0和C12:0次级酰基链（C14:0[3-O-(C12:0)]（图4A和4B）。此外，还主要观察到了由于C3位置C14:0酰基链丢失（Δm/z 122.10，裂解④）而产生的双电荷产物离子（图4A和4B）。C3′和C3位置的碎片具有相同的m/z，最初使它们的归属变得模糊。然而，通过与Kdo2-hexa-L-MPLA的比较，确认了这种键的断裂，因为在C3′位置存在次级酰基链时，C3位置会丢失C14:0酰基链。此外，如果存在次级C3′连接的酰基链作为游离酸，会产生m/z 1488.0378的单电荷产物离子（图4B）。下载：下载高分辨率图像（677KB）下载：下载全尺寸图像 图4. 来自大肠杆菌的[A] Kdo2-tetra-MPLA（表1中的B）、[B] Kdo2-hexa-L-MPLA（表1中的F）和[C] Kdo2-tetra-DPLA（表1中的A）的[M?2H]2?前体离子的代表性MS/MS光谱，使用20、40和60 eV的阶梯式CE获取。裂解位点由结构上的红色箭头和编号圆圈表示。还研究了四酰化的Kdo2-DPLA物种，与Kdo2-MPLA物种相比，它们表现出不同的碎片模式。如图4C所示，首先丢失一个Kdo糖，随后丢失额外的Kdo糖，产生m/z 811.4494和701.4187的双电荷离子。此外，C3′位置的C14:0酰基链（Δm/z 113.10，图4C中的裂解③）以酮烯的形式被消除，产生m/z 588.3213的双电荷产物离子。磷酸基团的丢失（Δm/z 79.97，图4C中的裂解④）证实了C1位置的磷酸化。总体而言，这些结果表明Kdo2-脂质A结构中C1位置的磷酸基团的存在显著影响了它们的碎片路径，在Kdo2-MPLA和Kdo2-DPLA物种之间产生了共同和不同的模式。3.5. 六酰化Kdo2-单磷酸脂AB的双电荷加合物离子的碎片模式分析 除了双电荷[M?2H]2?物种外，还使用具有两种不同次级链C12:0和C14:0的六酰化Kdo2-MPLA的代表性质谱观察和研究了金属和磷酸加合物的碎片特性（表1中的H；Kdo2-hexa-M-L-MPLA），通过阶梯式CE PRM策略获取，提供了详细的碎片信息。已知TEA通过离子对与磷酸基团的相互作用抑制碱金属加合物的形成[55]。然而，特别是对于Kdo2-脂质A物种，由于与多个极性官能团（如磷酸基团）的静电相互作用，加合物的形成很容易发生[56]。这些加合物显著影响前体离子的后续碎片行为，经常改变观察到的产物离子模式，并使MS/MS分析中的结构解释复杂化。我们对Kdo2-hexa-M-L-MPLA在负离子模式下的ESI-MS/MS分析揭示了五种双电荷离子，分别被鉴定为双电荷加合物[M?2H]2?、单钠加合物[M?3H+Na]2?、二钠加合物[M?4H+2Na]2?、钾加合物[M?3H+K]2?和二氢磷酸加合物[M?H+H2PO4?]2?（图5）。双去质子化的加合物是主要物种，而其他加合物离子的丰度显著较低。下载：下载高分辨率图像（506KB）下载：下载全尺寸图像 图5. 从Kdo2-hexa-M-L-MPLA（表1中的H）的五种不同加合物获得的MS/MS光谱。(A) [M?2H]2?, (B) [M?3H+Na]2?, (C) [M?4H+2Na]2?, (D) [M?3H+K]2?, (E) [M?H+H2PO4?]2?，使用20、40和60 eV的阶梯式CE获取。裂解位点由结构上的红色箭头和编号圆圈表示。接下来，选择这些双电荷离子作为前体，通过阶梯式CE PRM策略获取MS/MS光谱。由于它们不同的化学性质和碰撞活化能，它们表现出不同的碎片路径，为结构阐明提供了特征性特征[57]。值得注意的是，二钠加合物离子不易发生碎片化，导致光谱模式独特，因为加合物形式具有高稳定性（图5C）。Kdo2-脂质A物种的一个共同特点是，除了在单钠加合物碎片化路径中检测到的m/z 439.1093的碎片离子外，所有其他加合物的光谱中通常没有对应于Kdo2糖基团的峰。这表明这些结构中的糖苷键断裂较少。有趣的是，其他加合物的光谱显示了对应于C3′位置酰基链丢失的双电荷碎片离子，但没有Kdo2糖的消除。此外，这些加合物离子的光谱在碎片模式上显示出显著差异。对于钠加合物，由于次级C3′位置的酰基链以酸的形式消除，产生了强烈的单电荷碎片离子（Δm/z 114.11，图5B中的裂解⑤）。出乎意料的是，钾加合物和二氢磷酸加合物产生的MS/MS碎片模式非常相似（图5D和5E）。m/z 227.20和243.20处产生了丰富的单电荷离子，这是由于次级C3′和C3位置的酰基链以酸的形式丢失，产生了双电荷产物离子（m/z 982.55和860.44）（图5D和5E）。总之，通过使用阶梯式CE的PRM策略分析获得的碎片离子分布，阐明了每种Kdo2-脂质A物种。它们的磷酸化状态和位置强烈影响O连接的酰基链的易碎性和环裂解的倾向。Kdo2糖基团在结构中的关键特征是m/z 219.20和439.20的碎片离子，应该对其进行鉴定。无论结构中磷酸基团的数量如何，Kdo2糖基团的单电荷碎片都是识别Kdo2-脂质A物种的诊断标志。尽管缺少Kdo2糖片段的光谱仍有可能是Kdo2-脂质A物种，因为它们也可以以其他加合物形式存在。下一个需要研究的特点是0,4A2环裂解的存在，这通过m/z 508和690等单电荷离子的出现得到证明，表明C1位置没有磷酸基团，即Kdo2-MPLA。另一方面，0,4A2环裂解的缺失证实了一种化合物是Kdo2-DPLA物种。此外，对于Kdo2-MPLA物种，C3位置以游离酸形式丢失酰基链，产生主要的双电荷产物离子。对于Kdo2-DPLA物种，一系列双电荷离子对应于Kdo2糖基团的消除和C3′位置的酰基链的酮烯形式。对于其他类型的加合物，详细的结构分析可能更具挑战性，因为它们产生的碎片较少。然而，确定加合物的类型对于确认原始分子量仍然具有信息价值。4. 结论 在本文中，我们开发并优化了一种反相LC–MS/MS方法用于Kdo2-脂质A及其衍生物。使用含有TEA的流动相的C18柱进行色谱分离，能够识别和表征即使是少量的Kdo2-脂质A物种。我们的LC–MS/MS实验从大肠杆菌中鉴定了八种不同的Kdo2-脂质A衍生物。使用阶梯式CE的PRM，实现了详细的结构阐明，允许观察识别特定酰基链和环裂解的关键特征。磷酸基团的数量是影响Kdo2-MPLA及其多种变体碎片模式的关键因素。碎片倾向是复杂分子中裂解过程多样性的宝贵指标，包括简单的O-酰基链丢失以及更复杂的途径，如跨环裂解，这对结构阐明特别有信息价值。此外，还评估了各种加合物形式的碎片模式，以扩展该方法的适用性。总体而言，这种方法减少了确定酰基链位置的多阶段MSn分析的需求。值得注意的是，所提出的LC–MS/MS方法提供了Kdo2-脂质A物种的详细结构表征，支持其在药物发现和疫苗开发中的潜在应用。数据可用性声明 支持本研究发现的所有数据均包含在手稿及其补充信息中。资金来源 本研究得到了KIST内部资助[2V10481, 2V10660]、韩国女性科学、工程和技术基金会（由科学技术信息通信部（MSIT）在回归研发计划下资助的WISET 2025-638项目）以及韩国国家研究基金会（NRF）（由韩国政府（MSIT）资助的RS-2024-00337114项目）的资助。CRediT作者贡献声明 Hong Jiyeong：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，方法学，正式分析，数据管理。 Yoon Jihyun：方法学，调查，数据管理。 Jin Hyunjung：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原始草稿，数据管理。 Oh Hanbin：监督，项目管理。 Chung Hak Suk：撰写 – 审阅与编辑，项目管理，资金获取，概念化。 Kim Kihun：撰写 – 审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念化。